（特种经济动物饲养专业论文）家蚕抗胰蛋白酶SWAT基因可选择性剪辑的初步研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 真核基因表达调控是生命科学研究的前沿和热点。r n a 的选择性剪 辑在真核基因表达调控中起着十分重要的作用。选择性剪辑可使同一基因 编码出功能不同的蛋白，对满足生物体复杂性所需蛋白的多样性具有重要 意义。m r n a 前体的选择性剪辑能够精细协调基因的功能，高效调节基因 的定量表达以及蛋白功能的多样化，影响主要发育方向的决定，对细胞的 分化、发育、生理功能和病理状态都有重要意义。 家蚕是重要的经济昆虫，也是现代分子生物学研究的模式生物之一。 家蚕属于鳞翅目昆虫，其非特异性体液免疫的主要作用物质是血液或黏液 中的体液因子。而早在1 9 9 0 年，h i r o s h it a k a g i 等人就已证实家蚕抗胰蛋 白酶是一类重要的体液免疫因子，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制酚 氧化酶的活性，可能作用于酚氧化酶的活性前体。 本文利用生物信息学软件对家蚕抗胰蛋白酶基因的1 0 0 条e s t 进行 分析与归纳，初步推测s w a t 基因存在四种不同剪辑方式。s w a t 基因 四种不同剪辑方式均有1 0 个外显子和9 个内含子组成，只有第9 外显子 各不相同。根据s w a t 基因四种不同剪辑方式的核酸序列跨内含子设计 特异性引物，通过r t p c r 证实了四种不同剪辑方式的存在，并结合实时 荧光定量p c r 对这四种不同剪辑方式进行了组织表达分布、表达时相及 其在家蚕不同组织中表达量的研究，结果表明，s w a t 基因的四种不同 剪辑方式在家蚕幼虫和蛹各个组织均存在明显的组织特异性；第一种剪辑 方式的相对表达量最高，在幼虫和蛹的脂肪体中，相对于10 0 0 个内参 b m - a c t i na 3 基因的拷贝数均达到60 0 0 个左右；而第四种剪辑方式表达 量最少，仅为l1 0 个拷贝数，我们推测第四种剪辑方式可能是基因选择性 剪辑的一种新形式。高、低温处理结果显示，s w a t 基因对1 0 低温的 反应最敏感，在脂肪体中的表达量比常规饲养高出3 倍，这可能与其应激 家蚕抗胰蛋白酶基因可选择性剪辑的初步研究 功能密切相关。对于s w a t 基因四种不同剪辑变异体的剪辑机制及其功 能有待进一步的研究。 关键词：家蚕；抗胰蛋白酶基因；选择性剪辑；荧光定量p c r ；组织表达 分布；表达时相 i i 山东农业大学硕士学位论文 a l t e r n a t i v es p l i c i n go f a n t i t r y p s i ni nt h es i l k w o r m ， b o m b y xm o r i a b s t r a c t t h ec o n t r o lo fe u k a r y o t i cg e n ee x p r e s s i o ni sc u r r e n t l ya k e yf o c a lp o i n to f l i f es c i e n c er e s e a r c h r e s e a c hh a ss h o w nt h a tm r n aa f f e c t sg e n er e g u l a t i o n a n de x p r e s s i o n ，s os p l i c i n g ，e s p a c i a l l ya l t e r n a t i v es p l i c i n go fr n a ，w i l la f f e c t t h ec o n t r o lo fe u k a r y o t i cg e n ee x p r e s s i o n a l t e r n a t i v es p l i c i n gi sam e c h a n i s m t h a ti n c r e a s e st r a n s c r i p t o m ea n dp r o t e o m ed i v e r s i f i c a t i o n s b yg e n e r a t i n g m u l t i p l em r n ap r o d u c t sf r o m as i n g l e g e n e t h ep r e r n a sa l t e m a t v i e s p l i c i n gg r e a t l yi n c r e a s e st h ed i v e r s i y t yo fp r o t e i n sa n dt h ec o m p l e x i t yo f g e n e se x p e r s s i o n i tc a l lc o n t r o lt h eq u a n t i t a t i o ne x p r e s s i o no fp r o t e i n sh i i g h l y p e r f o r m a n c e a l t e r n a t i v es p l i c i n gi n f l u e n c e st h eg r o w t ho fo r g a n i s ma n dp l a y a ni m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ei nc e l l d i f f e r e n t i a t i o n ，d e v e l o p m e n t ；p h y s i o l o g i c f u n c t i o na n dp a t h o l o g i cs t a t e t h es i l k w o r mw a sa ni m p o r t a n te c o n o m i ci n s e c t ，f u r t h e r m o r e ，i tw a so n e o ft h em o d e lc r e a t u r e si nm o l e c u l a r b i o l o g y s i l k w o r mw a sat y p i c a l r e p r e s e n t a t i v ei nl e p i d o p t e r a t h en o n - s p e c i f i ch u m o r a li m m u n i t ya c t o ri sa t y p eo fh u m o r a lf a c t o ri nh e m o l y m p ha n dm u c u s i n19 9 0 ，h i r o s h it a k a g ih a s c o n f i r m e dt h a ts i l k w o r ma n t i t r y p s i n ( s w - a t ) i sah u m o r a lf a c t o r i ti so n e c l a s so fs e r i n ep r o t e i n a si n h i b i t o r s ，w h i c hp l a yam a j o rr o l ei nr e g u l a t i n gt h e p r o t e i n a s ea c t i v i t y i nt h e i n s e c t h a e m o l y m p h s w - a tc a ns u p p r e s st - h e a p p e a r a n c e o f p h e n o l o x i d a s ea c t i v i t y ， a n d m a y f u n c t i o ni nt h e p r o p h e n o l o x i d a s ea c t i v a t i n gc a s c a d ei nt h eh e m o l y m p h ，w h i c hi st h o u g h tt ob e a ni m p o r t a n td e f e n s es y s t e mi ni n s e c t s s o ，t h es t u d yr e s e a r c h e dt h ea l t e r n a t i v es p l i c i n go fs w - a ti n i t i a l l y f i r s t ， u s i n gt h es o f t w a r eo fb i o i n f o r m a t i c s ，g e t10 0e s to fs w a ta n di n d u c e d t h e mt of o u ri s o f o r m s t h e yi sc o n s i s e n t e do f10e x o n sa n d9i n t r o n s ，t h en i n t h e x o ni sd i f f e r e n t t ob e s t r i d ei n t r o n ，t h es t u d yd e s i g n e dt h es p e c i f i c i t yp r i m e r i i i 家蚕抗胰蛋白酶基因可选择性剪辑的初步研究 u s i n gr t - p c ra n dr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c rm e t h o d s ，t h es t u d yc o n f i r m e d t h ef o u ri s o f o r m sa n di n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o nl e v e li nv a r i o u sl a r v a la n d p u p a lo r g a n s ，a n dt h ee x p r e s s i o nq u a n t i t yo ft h ef a tb o d yi nd i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a la g e s t h er e s u l t si n d i c a t ef o u ri s o f o r n l sw e r ee x p r e s s e di nm o s t o ft h eo r g a n sa n dh a dah i g he x p r e s s i o nl e v e li nf a tb o d y t h ec o p yn u m b e ro f t h ef i r s ti s o f o r mi su pt o60 0 0p e r10 0 0b m - a c t i na 3g e n e ，b u tt h ee x p r e s s i o n l e v e lo ft h ef o u r t hi s o f o r mi sl o w e s t ，110c o p i e s s u p p o s et h ef o u r t hi s o f o r m m a yb ean e wf o r m h i g ha n dl o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n ti n d i c a t es w 一峨i s v e r ys e n s i t i v e ，t h ee x p r e s s i o nq u a n t i t yi sm o r et h r e et i m e sh i g h e rt h a n c o n v e n t i o n a l f e e d i n g ，t h i sm a yb ec o r r e l a t e d t ot h es t r e s sf u n c t i o n t h e f u n d a m e n t a lm e c h a n i s ma n df u n c t i o no fa k e m a t i v es p l i c i n go fs w a ts h o u l d b es t u d i e da d v a n c e l y k e yw o r d s ：s i l k w o r m ( b o m b y xm o r o ；a n t i t r y p s i ng e n e ；a l t e r n a t i v e s p l i c i n g ；r e a l t i m eq u a n t i t a t i v e p c r ；t i s s u ee x p r e s s i o n ；p h a s ee x p r e s s i o n i v 缩写 b l a s t b m b w c d n a d e p c e s t e b f b g h h e m g m t n c b i o o r f p c r r r - p c r r n a s e s g s w a t t t c w d 本文所用英文缩写说明 英文 b a s i cl o c a la l i g n m e n t s e a r c ht o o l b o m b y xm o r i b o d yw a l l c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h l p r o c a r b o n a t e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g e t h i d i u mb r o m i d e f a t b o d y g o n a d h e a d h e m o c y t e m i d g u t m a l p i g h i a nt u b u l e n a t i o n a lc e n t r a lo f b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o v a r y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r r i b o n u c l e a s e s i l kg l a n d s i l k w o r ma n t i t r y p s i n t e s t i s t r a c h e a lc l u s t e r w i n gd i s c 中文说明 局部相似性检索 家蚕 体壁 互补脱氧核糖核酸 焦碳酸二乙酯 表达序列标签 溴化乙锭 脂肪 生殖腺 头部 血球 中肠 马氏管 美国国家生物技术信息中心 卵巢 开放阅读框 聚合酶链式反应 逆转录一聚合酶链式反应 核糖核酸酶 丝腺 家蚕抗胰蛋白酶 睾丸 气管丛 翅原基 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行 科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮 助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本 声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据 库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日 期：丞翌么2 厶o 山东农业大学硕士学位论文 引言 1 基因的表达调控 基因表达调控与细胞的正常生长、发育、分化及机体生理功能密切相 关。真核生物基因表达包括转录、转录后加工、翻译和翻译后修饰等过程， 因此，真核生物基因表达调控可以发生在这些过程中的任何环节，如转录 前对d n a 结构的修饰、转录水平调控、转录后加工过程的调控、翻译过 程及翻译后修饰过程的调控。其中转录水平的调控是最重要的一环，而基 因的选择性剪辑是真核生物基因表达转录调控的一种主要方式。 基因的选择性表达与基因的选择性剪辑密不可分。基因的选择性 表达是指在细胞分化中，基因在特定的时间和空间条件下有选择表达 的现象，其结果是形成了形态结构和生理功能不同的细胞。由于细胞 分化发生在生物体的整个生命进程中，所以基因的选择性表达在生命 过程各阶段都在体现。不仅如此，基因的选择性表达在单细胞原核、 真核生物生长发育中，甚至病毒的生命活动中都有明显表现，这充分 体现了基因的选择性表达的普遍性。同时，在某些外界因素和生物内 部因素影响下，基因的选择性表达还会出现特殊性。基因选择性表达 的特殊性不仅表现在基因是否能在特定的空间和时间表达，还体现在 表达量的方面。因此，基因的选择性表达与基因的选择性剪辑是基因 表达调控的重要研究内容。 2 基因选择性剪辑的研究进展 2 1 选择性剪辑的研究概况 1 9 7 7 年，由美国麻省理工学院的p h i l l i ps h a r p 和冷泉港实验室的 r i c h a r dr o b e r t s 分别领导的两个研究小组，几乎同时发现真核细胞腺病毒 m r n a 序列信息并不来源于连续的d n a 区域( b e r g e te ta 1 ，1 9 7 7 ；c h o we t a 1 ，1 9 7 7 ) ，在其表达过程中，初始转录产物必须通过特殊的转录后加工 机制特异地丢失一部分区域( i n t r o n ) ，而将另一部分间断分布的区域 ( e x o n ) 依次拼接形成成熟的m r n a ，这就是著名的割裂基因( s p l i tg e n e ) 的发现。这一研究发现不但彻底变革了传统的基因概念，而且对基因调控 和进化的研究以及生物技术都产生了巨大的影响。 家螽抗胰蛋白酶幕因可选择性剪辑的初步研究 割裂基因的概念提出后，1 9 7 8 年，w a l t e rg i l b e r t 提出一个基因的不 同外显子可以组合并起被剪接下来，从而产生出不同的m r n a ( g i l b e a e ta 1 ，1 9 7 8 ) 。2 0 世纪8 0 年代早期，陆续有一些基因的选择性剪辑现象 被报道出来( e a r l ye ta 1 ，1 9 8 0 ；r o s e n f e i de ta 1 ，1 9 8 2 ) ，如免疫球蛋白m u 基因和降钙素基因中均发现选择性剪辑现象。研究人员认为约有5 的高 等真核生物基因具有选择性剪辑现象( s h a r pe ta 1 ，1 9 9 4 ) 。2 0 世纪8 0 年 代末以来，人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o i e c t ，h g p ) 的开展极大地 促进了生物信息学的飞速发展。2 0 0 1 年，人类基因组草图的公布( v e n t e r e ta 1 ，2 0 0 1 ) ，标志着人类全基因组测序工作已经基本完成。据报道，人 类基因的总数大约是3 50 0 0 个( v e n t e re ta j ，2 0 0 1 ；e w i n ge ta 1 ，2 0 0 0 ； a d a m se ta 1 ，2 0 0 0 ) ，仅为果蝇( 1 40 0 0 个) 和线虫( 1 90 0 0 个) ( l i a n g ， e ta 1 ，2 0 0 0 ) 的两倍左右，这与之前人们对人类基因总数的估计( p e n n i s i ， 2 0 0 0 ；m o d r e ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 相差甚远。研究表明，绝大多数高等真核生物 都存在选择性剪辑的现象，而且所占基因的比例也远高于之前预计的5 。 有研究报导，约有4 0 6 0 的人类基因具有不同的剪接形式( m o d m ke ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 基因的选择性剪辑可能发生在不同的组织中( 组织特异性) ，不同细 胞中( 细胞特异性) ，不同发育阶段( 时空特异性) ，也可能在同一种细 胞中。总之，r n a 的选择性剪辑在基因表达调控中起到很重要的作用， 因此，对基因不同剪辑形式的机制和功能及其表达调控的研究具有重要的 理论意义。同时，这一研究对于针对不同剪辑形式引起的病理治疗药物的 设计也具有重大的实际意义。 2 2 选择性剪辑的基本形式 r n a 剪接研究中的重大发现之一是选择性剪辑( 也称可变剪接， a l t e m a t i v es p l i c i n g ) ，即在同一个基因中，其剪接位点和拼接方式可以改 变，从而导致一个基因能产生多个具有明显差异的相关蛋白质。r n a 的选 择性剪辑是真核生物的一种基本而又重要的调控机制。由于它不牵涉到遗 传信息的永久性改变，所以是真核基因表达调控中一种比较灵活的方式。 一般来说，选择性剪辑主要有以下几种方式：1 ) 外显子加入或转移，也 称为外显子跳跃( e x o ns k i p ) ( 图1 ，a ) 。2 ) 基因的5 端或3 端外显子可以 2 山东农业大学硕士学位论文 被有选择地延长或缩短，也叫做5 端或3 端的选择性剪辑( a l t e r n a t i v e5 喊3 s p l i c i n g ) ( 图1 ，b ) 。3 ) 两个相邻的外显子间互相排斥，以至于只有其中 1 个外显子被包括在剪接产物中，这也被称为互相排斥的外显子( m u t u a l l y e x c l u s i v ee x o n s ) ( 图1 ，c ) 。4 ) 在剪接的过程中有的内含子没有被剪切掉， 而是被保留下来，起到了外显子的作用，简称为内含子保留( i n t r o n r e t e n t i o n ) ( 图1 ，d ) 。在以上介绍的几种方式中，外显子跳跃是最简单也 是最普遍存在的一种方式，其次是5 端或3 端的选择性剪辑( m o d r e ke ta 1 ， 2 0 0 1 ) ；外显于问相互排斥的选择性剪接方式相对较少见；据统计选择性 终止的方式存在于2 4 的基因中，当然最少见的方式是内含子保留( l e e 。 e ta 1 2 0 0 3 ) 。 a 釜罢= 董釜咤= 篇 c ：= ；e 一o 一一、一 6 。2 3 粤! ，。：誉篇 1 】t “m c = = ：ae m 6 已= = = 岁罗一 。1 图1 1m r n a 选择性剪接的方式 f i g 1 1p a t t e r n so f m r n aa l t e r n a t i v es p l i c i n g 2 3 选择性剪辑形式的识别 目前，基因选择性剪辑的生物信息学研究主要依赖于e s t s 、m r n a ( e d n a ) 等转录数掘提供的基因结构信息( k i me ta l ，2 0 0 7 ) 。多数识别 方法首先对来自同一基因的e s t s 或m r n a 序列进行归类，然后将对应于同 一基因的一娄序列之间进行比对。有很多科研人员都在致力于从e s t 与基 因序列的比对中发现可能的选择性剪辑形式以及对选择性剪辑基因出现 的比例进行估计。根据选择性剪辑的基本形式，每个可能的选择性剪辑可 以通过将e s t s 与其对应的基因组序列精确比对获得其确切的选择性剪辑 形式。与基因组序列相匹配的部分为外显子，各个外显子之间被内含子隔 r 家蚕抗胰蛋白酶堆因可选择性剪辑的初步研究 离开，内含子序列在剪接位点具有较高的保守性，因此可用来验证内含子 _ 夕 显子边界，获得剪接位点相对于基因组序列准确位置的信息。但是这 种方法也存在弊端，绝大多数内含子符合g t - a g 规则( c h u a ，k e ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，但也存在着另一些不同的内含子类型，主要的类型是g c a g 形式。 近来，研究人员逐渐将注意力由所有选择性剪辑转向一些特定的选择 性剪辑，如组织特异性、时空特异性的选择性剪辑等。他们选择在特定情 况( 如组织中的特异表达、发育阶段的特异表达及与疾病相关的特异表达 等) 下的e s t s 序列与全基因组比对，并与其参照系进行比较( 其它组织 或无组织特异性、其它发育阶段或无明显时序上的差别、正常组织细胞 等) ，从而找到感兴趣的特定的选择性剪辑。 虽然，e s t 用于寻找新基因和了解基因的表达情况，具有快速、大规 模、含信息量多等优点。但仍有一系列的内在问题，如e s t 数据本身质 量不高，而且缺少完整转录本的信息，统计结果的可靠性没有保证，并且 只能获得局部信息。因此，更多研究者则利用呈指数增长的表达序列数据 库，将其与基因组序列、内含子数据库、外显子数据库或蛋白质序列进行 比对，预测可能存在的选择性剪辑，收集整理成具有具体推测的剪接形式， 并链接相关证据和功能信息的数据库进行基因选择性剪辑的研究( r a u c h e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 2 4 选择性剪辑的功能与调控研究 2 4 1 选择性剪辑的功能 r n a 前体的选择性剪接又称可变剪接( 或拼接) 是真核生物的一种 基本而又重要的调控机制，它精细协调基因的功能，高效调节基因的定量 表达以及蛋白功能的多样化，影响主要发育方向的决定，对细胞的分化、 发育、生理功能和病理状态都有重要意义。一方面，选择性剪辑涉及生物 体发育过程中的性别决定、细胞分化、凋亡控制等大量重要的调控过程 ( l 6 p e ze ta 1 ，19 9 8 ；b l a c ke ta 1 ，2 0 0 3 ；g r a v e l e ye ta 1 ，2 0 0 2 ；l o u ，h e ta 1 ， 1 9 9 8 ；b o i s ee ta 1 ，1 9 9 3 ；q u e l l ee ta 1 ，1 9 9 5 ；j i a n g ，z h e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，完成机 体的复杂功能和精细调节；另一方面，选择性剪辑基因自身的表达调控也 构成一个异常复杂的系统，涉及到大量的剪辑调控因子及相关蛋白与基因 序列上增强子( e n h a n c e r ) 、沉默子( s i l e n c e r ) 等的相互作用( l 6 p e ze ta 1 ， 4 山东农业大学硕士学位论文 1 9 9 8 ；b l a c ke ta 1 ，2 0 0 3 ；s m i t he ta 1 ，2 0 0 0 ) o 2 4 2 选择性剪辑的调控机制 研究表明，7 0 8 8 的选择性剪辑都会改变蛋白质产物( m o d r e ke ta 1 ， 2 0 0 1 ；k a n ，z e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。由此产生的蛋白质一级结构的改变可以通过不 同的机制引起蛋白结合能力，细胞内定位，酶活性和蛋白稳定性等各种不 同的改变。 选择性剪辑可以通过删除结合结构域或引入新的结构改变，由此产生 具有不同结合活性的蛋白异构体( k r i v e n t s e v a e t a l ，2 0 0 3 ) 。通常情况下， 一个蛋白可有多个结合模序，选择性剪辑可以改变这些模序的数目，从而 达到改变蛋白结合活性的目的。另外，选择性剪辑还可以通过对启动子的 选择性利用及转录因子与d n a 的相互作用进行调控转录( m u k h o p a d h y a y e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。甚至，蛋白之间的相互作用也可以受选择性剪辑的调节。 选择性剪辑通过影响定位信号或调节蛋白与生物膜的相互作用而决 定许多蛋白的细胞内定位。由于跨膜区能从蛋白的一级结构上被准确地预 测出来，所以在大多数情况下，蛋白的膜定位能力是显而易见的。选择性 剪辑通过删除或改变蛋白的跨膜区及膜相关结构域，可产生膜结合功能缺 失的异构体。这些异构体或者失去了膜结合能力，或者获得新的功能，成 为其膜结合亚型的主要抑制因子，并对其功能进行调节。另外，选择性剪 辑还可以决定蛋白在各种细胞器和亚细胞区室的定位，使其隔离在某个细 胞区室中而影响其功能的发挥，这种机制常见于受体蛋白( c h a r t ，w y c t a 1 ，2 0 0 1 ) 。 选择性剪辑对于酶活性和蛋白稳定性的影响是多方面的，可以改变酶 的亲和力、底物特异性、催化能力、最大反应速率等；而对于蛋白稳定性 的影响则通过引入不同的蛋白结构域而调节蛋白的半衰期来完成。 随着生物化学、分子生物学和其他生命科学相关学科的发展，尤其是 新的实验技术和实验方法的建立，人们对于真核生物细胞选择性剪辑调控 机制的认识必将会不断突破。同时，选择性剪辑机制的研究，对于揭示某 些特殊生理和病理现象的分子基础，探索相应基因表达调控的规律也有重 大意义。 3 蛋白酶抑制剂的研究进展 家蚕抗胰蛋白酶桀因可选择性剪辑的初步研究 3 1 蛋白酶抑制剂分类 天然的蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r ，p i ) 是对蛋白水解酶有抑制 活性的一种小分子蛋白质，普遍存在于植物、动物和微生物中( 文方德等， 2 0 0 3 ；r i c h a r d s o n ，1 9 7 7 ) ，它能够与酶的活性部位或变构部位结合，形成 稳定的复合体，从而抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。生 物体内一系列的生理、病理过程中，如对凝血、纤溶、感染、补体活化、 细胞迁移等方面发挥着非常重要的调控作用，同时也是生物体内免疫系统 的重要组成部分。 。 1 9 3 6 年k u n i t z 和n o r t h r o p ( k u n i t ze ta 1 ，1 9 8 6 ) 首次从牛的胰脏( b o v i n e p a n c r e a t i c ) 中分离一种碱性蛋白酶抑制因子( b a s i cp a n c r e a t i e t r y p s i n i n h i b i t o r ，b p t i ) ，之后又从大豆中分离了一种胰蛋白酶抑制因子， 并将其纯化结晶，证明了两种均为蛋白质，由此揭开了蛋白酶抑制剂研究 的序幕。研究至今，根据蛋白酶抑制剂所作用的酶的活性基团的不同及其 氨基酸序列的同源性，可分为丝氨酸( s e r i n e ) 蛋白酶抑制剂、巯基 ( c y s t e i n e ) 蛋白酶抑制剂、金属( m e t a l l o ) 蛋白酶抑制剂和天冬氨酰 ( a s p a r t y l ) 蛋白酶抑制剂( r i c h a r d s o ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。其中，丝氨酸蛋白 酶抑制剂可以明显抑制昆虫的生长和发育，因为大多数昆虫( 如大部分鳞 翅目、直翅目、双翅目、膜翅目以及某些鞘翅目) 肠道内的蛋白酶主要是 丝氨酸蛋白酶( 曲晓华等，2 0 0 3 ) 。丝氨酸蛋白酶抑制剂研究最多的是 b o w m a n b i r k 家族、k u n i t z 家族和p i i 和p i i i 家族3 种主要类型。 3 1 1b o w m a n b i r k 家族蛋白酶抑制剂 b o w m a n b i r k 类胰蛋白酶抑制剂( b o r w m n a b i r k t r y p s i ni n h i b i t o r , b b i ) 是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个主要类型。1 9 9 4 年，d o n a l de b o w m a n 首次 报道b b i ，一个抑制剂分子可以结合二个分子的蛋白酶，是一个双头抑制 剂。氨基酸组分为7 0 个左右，分子量为80 0 0 左右，分子内通常含有7 对二 硫键，具有两个相同或不同的蛋白酶作用的活性中心。一个在 l y s 1 6 s e r l 7 ，可以和胰蛋白酶结合；另一个在l e u 4 3 s e r 4 4 ，可与胰凝乳 蛋白酶结合，所以b b i 可形成与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶1 ：2 结合或与两种 酶同时结合的复合物。目前应用最多的b o w m a n b i r k 家族蛋白酶抑制剂基 因是c p t i 基因，它的两个抑制活性中心，可同时竞争性抑制两个胰蛋白酶 6 山东农业大学硕士学位论文 分子。 3 1 2k u n i t z 家族蛋白酶抑制剂 k u n i t z 家族蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂的另外一个主要类 型，来源非常广泛，现在已经从猪胰脏、海葵、蛇、大豆、赤小豆、天花 粉、海芋、苦豆子、花生、刺桐、太湖蓝藻等动、植物中分离到k u n i t z 型丝氨酸蛋白酶抑制剂。它们的相对分子质量从几千到十几万不等，组成 的氨基酸个数从几十到几百。这些来自不同物种的蛋白酶抑制剂都具有相 似的结构和功能。从分子的一级结构来看，具有一定的同源性( 袁春华等， 2 0 0 3 ) ，约有1 8 0 个氨基酸，分子量在2 0k d 左右，分子内只有两对二硫 键和一个与酶作用的活性位点。 3 1 3p i i 和p i 家族蛋白酶抑制剂 p i i 和p i 家族是一类创伤诱导类型表达的蛋白酶抑$ 1 齐u ( p l u n k e t te t a 1 ，1 9 8 2 ) 。其中p i i 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂i ( p o t a t op r o t e i n a s e i n h i b i t o r i ，p i i ) ，只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶；p i i i 家族 包括番茄蛋白酶抑制剂i i ( t o m a t op r o t e i n a s ei n h i b i t o ri i ，t i i i ) 和马铃薯 蛋白酶抑制剂i i ( p o t a t op r o t e i n a s ei n h i b i t o r i i ，p i i i ) ，均有两个活性中心， 可同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。 3 2 蛋白酶抑制剂的研究与应用 由于蛋白酶抑制剂的活性位点的突变频率比较高，所以导致抑制剂特 性的变化，同时显示了这些突变体可能对机体的防御系统有重要的调节作 用，因此它们在哺乳动物、植物和昆虫中被研究的最多，并且在许多领域 得以开发和应用。 3 2 1 动物蛋白酶抑制剂的研究与应用 高等动物的血液中存在多种蛋白酶抑制剂，据l a s k o w s k i d 等( 1 9 8 0 ) 证实每1 0 0m l 的血清中，各种蛋白酶抑制剂的总量超过2 0 0m g 。通常认 为，血液中存在的高含量的抑制剂对血液的凝结和其他蛋白水解的形成进 程如激素的产生、释放和补体的定位具有重要的作用。蛋白酶抑制剂可抑 制体内广泛分布的丝氨酸蛋白酶活性，起到调节炎性细胞因子释放、减少 炎细胞浸润、抑制血细胞激活和白细胞跨内皮迁移以及组织毒性物质释放 等作用，表现为多层次的抗炎效应。最近研究发现蛋白酶抑s s j n 能通过抗 7 家蚕抗胰蛋白酶基因可选择性剪辑的初步研究 过氧化反应、保存细胞能量、抑制炎性介质释放、抗蛋白水解等多种方式 发挥其功效，减轻组织器官损伤和炎性损伤。 首先，蛋白酶抑制剂具有抗炎抗感染的重要作用。在临床上应用最广 的是胰蛋白酶抑制剂( t r y p s i ni n h i b i t o r ，t i ) ，主要有：从牛肺或牛胰脏中 提取的抑肽酶( a p r o t i n i n ) 、人尿胰蛋白酶抑制剂( u r i n a r yt r y p s i ni n h i b i t o r ， u t i ) 及人工合成的假黄酸胍己苯酯及衍生物。其中u t i 能抑制许多对急 性胰腺炎起关键作用的酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶及磷 脂酶a 等，而且能抑制溶酶体酶，稳定溶酶体膜，从而起到保护胰腺的 作用；u t i 还有抑制脑血管通透性增高的作用，防脑血管破裂后迟发性脑 血管痉挛，预防脑、肺缺血再灌注引起的损伤( 凌贤龙，1 9 9 2 ) 。动物脏 器中提取的抑肽酶是一种特异性的蛋白酶抑制剂，在临床上用于治疗胰腺 炎、脑水肿、肺气肿，脑、肺、肠缺血再灌注损伤，心脏、子宫等术后出 血，烫、烧伤外用及肿瘤的辅助性治疗( 蔡祖花，2 0 0 0 ) 。 其次，蛋白酶抑制剂具有抗病毒感染的作用，可抑制h i v 的成熟、 感染新细胞及复制所必需的蛋白前体的裂解，阻止病毒f j 体多聚蛋白的分 裂，并干扰新病毒颗粒的成熟，使h i v 产生出不太成熟、无感染性的病 毒颗粒，且导致病毒繁殖的停止，阻止病毒的几率约为9 9 ( 张石革， 2 0 0 5 ) 。由于病毒颗粒仍处于未成熟状态中，故可延迟在h i v 细胞间的 蔓延。人巨细胞病毒( h c m v ) 属b 家族疤疹病毒，h c m v 蛋白酶为丝 氨酸蛋白酶类，在蛋白装配和病毒壳体成熟中有重要作用，所以h c m v 蛋白酶抑制剂是最有前景的抗病毒类药物之一( 徐萍等，2 0 0 0 ) 。 另外，蛋白酶抑制剂还可阻止发生新的病原感染，延缓疾病的进展。 主要表现在抗肿瘤方面，譬如从人尿中提取的胰蛋白酶抑制剂可与肿瘤细 胞上的q t i 受体结合，调节纤维蛋白酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的转 移。抑肽酶也可以作为肿瘤的辅助治疗药物；巯基蛋白酶抑制剂对胃癌体 外侵袭转移具有抑制作用( 沈洁等，1 9 9 9 ) 。 3 2 2 植物蛋白酶抑制剂的研究与应用 植物体内的蛋白酶抑制剂基因本身就是植物对害虫及病原菌侵染的 一种天然防御体系。在1 9 4 7 年，m i c k e l 和s t a n d i s h 就发现有些昆虫在取食 大豆后就不能正常生长、发育。之后b i r k 等人发现大豆浸提物可抑制拟谷 8 山东农业大学硕士学位论文 盗( t r i b o l i u mc o n f u s u m ) 幼虫的生长，并从中分离出一种抑制物，证明是 一种胰蛋白酶抑制剂，这一发现启示人们蛋白酶抑制剂可以作为一种新的 抗虫物质，从此人们开始了对蛋白酶抑制剂抗虫的研究。 自从1 9 8 7 年h i d e r ( h i d e re ta 1 ，1 9 8 7 ) 等人利用农杆菌叶盘转化法， 首次将豇豆蛋白酶抑制剂( c o w p e at r y p s i ni n h i b i t o r ，c p t i ) 的e d n a 转化到 烟草植株中并获得抗虫转基因植物以来，至今已有1 5 种不同来源的蛋白酶 抑制剂的e d n a 被克隆。其中大多是丝氨酸蛋白酶抑制剂，研究表明转基 因植株对昆虫都有明显的抗性。尤其是c p t i 的抗虫效果最好，而且抗虫谱 广，对鳞翅目、直翅目、鞘翅目等几乎所有的昆虫都有杀伤作用。大豆的 k u n i t z 型蛋白酶抑制剂为多基因家族，可抑制不同来源的胰蛋白酶活性， 尤其是对鳞翅目有较强的抑制作用( 李海燕等，2 0 0 0 ) 。此外，利用来源 于昆虫烟草天蛾( m a n d u c as e xt a ) 并经过适当改造的胰蛋白酶抑制剂基 因、胰凝乳蛋白酶抑制剂基因和弹性蛋白酶抑制剂基因也获得了具有抗虫 性的转基因烟草、棉花和苜蓿( t h o m a se ta 1 ，1 9 9 5 ) 等植物。 3 2 3 昆虫蛋白酶抑制剂的研究与应用 昆虫作为地球上出现最早、种类最多的动物群体，在生态系统中占有 重要的地位。在长期的进化过程中，形成了独特的防御系统。由于昆虫体 内没有高等动物所具有的淋巴细胞和免疫球蛋白，其分解异物的酶，特别 是蛋白酶及调控昆虫体内蛋白酶作用的蛋白酶抑制剂引起了人们普遍的 关注。 蛋白酶是所有昆虫体液中最重要的生化酶类，其主要功能是在昆虫的 生长、发育、蜕皮和变态过程中参与蛋白质的合成与降解，而蛋白酶的活 性又受到蛋白酶抑制剂( p i ) 的调节。最初，关于昆虫蛋白酶抑制剂的研 究仅仅是对其体液的粗提液中的蛋白酶抑制因子进行调查，后来才逐渐用 纯化的样品。p e a n a s k y 等( 1 9 6 0 ) 于1 9 6 0 年最早报道了来自蛔虫 ( a s c a r i s ，b i o c h i m ) 体内的蛋白酶抑制剂。次年，森田( 1 9 6 1 ) 等在家蚕 幼虫血液中分离纯化了一种对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制作用的蛋 白酶抑制剂。最近还发现了两个低分子量家族，一个是在家蚕中发现的 b o m b y x 家族，另一个是在蝗虫和小龙虾中发现的小分子s e r p i n 家族。来 自桑蚕血浆的真菌蛋白酶抑制f ( f p i f ) ，是第一个被定为b o m b y x 抑制 9 家蚕抗胰蛋白酶基因可选择性剪辑的初步研究 剂家族的成员，可以抑制枯草杆菌蛋白酶和来自昆虫病原体真菌的丝氨酸 蛋白酶，具有保护蚕体免受真菌感染的生理功能，f p i f 由血浆中纯化和 克隆，并在b a c u l o v i r u s 载体表达成重组蛋白( e g u c h i ，1 9 9 3 ) 。这些丝氨 酸蛋白酶抑制剂在调节昆虫免疫和其它生理功能方面发挥着重要的作用， 尤其是它们的直接抗菌活性越来越受到人们的关注。 3 3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 在长期的进化过程中，生物有机体合成了一系列抑制剂来调节相应的 丝氨酸蛋白酶的活性，它们参与调节了一系列生理和病理过程，包括消化、 降解、受精、纤溶、胚胎发育、激素活化、血液凝结、补体激活及细胞免 疫和体液免疫等( k r e me ta 1 ，2 0 0 2 ；r a w l i n g se ta 1 ，19 9 3 ；o ，b r i e ne ta 1 1 9 9 3 ) 。这些功能过程大部分是由丝氨酸以对丝氨酸蛋白酶形成的级联反 应进行调节，从而防止对机体有害甚至致死情况的发生。 丝氨酸蛋白酶抑制剂，作为独立的功能因子，抵抗外来入侵病原。在 入侵病原的体表存在一些对宿主而言有毒性的丝氨酸蛋白酶，宿主表面的 蛋白酶抑制剂可以抑制蛋白酶