细菌学检验分枝杆菌属.ppt

分枝杆菌属（Mycobacterium）,内容提要,分枝杆菌属概述,是一类细长微弯的细菌，因有分枝生长趋势而得名特点细胞壁含有大量的脂类（分枝菌酸）菌体不易着色，不易脱色，常采用抗酸染色，抗酸染色阳性（抗酸杆菌）营养要求高，生长缓慢无特殊结构，不产毒素，其致病性与菌体成分有关引起疾病都呈慢性，并伴肉芽肿,分枝杆菌属概述,分类,第一节结核分枝杆菌（M.tuberculosis),一、概述俗称结核杆菌(Tuberclebacilli，TB)，引起人类结核病有着三千年历史的古老疾病目前，全球约有1/3人口受结核杆菌感染，70%在亚洲。每年新发病例800万，300万人死于结核病结核病成为亟待解决的全球性公共卫生问题，是艾滋病高发区人群的首要死因,第一节结核分枝杆菌（M.tuberculosis),一、概述致病菌主要包括：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌。人型结核分枝杆菌感染的发病率最高我国是世界上结核病负担最严重的22个国家之一，每年25万死于结核，传染病之首世界防治结核病日3月24日,二、生物学性状,形态与染色细长略弯，分枝状荚膜对菌体有一定的保护作用抗酸染色阳性，菌体呈红色，背景呈蓝色,金胺O染色：在荧光显微镜菌体呈橘黄色L型菌：Much颗粒，多见于细菌的变异,结核杆菌电镜图,培养特性专性需氧，pH偏酸6.5-6.8营养要求高，常用罗琴氏培养基（选择性固体培养基，培养基所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长）生长缓慢，18h/代，2-4W可见菌落生长菌落特征：乳白或米黄，表面粗糙呈颗粒结节，边缘不整，呈“菜花样”菌落液体培基：表面生长成菌膜,二、生物学性状,二、生物学性状,生化反应不发酵糖类触酶试验阳性热触酶试验：将细菌悬液6830min，再加过氧化氢对区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌有重要意义结核分枝杆菌热触酶试验阴性,抵抗力四怕：对酒精敏感对湿热敏感对紫外线敏感对抗结核药物（链霉素、异烟肼、利福平等）敏感，但易产生耐药性,二、生物学性状,抵抗力四不怕：耐干燥耐酸碱耐染料对青霉素等抗生素耐药,变异性形态结构变异在异烟肼、溶菌酶等作用下形成L型（多形性）菌落变异R-S型变异，性状典型不典型，毒力减弱毒力变异：卡介苗BCG：Calmette和Gurin将牛分枝杆菌经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，用于预防结核病耐药性变异易发生，抗结核药物的结核菌株日益增多,二、生物学性状,三、致病性与免疫性,致病物质菌体成分，机体免疫病理损伤脂质存在细胞壁，含量与毒力平行索状因子（糖脂-分枝菌酸+海藻糖）：破坏细胞，引起肉芽肿磷脂：形成结核结节和干酪样坏死蜡质D（分枝菌酸+肽糖脂）：引起迟发性过敏反应硫酸脑苷脂：抑制吞噬体与溶酶体结合,三、致病性与免疫性,致病物质菌体成分，机体免疫病理损伤蛋白质有抗原性、本身无毒，如结核菌素蛋白质+蜡质D迟发型变态反应。组织坏死、全身中毒症状结核结节形成荚膜,感染方式多途径感染：呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体所致疾病结核病，疾病种类多样化，以肺结核常见,三、致病性与免疫性,所致疾病肺部感染：原发感染:多发生于儿童原发综合征：原发灶（肺泡渗出性炎症）、淋巴管炎和肿大的肺门淋巴结纤维化和钙化而自愈复发：内源性感染的来源,三、致病性与免疫性,所致疾病肺部感染：继发感染:多发生于成人，内源性感染病灶多局限，不累及邻近淋巴结干酪样坏死和空洞，菌可随痰排出，开放性肺结核,三、致病性与免疫性,空洞,干酪样坏死,所致疾病肺外感染：免疫力低下患者常见于脑、肾、骨、关节、生殖系统。脑结核、肾结核、淋巴结核、皮肤结核等痰菌被咽入消化道或食入了消毒不严格的牛奶也可引起肠结核、结核性腹膜炎等少数形成全身粟粒性结核或播散性结核,三、致病性与免疫性,免疫性传染、免疫、超敏反应共存人体对该菌有较强免疫力（感染率高，发病率低）主要是细胞免疫，有菌免疫细胞免疫与迟发型超敏反应同时存在,三、致病性与免疫性,免疫性结核菌素试验（Tuberculintest)（OT试验）原理：是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起迟发型超敏反应的一种试验，以判断机体对结核有无免疫力试剂：旧结核菌素（OT）-主要成分是结核杆菌蛋白纯蛋白衍生物（PPD）方法：前臂皮内注射OT或PPD5单位，48-72h后观察,三、致病性与免疫性,免疫性结核菌素试验（Tuberculintest)（OT试验）结果：阳性：红肿硬结直径5mm，表明曾感染过结核杆菌/接种BCG强阳性：直径15mm，表明可能有活动性结核阴性：直径5mm，表明无结核感染，但应排除原发感染的早期、老年人、严重结核患者或同时患有其它传染病、获得性免疫功能低下等情况,三、致病性与免疫性,免疫性结核菌素试验（Tuberculintest)（OT试验）应用：选择卡介苗接种对象、测定卡介苗接种后的免疫效果了解人群自然感染率作为婴幼儿结核病的辅助诊断测定肿瘤患者的细胞免疫功能,三、致病性与免疫性,四、微生物学检查,四、微生物学检查,标本采集清晨第一口痰送检无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检脑脊液标本静置后，表面有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,四、微生物学检查,检验方法直接涂片染色镜检：常用的简易快速检查方法齐-尼抗酸染色：痰涂片要厚，观察至少100个视野。结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色金胺O染色：荧光显微镜下见金黄色荧光的结核分枝杆菌，结果快速准确结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”,齐-尼抗酸染色结果报告方式,四、微生物学检查,检验方法核酸检测用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染特异性与敏感性均大于95抗PPDIgG的检测ELISA法检测患者血清中抗PPDIgG可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法，阳性率为8090,四、微生物学检查,检验方法分离培养无杂菌污染的标本：脑脊液、胸腹水等可直接或离心后取沉渣接种有杂菌污染的标本在接种到培养基之前须做4%NaOH处理15min，以消除杂菌的干扰标本接种于罗琴培养基。37，510CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核分枝杆菌。阴性继续培养至12周方可报告,检验方法,四、微生物学检查,检验方法菌种鉴定：可为结核病和非典型分枝杆菌病的临床鉴别和防治提供科学的依据PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)DNA探针16srRNA基因序列测定高效液相色谱(HPLC)检测,四、微生物学检查,检验方法动物接种可用于结核分枝杆菌的分离和毒力测定此法敏感可靠，但手续较繁琐，不能列为常规常用的豚鼠在接种后3-4周出现局部淋巴结肿大，身体消瘦，结核菌素试验转为阳性剖检时可看到淋巴结、肝、脾、肾、肺等脏器的典型结核病变，由病变处可查到抗酸杆菌或经培养有结核分枝杆菌生长,四、微生物学检查,检验方法药物敏感性试验耐药株的增多，应做药物敏感性试验，以指导临床合理用药。将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基（改良罗氏培养基）上，同时做不含药物的对照组常用方法：绝对浓度法（间接法）、比率法,药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）,我国30多年来一直沿用的常规药敏试验方法。1.菌悬液制备：（1）临床分离分枝杆菌的新鲜培养物（初生长2周），初生长2周后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取23周的亚培养物进行试验。（2）菌悬液制备：取上述培养物（需刮取斜面各个部分）放玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以0.5%吐温-80生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管比浊配成1mg/ml的菌悬液。,药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）,2.含药培养基制备：改良罗氏培养基每100ml加入1ml抗结核稀释药液，制成含不同药物尝试的培养基斜面备用。3.接种：将制备的菌悬液10倍稀释至10-2mg/ml，以灭菌吸管准确吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为10-3mg/ml。置37培养四周观察结果。,药物敏感性试验绝对浓度法（间接法）,4.菌落生长情况：同分离培养（以-、+、24+）。5.药敏结果判断：低浓度含药培养基分枝杆菌未生长者报告敏感（S），生长（1+）以上者报告耐药（R）。6.质量控制：每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv敏感株）10-3mg/ml检测含药培养基质量。要求对照培养基菌落数在200个以上且无融合，若菌落数低于50个时，要求重新作药敏试验。,药物敏感性试验,比例法：是世界卫生组织（WHO）全球结核病耐药监测项目统一推荐的方法。1.培养基制备：同上述绝对浓度法。培养基药物中药物终浓度为：异烟肼0.2mg/ml，双氢链霉素4mg/ml，利福平40mg/ml，乙胺丁醇2mg/ml。2.菌液：新鲜菌落制成1.0mg/ml菌悬液，依次稀释至10-2和10-4mg/ml。3.接种：分别接种10-2和10-4mg/ml菌液0.01ml至对照及含药培养基斜面。4.培养：37培养4周,药物敏感性试验,比例法：5.结果的判读、解释和报告：计算耐药百分比，即含药培养基上菌落数与无药培养基上菌落数相比的百分比。耐药百分比(含药培养基上菌落数)/(对照培养基上菌落数)100%)。1%者报告敏感（S），1%者报告耐药（R）。,五、防治原则,预防：一般性预防：卫生宣传、提高机体抵抗力特异性预防：发现和治疗痰菌阳性者新生儿和结核菌素试验阴性的儿童接种卡介苗治疗：一般治疗：合理营养，注意休息抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平等治疗原则：早期、联合、适量、规律、分阶段治疗和坚持全程,第二节非典型分枝杆菌,是指结核和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。因具有抗酸性，故又称非典型抗酸性菌。广泛分布于外环境和人及动物的机体中。已发现17种以上能引起人类疾病，引起的肺部感染,又难以与结核分枝杆菌感染区别，并对常用抗生素和抗结核药物耐药，所以区分鉴别非典型分枝杆菌具有重要的意义。,一、光产色分枝杆菌,特点是在暗处不产生色素，光照1h后能在48h内，菌落转为黄色或橘黄色。对人有致病性的是：堪萨斯分枝杆菌：广泛分布于水和土壤中,能引起肺内外结核样的病变。海分枝杆菌：为水中的腐生菌。通过皮肤微小创口侵入，引起所谓的“游泳池肉芽肿”。猿分枝杆菌：先后从猿和人体分离出此菌。,二、暗产色分枝杆菌,有光或无光均能产生色素，呈黄色或橘黄色。对人有致病性的为：瘰痢分枝杆菌：25-37均可生长，35最为适宜，45则不能生长。可引起人淋巴结炎或肺部感染。苏尔加分枝杆菌：37时为暗产色，25时为光产色。本菌引起成人肺部的慢性感染。,三、不产色分枝杆菌,不能产生色素。对人有致病性的是：鸟-胞内复合分枝杆菌(MAC/MAIC)：AIDS患者易感染，对抗结核药物不敏感或产生耐药。溃疡分枝杆菌：通过创伤感染，四肢伸侧形成无痛性溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。蟾分枝杆菌：为蟾蜍肉芽肿的病原菌。多引起老年男性的慢性肺部感染。,四、迅速生长分枝杆菌,在普通培养基上生长速度快，生长温度为25-45，对人有致病性的是：偶发分枝杆菌：可引起人局部或肺部感染，对现有的抗结核药物均有耐药性。龟分枝杆菌：可引起人的软组织病变及手术后继发感染，亦可引起肺部感染。,非结核分枝杆菌检验程序,第三节麻风分枝杆菌（M.leprae）,一、概述俗称麻风杆菌，引起麻风病，是一种慢性传染病流行广泛，主要分布在亚、非和拉丁美洲,二、生物学性状,形态与染色其大小、形态、染色均与结核杆菌类似，但菌体略粗抗酸染色阳性，呈束状或团状排列典型的胞内寄生菌。多存在于细胞内麻风细胞（有大量麻风杆菌存在的感染细胞，呈泡沫状）,培养特性目前体外人工培养尚未成功动物模型：犰狳，对该菌高度易感，接种后引起瘤型麻风。人对该菌抵抗力强，接触者仅少数发病,二、生物学性状,三、致病性,所致疾病麻风病，是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢的损害，晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿人类为唯一宿主和唯一传染源，致病因素不清,三、致病性,所致疾病传染源：病人（瘤型麻风病人通过皮肤黏膜及外分泌液向外排菌）。传播途径：皮肤、黏膜、呼吸道及密切接触潜伏期：2-5年，长者