（渔业资源专业论文）青鳞小沙丁鱼（sardinella+zunasi）种群形态学和遗传学研究.pdf

青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l ! az u n o s i ) 种群形态学和遗传学研究 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 于两要 本文以青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l a z u n a s i ) 为主要研究对象，利用形态学观察、 生物学测定、线粒体d n a 控制区序列分析方法对中、日青鳞小沙丁鱼群体进行 了研究；利用线粒体d n ac y t b 基因和c o i 基因部分序列对4 种小沙丁鱼属鱼类 系统关系进行了初步探讨。本研究为青鳞小沙丁鱼及小沙丁鱼属其他鱼类的种质 资源合理开发利用提供基础理论依据，同时也填补了国内有关青鳞小沙丁鱼种质 资源研究空白，对鱼类多样性保护也具有一定意义。论文主要研究结果如下： 一、测量了中、日青鳞小沙丁鱼群体形态特征的主要性状，运用主成分分析、 多变量解析和单因子方差分析对中、日青鳞小沙丁群体的形态学特征进行了比较 研究。结果表明：中、日青鳞小沙丁鱼在多个形态性状上差异显著，且其分布存 在着一定程度的南北或东西的地理差异。通过计算差异系数，根据m a y r 等提出 的7 5 规则，认为它们的形态差异仍然是种内不同地理种群的差异。 二、研究测定了中国青岛、舟山以及日本爱知、香川四个群体7 7 尾青鳞小沙 丁鱼个体线粒体控制区6 2 6 b p 序列，分析了中、日青鳞小沙丁鱼线粒体d n a 的变 异及系统地理格局。共检测到6 9 种单倍型，爱之群体和香川群体有一个共享单倍 型。单倍型频率表明青岛群体的遗传多样性水平最丰富，而舟山群体的遗传多样 性水平相对较低。分子变异分析( a m o v a ) 得出两两群体间遗传分化指数咫t 值 统计检验都是差异极显著。基于所有样本构建的邻接关系树的拓扑结构显示青鳞 小沙丁鱼群体内存在三个明显的单倍型类群( a 、b 和c ) ，核苷酸不配对分布表 明三个单倍型类群都经历了群体扩张。利用控制区核苷酸序列构建的n j 分子树 中，各群体内的个体均未单独成群，而是互有交叉。 三、运用p c r 技术，对小沙丁鱼属( s a r d i n e l l a ) 4 种鱼类线粒体细胞色素b 基因部分序列( 4 0 2 b p ) 进行测定，并比较分析了种间的序列差异。1 0 尾样品中 共检测到9 种单倍型。同源基因序列分析显示t 、c 、a 、g 碱基的平均含量分 别是：2 8 9 、2 8 2 、2 3 9 、1 9 o ，其中a + t 含量高于g + c 含量，与其他 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e # c z u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 鱼类同源序列碱基特点相似。利用k i m u r a - 2 模型分析得到种间遗传距离在 o 1 6 1 6 4 ) 2 6 5 3 之间，基于c ”b 基因片段序列，构建的n j 树显示青鳞小沙丁鱼 与裘氏小沙丁鱼亲缘关系较近，而短体小沙丁鱼与金色小沙丁鱼亲缘关系较近。 依据分子进化速率推测四种小沙丁鱼发生分歧的时间约为8 0 0 万年到1 3 0 0 万年 前的中新世中、晚期，略早于其他鱼类，表明小沙丁鱼类在进化上处于较低等水 平。 四、利用引物成功扩增了金色小沙丁鱼和青鳞小沙丁鱼线粒体细胞色素氧化 酶i 亚基( c 0 1 ) 基因序列。与g e n b a n k 中另外2 种小沙丁鱼的同源序列比对， 去除部分端部序列后得到5 9 9 b p 同源序列，其中包括4 4 5 个简约信息位点，1 5 4 个变异位点，没有发现碱基的插入缺失。经过测定，碱基t 、c 、a 、g 平均含 量分别为2 8 4 、2 8 7 、2 2 5 和2 0 3 ，其中碱基g 的含量明显较低。所测 定4 种小沙丁鱼5 9 9 b p 核苷酸序列编码的氨基酸完全一致。计算得出4 种小沙丁 鱼遗传距离在o 1 5 8 ) 2 0 5 之间。n j 系统树揭示出黑尾小沙丁鱼和裘氏小沙丁鱼 亲缘关系较近，青鳞小沙丁鱼和金色小沙丁鱼关系较近。 关键词：小沙丁鱼；形态学；控制区序列；c y t b 基因序列；c 0 1 基因序列 h 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 s t u d yo nm o r p h o l o g i c a la n dg e n e t i cc o m p a r i s o no f s a r d i n e l l a z u n a s ip o p u l a t i o n s a b s t r a c t p r i m a r ym o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sw e r em e a s u r e da n dt h ed a t aw e r ea n a l y z e db y p r i n c i p l ec o m p o n e n ta n a l y s i sm e t h o d ，m u l t i v a r i a t ea n a l y s i sm e t h o da n da n o v a t o s t u d yt h em o r p h o l o g i c a lv a r i a t i o n sa m o n gf o u rp o p u l a t i o n so fs a r d i n e l l az u n a s ii n c h i n aa n dj a p a n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：s o m em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sh a d s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sa n dt h e r ew e r eg e o g r a p h i c a ld i f f e r e n c e si nt h ed i s t r i b u t i o n so f sz u n a s i a c c o r d i n gt om a y r s7 5 r u l e ，t h ed i f f e r e n c e sa m o n gt h ef o u rp o p u l a t i o n s o f s z u n a s iw e r es t i l lw i t h i nt h ep o p u l a t i o nl e v e l ，n o ti nt h es u b s p e c i e sl e v e l s i xh u n d r e da n dt w e n t ys i xb a s ep a i r s ( b p ) o ft h ep a r t i a lm i t o c h o n d r i a lc o n t r o l r e g i o nf r o m7 7 z u n a s oc o l l e c t e df r o mc h i n a ( q i n g d a op o p u l a t i o na n dz h o u s h a n p o p u l a t i o n ) a n dj a p a n ( a i c h ip o p u l a t i o na n dk a g a w ap o p u l a t i o n ) w e r es e q u e n c e d t h ep h y l o g e o g r a p h i cc h a r a c t e r i s t i c sa n d g e n e t i cp o p u l a t i o n s t r u c t u r ew e r e i n v e s t i g a t e d s i x t yn i n eh a p l o t y p e sw e r ed e t e r m i n e da n do n l yo n eh a p l o t y p ew a s s h a r e db e t w e e na i c h ip o p u l a t i o na n dk a g a w ap o p u l a t i o n t h eh a p l o t y p ef r e q u e n c i e s s h o w e dt h a tg e n e t i cd i v e r s i t yo fq i n g d a op o p u l a t i o nw a st h eh i g h e s t ，a n dz h o u s h a n p o p u l a t i o nw a sl o w e rt h a no t h e rp o p u l a t i o n s a n a l y s i so fm o l e c u l a rv a r i a n c e ( a m o v a ) i n d i c a t e dt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt w od i f f e r e n tp o p u l a t i o n sw e r ev e r y s i g n i f i c a n t n e i g h b o r - j o i n i n gt r e ef o rc o n t r o lr e g i o nh a p l o t y p e so fs z u n a s is h o w e dt h e r ew e r e t h r e el i n e a g e so fh a p l o t y p e s ( a ，ba n dc ) ，a n dt h em i s m a t c hd i s t r i b u t i o n sr e v e a l e dt h r e e l i n e a g e se x p e r i e n c e ds u d d e np o p u l a t i o ne x p a n s i o n m o l e c u l a rt r e ec o n s t r u c t e db yn j m e t h o ds h o w e dt h ei n d i v i d u a l so ft h ed i f f e r e n tp o p u l a t i o n sc o u l d n tb ec l u s t e r e da s o n e i n d e p e n d e n tg r o u p a n dm i x e dt oe a c ho t h e r t h em i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m ebg e n ef r a g m e n t ( 4 0 2 b p ) o ff o u rs a r d i n e l l a s p e c i e sw e r ea m p l i f i e da n ds e q u e n c e d 埘t lt h em e t h o do fp c r ，a n dt h ed i f f e r e n c e so f s e q u e n c e sw e r ea n a l y z e d n i n eh a p l o t y p e sw e r eo b s e r v e di nt e ns a m p l e s t h ea v e r a g e i i i 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l a 二“，脚f ) 种群形态学和遗传学研究 c o n t e n t so f t 、c 、a 、gw e r e 2 8 9 、2 8 2 、2 3 9 、1 9 o r e s p e c t i v e l ya n dt h e c o n t e n to fa + tw a sh i g h e rt h a nt h a to fg + cw h i c hw a ss i m i l a rt ot h es e q u e n c e so f o t h e rf i s h e s w i t ht h ek i m u r a2 - p a r a r n e t e rm o d e lw eg o tt h eg e n e t i cd i s t a n c e sw a s b e t w e e no 1616a n d0 2 6 5 3 b a s e do ns e q u e n c e so fp a r t i a lc y t o c h r o m ebg e n e ，a p h y l o g e n e f i ct r e ew a sc o n s t r u c t e db yn jm e t h o da n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h e & z u n a s ia n ds j u s s i e u ，s m a d e r e n s i sa n ds a u r i t ah a da r e l a t i v e l yc l o s er e l a t i o n s h i p 。 r e s p e c t i v e l y m o l e c u l a re v o l u t i o nr a t es h o w e dt h ed i v e r g e n c eo ff o u rs a r d i n e l l a s p e c i e so c c u r r e dd u r i n gt h em i d d l ea n dl a t em i o c e n ea b o u t8 0 0a n d1 3 0 0m i l l i o n y e a r sa g o t h er e s u l t ss h o w e dt h ed i v e r g e n c et i m ew a se a r l i e rt h a nm o s tf i s h e s ，a n d s a r d i n e l l as p e c i e sw e r ei nar e l a t i v e l yl o wl e v e lo fe v o l u t i o n m i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m eo x i d a s es u b u n i ti ( c o i ) f r a g m e n t so fs a u r i t aa n d z u n a s iw e r ea m p l i f i e d at o t a ls e q u e n c eo f5 9 9n u c l e o t i d eb a s ep a i rw a so b t a i n e db y a l i g n m e n tw i t hh o m o l o g o u ss e q u e n c e so fa n o t h e rt w os a r d i n e l l as p e c i e si ng e n b a n k t h e r ew e r e4 4 5p a r s i m o n y i n f o r m a t i v es i t e sa n d15 4v a r i a t i o n s i t e s ，b u t n o i n s e r t i o n d e l e t i o n sw e r eo b s e r v e d b ys e q u e n c i n g ，t h ea v e r a g eb a s ec o m p o s i t i o n s w e r e2 8 4 ，2 8 7 ，2 2 5 a n d2 0 3 f o rt ，c ，aa n dg r e s p e c t i v e l y b a s eg c o n t e n tw a sm u c hl o w e rt h a nt h eo t h e r s t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so ff o u rs a r d i n e l l a s p e c i e sw e r et o t a l l yt h eg a m e t h eg e n e t i cd i s t a n c ea m o n gt h ef o u rs a r d i n e l l as p e c i e s r a n g e df r o mo 15 8t o0 2 0 5 t h en jp h y l o g e n e t i et r e eo ff o u rs a r d i n e l l as p e c i e s s h o w e dt h a ts m e l a n u r aa n ds j u s s i e u ，s z u n a s ia n ds a u r i t ah a de l o s eg e n e t i c r e l a t i o n s h i pb e t w e e nr e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：s a r d i n e l l as p e c i e s ；m o r p h o l o g i c ；m t d n ac o n t r o lr e g i o n ；c y t o e h r o m e b g e n e ；c 0 1g e n e i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l 注；垫塑查基丝 益墓挂型直盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：杨天热签字日期：拗罗年当月2 f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密 的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 揪燕 、 _ ，一 导腊：匆听 签字日期：2 0 d 2 年s 月2 6 日签字日期：盈略年多月“日 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l uz u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 1 绪论 1 1 鱼类遗传多样性的研究方法 遗传多样性，又称为基因多样性，它不仅是生物多样性的重要组成部分，而 且是物种多样性和生态系统多样性的基础。遗传多样性具有广义和狭义的双重含 义，广义的遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息的总和，狭义的遗传 多样性是指种内不同群体或同一群体内不同个体的遗传变异的总和。通常所指的 遗传多样性是指狭义的遗传多样性。遗传多样性在群体及物种间广泛存在，构成 了形态、生态各异，丰富多彩的生物界，同时也是整个生物圈保持生态平衡的基 础。物种或群体的遗传多样性大小是长期进化的产物，是生存和进化的前提。一 个群体的遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越易扩散其分布范 围和开拓新的环境。相反，濒临灭绝的物种，往往因为生境恶化、过渡捕捞及外 来物种入侵等因素的影响，导致有效繁殖群体过小、性别失衡及遗传衰退等现象， 从而使遗传多样性极为贫乏，并降低了群体适应环境、抵抗病害的能力，最终导 致物种灭绝概率的增加。 遗传多样性是重要的生物资源，遗传多样性的丧失是人类赖以生存资源的永 久性丧失，随着近两个世纪工业化的兴起、发展及不断深化，自然环境不断遭受 人为地破坏，生态环境日益恶化，物种的灭绝速度已明显加快，所以遗传多样性 的研究、保护及可持续利用已成为迫在眉睫的问题。 遗传多样性研究通常可以从四个不同水平进行，即形态学研究、细胞染色体 多态性研究、蛋白质多态性研究和d n a 多态性研究。 1 1 1 形态学研究 形态学方法，又称生物学测定方法，属于传统鉴别方法。主要研究形态变 量及其协同变量与其他变量的关系。传统的形态测量法是多变量统计分析在形 态变量数值化中的应用，如长度，宽度和高度。 众所周知，分类学鉴别的物种常规程序是根据对个体的形态特征和它相应性 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 状的检索而得。这里所谓的“特征 ，既包括生物个体“质 的描述，如鱼类体 型，也包括“量 的计测，如分节和量度特征参数。由于物种在形态和遗传上 的稳定性，导致种间在质和量上的间断或显著差异，所以种的鉴别通常只要对 少数个体的检索即可确定，而种群是种内的个体群，所以在其特征和性状上则 往往呈现不同程度的连续与性状变异，这就要求通过种群的大规模计量，并借 助于统计运算的结果，方可判明( 邓景耀等，1 9 9 0 ；陈大刚，1 9 9 0 ) 。 形态标记是生物特定的肉眼可见的外部特征、特性，是简单直观、容易获 得的指标。从形态学和表形性状上研究遗传变异是最古老、最简便易行的方法， 也是早期经典遗传学研究的内容。长期以来，物种分类、资源鉴定、生物起源 和进化研究都是形态标记主要的或基本的指标。该方法需要大量的生物学测定 工作，取样和技术上容易实现，在我国应用广泛( 费鸿年等，1 9 9 0 ) 。比较典型 的海水鱼类种群形态学研究有大黄鱼、二长棘鲷等( 田明诚等，1 9 6 2 ；张其永 等，1 9 8 3 ；张其永等，1 9 6 6 ；刘名等，2 0 0 7 ) 。 到目前为止，形态标记仍然是分类学研究的常用方法。虽然传统形态测量 法结合了多变量统计形态性状的数值化，但问题仍然存在，如标记所需时间长， 可鉴别标记基因有限、数量较少，以及易受环境条件影响等。因此，物体的有 些方面性状不可避免的会丢失。这些缺点给应用带来很大困难，因此难以准确 提供种群遗传结构和种群间遗传分化的信息，远不能满足遗传育种的需要。 1 1 2 细胞一染色体多态性研究 显微镜技术的改进，使得利用染色体核型和带型分析技术来鉴别宏观物种的 分类及核型演化成为了可能。1 9 0 0 年以后，m o r g a n 等将m e n d e l 所称的“遗传 因子”( i n h e r i t e df a c t o r ) 的行为与细胞核内染色体的行为相联系研究，导致了细 胞遗传学的诞生，从而使细胞学标记得到应用。细胞遗传学的研究发现，染色体 数目的变化如单体、三倍体及结构的变化如缺失、易位、倒位、重复等，常常引 起某些表型性状的变化。这些变化体现了物种的分化和形成过程、亲缘关系、演 化途径和历史( 余先觉等，1 9 8 9 ) 。因此，染色体的变化可作为一种遗传标记， 用于测定基因所在的染色体及位置，或通过染色体代换等遗传操作进行基因定 位。 2 青鳞小涉丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 染色体变异研究对于生物的系统分类、起源于进化研究有重要的意义，它克 服了形态标记易受环境影响的缺点。但是，由于染色体受到的选择压力较大，进 化较为保守，一般适用于亲缘关系较远的物种之间的遗传多样性比较，而对于亲 缘关系较近的物种、群体或个体来说，所能得到的信息很有限。 1 1 3 蛋白质多态性研究 在绝大多数情况下，蛋白质电泳可区别编码蛋白基因的纯合型或杂合型，并 且可以计算出一样品中各不同基因型的个体数量。因此，蛋白质电泳技术导致了 动植物种群遗传和进化遗传学的革命性进展。 不同等位基因编码的不同蛋白可能在电泳场上有相同的迁移率，但却有不同 的组织化学染色强度，或不同的热稳定性。根据蛋白质的这些不同特性，可以把 不同等位基因编码的蛋白质区分开来( 吴清江等，1 9 9 9 ) 。 电泳分离不同成分的蛋白的主要原理是，在电泳场中，不同性质的蛋白质混 合物各组成部分，按它们所带电荷向一定方向移动，在有缓冲液的支持物上泳动， 在凝胶介质中，凝胶的分子筛效应也起着作用。因此，其移动速度和方向取决于 蛋白质分子的大小和所带电荷的性质和数量，从而可以把不同组分的蛋白分子分 离开来。通过特殊的染色技术( 组织化学方法) ( s h a we ta l ，1 9 7 0 ) ，可以看清 分离后的组分，并可以进行各单一组分的定量测定。通常用于电泳分离的支持物 有淀粉凝胶、乙酸纤维薄膜、琼脂凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等( 王中仁，1 9 9 8 ) 。 蛋白质水平用于检测遗传多样性的方法主要是同工酶技术。从m a r k e t 和 m u l l e r ( 1 9 5 9 ) 首次提出同工酶的概念以来，同工酶研究得到了迅猛发展。同工 酶( i s o z y m e ) 是由一个或多个基因座位编码，催化同一个生化反应，而在电场 中存在多种可分离形式的酶。同工酶具有特异性强的特点，而且由于其检测到的 多态性较丰富，能够有效地度量遗传变异的群体结构，分析设备要求不高、方法 也比较简单。因此，在2 0 世纪6 0 8 0 年代发展较为迅速，为生物的遗传多样性 研究提供了大量资料，在渔业遗传学研究中扮演了重要角色。 但是同工酶方法也具有其局限性，同工酶分析在一定程度上会因所选酶的多 少和种类的不同而受到影响，使结果数据发生偏差。同工酶标记所能检测到的差 异性座位受鱼类种类、酶种类及不同的生长发育阶段的影响。 青鳞，j 、沙丁鱼( s a r d i n e l l az “，曲j ) 种群形态学和遗传学研究 1 1 4d n a 多态性研究 d n a 多态性的信息储存在基因组d n a 及细胞器序列中，可利用的多态位多， 不易受环境影响。特别是2 0 世纪8 0 年代分析技术和p c r 技术的发展和应用， 为遗传多样性的研究和检测提供了丰富而可靠的手段。随着近3 0 年来分子生物 学的发展，生物多样性逐渐显示出其优越性：直接以d n a 的形式出现，非等位 的标记之间不存在上位效应及其他形式的基因互作；不受环境和其他因素的影 响；多态性几乎遍及整个标记；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连琐； 有许多分子标记呈共显性；部分分子标记可分析微量的d n a 或古化石样品；结 果稳定可靠，重复性好。 ( 1 ) r f l p 技术( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 当用限制性内切酶处理不同生物体的m t d n a 时，所产生的大分子片段其长 度可能不相同，这种限制性片段长度的差异就是限制性片段长度多态性。依据限 制性片段或位点的差异，计算m t d n a 间的遗传距离，据此来判定个体间、群体 间或种间的差异。如依此距离进一步构建分子聚类图或分子系统树，即可重建出 群体或物种问的系统分化或系统发育情况或过程。该方法能够比较种内及种间的 差异，且具有快速、经济、结果可靠等优点，尤其适用于大群体、大样本的遗传、 进化研究。r f l p 方法早期主要集中在整个线粒体基因组限制性酶切物理图谱的 研究上，但是随着p c r 技术的发展，p c r - r f l p 方法因为简化了r f l p 操作过 程而得到了更加广泛的应用，该标记已成为群体遗传变异、物理图谱构建基因交 流和亲缘关系分析中十分有用的遗传标记。w i l s o n 等和t h o m a s 等较早利用 m t d n a 的r f l p 来探讨几种鲑科鱼类种间和种内的系统进化关系( w i l s o ne ta l ， 1 9 8 5 ；t h o m a s ，1 9 8 6 ) 。r o g n o n 等借助线粒体d n a 的n d 5 6 片段的i 强l p 分析， 认为西非和东非的罗非鱼分别属于不同的群体( r o g n o ne ta l ，1 9 9 7 ) 。 但是r f l p 标记也有其自身的不足，r f l p 分析和限制性内切酶的选择有十 分重要关系，只有特定的内切酶并且在某个位点才表现多态性，最主要的问题是 酶切后相同长度d n a 片段内的碱基变异情况无法检测到，因此该标记的灵敏度 不是很高。 ( 2 ) r a p d 技术( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) r a p d 技术是l9 9 0 年分别由w i l l i a m s 和w e l s h 发展起来的一项分子标记技 4 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n m i ) 种群形态学和遗传学研究 术，是p c r 技术的延伸，其原理是利用一系列随机合成的较短的单个随机引物 ( 通常为1 0 个核苷酸，g 屺含量为5 0 * , - - - 7 0 ) ，以研究对象的基因组d n a 为模 版进行p c r 扩增，这些扩增的d n a 片段的多态性反映了基因组相应区域的d n a 多态性。对每一个引物而言，检测出的基因组d n a 多态性的区域是有限的 ( w i l l i a m se la l ，1 9 9 0 ：w b l s hp fa l ，1 9 9 0 ) 。 r a p d 技术无需设计特定的扩增引物，扩增产物具有丰富的多态性，如果使 用一系列随机引物( 2 0 - 4 0 个) ，其检测区域可扩大到整个基因组，能反映整个 基因组的变化。另外该技术操作简便快速、成本低、无放射性污染。所以该技术 被广泛应用于遗传多样性、种群遗传、数量遗传特定基因的标记和定位等许多研 究领域。 ( 3 ) a f l p 技术( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，a f l p ) 19 9 2 年，荷兰科学家z a b e a u 和v o s 将r f l p 的可靠性和r a p d 的简便性结 合起来，创立了a f l p 技术。它是继限制性片段长度多态性( r f l p ) 、随机扩增 多态d n a ( 廿d ) 之后的第三代分子标记。a f l p 是在r f l p 和r a t i d 的基础 上发展起了的，汇集了两者的优点，克服了它们的缺点，既有r f l p 的可靠性， 也有r a p d 的方便性。a f l p 被认为是一种十分理想和有效的分子标记技术( 徐 安毕等，2 0 0 7 ) 。 其原理为用两种或两种以上的内切酶切割基因组d n a ，在切得片段的两端 加上双链人工接头，作为p c r 扩增的模板，以人工接头和内切酶位点序列再加 上选择性核苷酸序列为引物，进行选择性扩增，扩增产物经凝胶电泳而显示物种 的多态性。a f l p 技术具有方法简单、成本较低、结果快速可靠、无需制备探针 和分子杂交、信息量大及应用范围广等优点，自创建以来，被应用于鱼类遗传研 究的多个领域中，尤其在遗传图谱构建、遗传结构分析研究等方面显示出很大的 优越性( k o e h e re ta l ，1 9 9 8 ；y o u n ge la l ，1 9 9 8 ；王志勇等，2 0 0 4 ) 。 ( 4 ) d n a 测序技术 先测定核d n a 部分基因片段或m t d n a 的全序列或部分基因片段序列，然 后用有关的软件进行排序，找出变异位点或单倍型类型，即可了解个体间、群体 间或种间的异同情况，如进一步进行分子系统树构建或其他分析，则可揭示群内、 群问及种间的聚类情况和系统分化、系统发育情况或过程( 闫华超等，2 0 0 4 ) 。 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传掌研究 目前，已测定m t d n a 全序列的鱼类共有1 6 1 种。它们m t d n a 的结构和基 因成分都与其他脊椎动物的类似，均由2 2 个t r n a s 基因、2 个r r n a 基因( 1 2 s r r n a 和1 6 sr r n a ) 、控制区( d 环区) 、轻链复制起始区和1 3 个疏水性蛋白质 多肽组成( 郭新红等，2 0 0 4 ) 。z a r d o y a 和m e y e r 考察了脊椎动物m t d n a 上1 3 个蛋白质编码基因包含系统发育信息的情况，将1 3 个基因分为好、中、差三组。 好的一组基因含有良好的系统发育信息，它们是：n d 4 、n d 5 、n d 2 、c y t b 和 c o i ：中等的一组基因含有一定的系统发育信息，它们是：c o i i 、c o i i i 、n d l 和n d 6 ；差的一组基因不能很好的提供系统发育信息，它们是：a t p a s e 6 、n d 3 、 a t p a s e 8 和n d 4 l ( z a r d o y a e ta l ，1 9 9 6 ) 。 图1 1 海水鱼类线粒体结构图 f i g1 1 t h eg r a p h i co fm i t o c h o n d r i a lg e n o m ei nm a r i n ef i s h 与核d n a 相比，鱼类m t d n a 具有分子小、结构简单、进化速度快、不同 区域进化速度存在差异等特点，是一个相对独立的复制单位。正是由于鱼类 m t d n a 具有这些特点，使其成为鱼类进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及 其保护生物学等研究的重要标记。 总之，遗传多样性的研究方法是建立在不同水平、不同层次上的，并且具有 各自的优缺点。因此，采用哪种方法应根据实验的目的、实验材料、实验条件等 选择最合适的方法。 6 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 1 2 青鳞小沙丁鱼概况 1 2 1 青鳞小沙丁鱼的分类地位及分布 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s ib l e e k e r ，l8 5 4 ) ，又名寿南小沙丁鱼，俗名 柳叶鱼、青皮、青花鱼，属鲱形目c l u p e i f o r m e s 、鲱科c l u p e i d a e 、小沙丁鱼属 s a r d i n e l l a ( 张世义，2 0 0 1 ) 。小沙丁鱼属种类最多，世界上共发现有2 0 多种。 国内已报道的小沙丁鱼属约1 0 余种，其中以金色小沙丁鱼和裘氏小沙丁鱼产量 最高。 其主要分布于黄渤海，散见于我国东南沿海。国外分布于日本南部的太平洋 西部海域、菲律宾、泰国、越南、马来半岛各海区( 张世义，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 青鳞小沙丁鱼的形态学特征 青鳞小沙丁鱼体延长而侧扁，腹部略圆，具棱鳞，1 7 1 8 + 1 3 1 4 个。脂性眼 睑发达，几完全覆盖住眼睛。口小，前位；上下颌约等长；上颌骨末端达眼前缘 下方。鳃盖光滑；下枝鳃耙数5 1 5 4 。体被细薄圆鳞，极易脱落；鳞片上之垂直 条纹仅多且不中断或上下对应条纹在中央部位重叠；鳞片后缘之小孔少于2 0 个 以下；背鳍和臀鳍基部有发达之鳞鞘；胸鳍和腹鳍基部具腋鳞l 片。背鳍位于体 中部前方，具软条1 7 1 8 ；臀鳍位于体之后半部，具软条1 8 1 9 ；腹鳍软条8 ；尾 鳍深叉。体背部青绿色，体侧下方和腹部银白色；鳃盖末缘具明显黑斑。背鳍淡 黄，前端基部不具黑点；尾鳍淡黄，上下叶不具黑缘，末端不具大块黑斑；胸鳍 淡黄；余鳍淡色( 张世义，2 0 0 1 ；郑葆珊，1 9 8 7 ) 。 图1 2 青鳞小沙丁鱼 f i g1 2s a r d i n e l l az u n a s ib l e e k e r 7 青鳞小沙 笪( s a r d i n e l l az u n a s i ) 群群形态学和遗传学研究 1 2 3 青鳞小沙丁鱼的生物学特征 青鳞小沙丁鱼为栖息在海洋、近岸的暖水性小型鱼类。游泳迅速，通常栖息 于中上层，秋、冬季表层水温较低时则栖息于较深海区，适温范围2 0 , - - , 3 0 。c 左 右。青鳞小沙丁鱼早期发育阶段，对水温、盐度及水深适应范围较广，鱼卵多分 布在高温、低盐浅水区，仔鱼多在高盐较深水域，从鱼卵到后期仔鱼的发育过程， 具有趋向深水性的移动。主要摄食浮游生物，饵料因鱼种、海区和季节而异，成 鱼和幼鱼也有不同。成鱼主要摄食浮游甲壳类( 包括桡足类、短尾类幼体、端足 类和糠虾) ，也摄食硅藻；幼鱼除摄食浮游甲壳类幼体外，也食硅藻和甲藻类。 青鳞小沙丁鱼一般不作远距离洄游，秋、冬季成鱼栖于7 0 - 8 0 米以外深水， 春季，沿海水温升高鱼群向近岸作生殖洄游。仔、幼鱼孵化后在沿海索饵成长， 夏季逐渐随南海暖流向北洄游。秋季表层水温下降，遂向南洄游。至1 0 月以后 鱼体已成长至1 5 0 毫米以上时，由于沿海水温降低而逐渐转栖于较深海区。 青鳞小沙丁鱼卵呈球形，浮性，成熟卵径约0 6 - 0 9 毫米，初孵仔鱼长约2 3 毫米。在1 龄或2 龄开始性成熟，春、夏季为生殖期。怀卵量多在l o 万粒以下， 平均体长繁殖力为3 9 9 粒毫米，平均体重繁殖力为2 0 3 8 粒克。繁殖力随个体和 年龄的增大而增加，不同年龄以及同年龄组不同个体繁殖力差异显著( 窦存银等， 2 0 0 2 ) 。 高天翔( 1 9 9 3 ) 曾对青岛近海2 0 6 7 尾青鳞小沙丁鱼的年龄、生长与死亡特 征进行过研究，结果表明青鳞小沙丁鱼具有性成熟早、生理寿命较短、年龄结构 比较简单、个体相对生长较快、拐点年龄较早等特点，从而相应形成渐近体长偏 小、生长系数较大、自然死亡较高的生活史基本特征，再匹配适温类型偏暖温性、 个体相对繁殖力较高，营养层次低、属浮游生物食性等特征参量，因此在 m a c a r t h u r 的r 选择、k 选择生活史类型理论中( m a c a r t h u re ta l ，19 6 7 ) ，青鳞 小沙丁鱼应归属于r - 选择的生活史类型，从而为该鱼的渔业管理策略提供科学依 据。 青鳞小沙丁鱼所赋予的年龄生长与生活史特征，决定着该鱼是势量变幅较大 的种群动态形式鱼种，其资源丰度取决于当年幼鱼补充量的高低，决定着世代的 强弱，最后反映于渔获量的多寡。上世纪八十年代，尽管当时的资源利用强度尚 高，渔捞死亡率大，群体较过去也明显趋于小型化，其年龄组成仍较稳定，生物 8 青鳞小沙丁鱼( s a ； d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 量丰度仍能维持在较高的水平上( 高天翔，1 9 9 3 ) 。目前，由于气候环境变化、 过度捕捞等原因，青鳞小沙丁鱼资源量已经开始逐年减少( 江胜锋等，2 0 0 6 ；任 一平等，2 0 0 2 ；焦燕等，2 0 0 1 ) 。 鳞片是鱼类皮肤的衍生物，是适应水域环境的一种构造。它作为鱼类的外骨 骼，广泛存在于现生硬骨鱼类的体表，鳞片的数目和形态特征是鱼类分类的主要 特征之一，也是鱼类年龄鉴定和生长状态分析的重要依据。国内学者高天翔等运 用扫描电镜技术对寿南小沙丁鱼鳞片形态结构及轮纹特征进行了观察。研究结果 表明：青鳞小沙丁鱼鳞片属圆鳞，与鲱形鳞相似，可分为三个部分：基区、侧区 和顶区。其鳞片后缘无栉齿，顶区与侧区呈圆角过渡，无明显分界线；基区与侧 区交角小于或接近于9 0 。，分界明显。青鳞小沙丁鱼鳞片的环片呈山嵴状，呈 波纹状圆弧线平行排列，与鳞片中轴几乎垂直相交，与鳞片边缘呈一定角度。环 片侧上部有许多齿状粒突，数目有多有少，大小也不一样，其功能可能为增加鳞 片强度。鳞片侧区的年轮和副轮清晰，为一种透明、和鳞片边缘相平行而呈同心 圆排列的带，前区类似于阶梯。鳞片侧区的年轮或副轮最清晰可辨，在与年轮相 交处，环片明显呈下凹弯曲，少数发生断裂。鳞片上辐射沟数目差异很大，辐射 沟与鳞片中轴几乎垂直，主要呈波纹状平行排列，此外，也有斜直线、凸区朝后 呈圆弧线等排列形式( 高天翔等，2 0 0 1 ) 。范瑞青等发现蓝罗非鱼每年增加1 2 条辐射沟，辐射沟数的变化与鱼类的生长年龄成正比关系，辐射沟数量增长的速 度与鱼类生长速度有关。而高天翔等研究认为青鳞小沙丁鱼辐射沟数量与年龄之 间没有一定的关系( 范瑞青等，2 0 0 0 ) 。因此，青鳞小沙丁鱼是否具有同蓝罗非 鱼鳞片相似的生长变化规律尚有待进一步的饲育实验证明。 1 2 4 青鳞小沙丁鱼营养学研究 青鳞小沙丁鱼具有生长快、繁殖力强的优点，且肉质鲜嫩，营养价值高，含 脂肪约1 4 ，蛋白质1 8 ，此外还含无机磷和维生素a 、d 、e 等。据有关资 料介绍，沙丁鱼中含有一种具有5 个双键的长链脂肪酸，可防止血栓形成，对治 疗心脏病有特效。但由于此种鱼个体小，产量高产值低，保鲜加工困难大，欧美 及日本等多将沙丁鱼制罐。还可用以提炼鱼油，供食用、制革、制皂和金属冶炼 等，也可制鱼粉和作为捕金枪鱼的钓饵。近年各地都在研制加工鱼羔、鱼丸、鱼 9 青鳞小沙丁鱼( s a r d i n e l l az u n a s i ) 种群形态学和遗传学研究 卷、鱼香肠等多种方便食品。 1 3 小沙丁鱼属其他几种鱼类概况 1 3 1 裘氏小沙丁鱼 裘氏小沙丁鱼( s a r d i n e l l a j u s s i e u iv a l e n c i e n n e s ，1 8 4 7 ) ，别名多耙小沙丁