（发育生物学专业论文）优良啤酒酵母菌株的选育及运用rapd技术鉴定酵母突变株的初探.pdf

优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术豁定酵母突变株的初探 摘要 障酒酵母是保证峰潘质量的关键，麟此优良蹿酒酵母藏种的选育具有重要的 意义。本文在含甲磺隆( s m ) 的培养基上分离抗s m 自发突变酵母菌株；用氩 激光、甲基磺酸乙酯和亚硝酸诱变啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 后，在 含1 7 5m g l q 双乙酰或0 0 1 2 脱氧葡萄糖的培养基上分离突变株；筛选具有发 酵度较高、总高级醇生成量适中、低产双乙酰、低产乙醛等特性，盈遗传性稳定 的优良菌株，并测定了优良菌株的转化酶和双乙酰还原酶的活性，以及运用 r a p d 分子标记技术对优良突变株及其亲株进行r a p d 分析。 从实验室保藏的啤酒工业酵母菌种分离s m 抗性自发突变株，筛选得到几株 优良的突变株。其中s m 抗性株z t l 4 9 1 和z t 2 1 9 2 的5 0 0 l 发酵罐发酵试验 结果表明，它们的发酵度较高，发酵液中的主要风味物质双乙酰、乙醛、总离级 醇和乙酸的含量均符含优质啤酒的要求，发酵的酒液口感都较好。与其亲株对比， s m 抗性株z t 2 1 9 2 和z t l 4 9 1 的勉玢基因中分别有7 个和9 个碱基发生突变， 而且都有3 个g ( 鸟嗓呤) 、2 个t ( 胸腺嘧啶) 和1 个c ( 胞嘧啶) 发生突变。 用氩激光诱变啤酒酵母b x 2 4 和j w n i 4 ，筛选得到几株发酵特性优良的突 变株。其中突变株a g l 4 1 7 的5 0 0 l 发酵罐发酵试验结果表明，发酵1 1 天发酵 液的发酵度为6 9 6 ， 双乙酰、乙醛、总高级醇和乙酸的含量分别为0 0 2 3 0 m g l 、1 3 7m g l 一、6 3 2 8m g l 1 和8 4 5m g 1 。菌株a g l 4 1 7 生产的啤酒具 有璺酒花油香味、口感柔和、协调，有很好的应用静景，鳓静正在扩大发酵规模 作进一步试验。 用甲基磺酸乙酯( e m s ) 诱变菌株b x 2 4 和j w i 3 ，筛选得到几株发酵特性 优良的突变株。其中突变株e d 2 4 4 2 发酵1 l 天发酵液的发酵度为6 9 7 ，双乙 酰、乙醛、总藏级醇和乙酸的含量分别为0 0 2 9 0m g l 一、3 1 3m g o 、7 2 。9 3m g l 1 和8 7 7 5m g l 。该菌株生产的啤酒口感较好，有很好的应用f j 景。 雳亚硝酸诱变啤洒酵母j y 2 2 ，筛选褥到凡株发酵特性优良的突变株。其中 突变株n g 2 2 ，5 ，用5 0 0 m l 三角瓶装3 0 0 m l l1 5 0 b x 麦汁在1 2 0 c 下发酵8 d ，发 酵度为6 7 3 ，发酵液的双乙酰( g 。0 5 7 9m g - l ) 、乙醛( 5 。6 1m g o 和高级醇 ( 7 6 6 6m g l q ) 的含量分别比出发菌株j y 2 2 的降低1 7 4 0 、1 4 8 7 和1 5 1 7 ， 该菌株有待扩大发酵规模进一步考察其发酵性能。 优良啤酒酵母诸株的选育殿运用r a p d 技术鉴定酵母突变株的韧探 对所获得的优良突变株及英亲株的转化酶和双乙酰还原酶静活性分析结果 显示，优良突变株的这两种酶的活性都比其亲株的高。菌株的r a p d 分析表明， 菌株j w n l 4 与a g l 4 1 ，7 、菌株b x 2 4 与e d 2 4 4 2 、菌株j y 2 2 与n g 2 2 5 的 遗传相似系数分别为：0 7 7 7 、0 7 9 3 、o 7 6 9 ，说明突变株与其亲株具有密切的亲 缘关系，但它们在d n a 水平上也存在显著的差异。 关键词：啤酒酵母，菌种选育，转化酶，双乙酰还原酶，尼陀基因，r a p d 分 析 2 优良啤酒爵擎母菌株的选育及运用r a p d 技术浆定酵母突变株的初探 a b s t r a c t b r e w e r sy e a s ti st h ek e yf a c t o rt h a tg u a r a n t e st h eq u a l i t yo fb e e r 。s ot h es e l e c t i o n o ft h ef i n es t r a i n si ss i g n i f i c a n t t h es u lf o m e t u r o nm e t h y l ( s m ) 一r e s i s t a n tb r e w e r s y e a s ts p o n t a n e o u sm u t a n t sw e r ei s o l a t e do nt h et h ep l a t ea g a rc o n t a i n i n gs m s a c c h a r o m y c e sa e r e v i s i a e s t r a i n sw e r em u t a t e db ya r g o n - l a s e r ，e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e ( e m s ) a n dn i t r o u sa c i d , r e s p e c t i v e l y t h em u t a n t sw e r es e p a r a t e do nt h e p l a t ea g a rc o n t a i n i n gd i a c e t y l17 5m g l qo r0 01 2 - d e o x i g e ng l u c o s e ( 2 一d g ) t h e f i n es t r a i n s 诹t hl l i g hf e r m e n t a t i o nd e g r e e ，s u i t a b l ec o n t e n to ft o t a lh i g h e ra l c o h o l s ， l o wc o n t e n to fd i a c e t y la n da c e t a l d e h y d ei nt h ef e r m e n t e dl i q u i d ，a sw e l la ss t a b i l i t y h e r e d i t yw e r es c r e e n e d 。t h ea c t i v i t i e so fi n v e r t a s e sa n dd i a c e t y lr e d u c t a s e so ff i n e m u t a n t sa n dt h e i rp a r e n ts t r a i n sw e r ed e t e r m i n e d t h em u t a n t sa n dt h e i rp a r e n ts t r a i n s w e r ea n a l y z e db yr a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) s u l f o m e t u r o nm e t h y l ( s m ) 一r e s i s t a n ts p o n t a n e o u sm u t a n t sw e r ei s o l a t e df r o mt h e b r e w e r sy e a s ts t r a i n sk e p ti no u rl a b o r a t o r ya n ds e v e r a lf i n es t r a i n sw e r eo b t a i n e d a f t e rs c r e e n i n g t h ef e r m e n t a t i o no fs m - r e s i s t a n tm u t a n t sz t l 4 - 9 - 1a n dz t 2 1 9 2i n 5 0 0 lf e r m e n t o rs u g g e s t e dt h a tt h e i rf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sw e r ea c c o r d i n gw i t h t h ed e m a n d so ft h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n t h es e n s o r ye v a l u a t i o no ft h eb e e rp r o d u c e d b yt h e mw a sb e t t e rt h a nt h a to fp r o d u c i n gs t r a i n c o m p a r e dt h ed n as e q u e n c e so ft h e l l y 2g e n eo fs m - r e s i s t a n tm u t a n t sz t 2 1 - 9 - 2 ，z t l 4 - 9 1a n dt h e i rp a r e n ts t r a i n s ，i t w a sf o u n dt h a tt h e r ew e r es e v e na n dn i n eb a s e sm u t a t i o n sr e s p e c t i v e l ya n dt h e c o m m o nc h a r a c t e r so fm u t a t i o no ft h r e eg u a n i n e s ( g ) ，t w ot h y m i n e s ( t ) ，a n do n e c y t o s i n e ( c ) i nt h e 豇汜g e n eo f z t 2 1 9 - 2a n dz t l 4 9 1 a n t i g l u c o s er e p r e s s i o n m u t a n t sa g14 - - 1 7w i t h g r e a t f e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c sw a ss c r e e n e da f t e r a r g o n l a s e rm u t a g e n e s i s t h ef e r m e n t a t i o no f m u t a n t sa g l 4 - 1 7i n5 0 0 lf e r m e n t o rf o r11d a y ss u g g e s t e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o n d e g r e eo fm u t a n ta g 14 1 - 7w a s6 9 6 ，t h ec o n t e n t so fd i a c e t y l ，a c e t a l d e h y d e ，t o t a l h i g ha l c o h o l sa n da c e t a t ei nt h ef e r m e n t e dl i q u i dw e r er e s p e c t i v e l y0 0 2 3 0m g l ， 1 3 7m g l 1 ，6 3 2 8m g l 。1a n d8 4 5m g l 。1 t h eb e e rp r o d u c e db ys t r a i na gi4 ，1 7 w a so ft h ep r o p e r t yo ft 3 一h o p so i lf r a g r a n ts m e l la n ds o f tm o u t hf e e l 。 3 优良啤酒酵母蒲株的选育及运用r a p d 技术鉴定辩母突变株的初探 s e v e r a lf i n em u t a n ts t r a i n sw e r eo b t m n e da f t e r m u t a t i n gs a c c h a r o m y c e s a e r e v i s i a es t r a i n sb x 2 4a n dj w l - 3b ye m s t h ef e r m e n t a t i o no fd i a c e t y l - r e s i s t a n t f i n em u t a n t se d 2 4 - 4 2i n5 0 0 lf e r m e n t o rf o r11d a y ss u g g e s t e dt h a tt h ef e r m e n t a t i o n d e g r e eo fm u t a n te d 2 4 4 2w a s6 9 7 ，t h ec o n t e n t so fd i a c e t y l ，a c e t a l d e h y d e ，t o t a l h i g ha l c o h o l sa n da c e t a t ei nt h ef e r m e n t e dl i q u i dw e r er e s p e c t i v e l y0 0 2 9 0m g l ， 3 1 3m g l 。1 ，7 2 。9 3m g l 1a n d8 7 7 5m g l 。1 t h es e n s o r ye v a l u a t i o no ft h eb e e r p r o d u c e db yt h em u t a n te d 2 4 4 2w a sn i c e t h em u t a n te d 2 4 4 2i so fp o t e n t i a l l y a p p l i c a b i l i t yt ob e e rb r e w i n g 。 t h es t r a i nj y 2 2w a sm u t a t e db yn i t r o u sa c i d s e v e r a lf i n em u t a n ts t r a i n sw e r e o b t a i n e da f t e rs c r e e n i n ga n dt h ef e r m e n t a t i o nc h a r a c t e ro fa n t i - g l u c o s er e p r e s s i o n m u t a n tn 0 2 2 - 5w a st h eb e s ta m o n gt h em u t a n t s t h ef e r m e n t a t i o no fm u t a n t s n g 2 2 - 5i n5 0 0 m lf l a s kw i t h3 0 0 m l11 5 0 b xw o r ta t12 0 cf o r8d a y ss h o w e dt h a tt h e f e r m e n t a t i o nd e g r e ew a s6 7 3 ，t h ec o n t e n to fd i a c e t y l ，a c e t a l d e h y d ea n dt o t a lh i g h e r a l c o h o li nt h ef e r m e n t e dl i q u i dw e r e0 0 5 7 9m g l 。1 5 6 1m g l a n d7 6 6 6m g l ， 17 4 0 ，14 4 8 a n d15 17 l o w e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls t r a i nj y 2 2r e s p e c t i v e l y i no r d e rt oi n s p e c tf u r t h e rt h e c h a r a c t e r so f b e e rb r e w i n go fm u t a n ts t r a i nn g 2 2 - 5 ，t h e t e s te x p a n d i n gf e r m e n t e ds c a l ew i l lb ep e r f o r m e d t h ea n a l y s i sr e s u l t so fa c t i v i t i e so fi n v e r t a s e sa n dd i a c e t y lr e d u c t a s e so ff i n e m u t a n t si n d i c a t e dt h a tt h ee n z y m a t i ca c t i v i t i e so ft h em u t a n t sw e r es t r o n g e rt h a nt h a t o ft h e i rp a r e n ts t r a i n s 。t h eg e n e t i cs i m i l a r i t yb e t w e e ns t r a i nj w n1 4a n da g14 1 7 ， b x 2 4a n de d 2 4 4 2 ，j y 2 2a n dn g 2 2 5a n a l y z e db yr a p dw e r er e s p e c t i v e l yo 7 7 7 ， o 。7 9 3 ，0 7 6 9 ，i tw a sp r o v e dt h a tt h et h e r ew e r ec h o s e l yg e n e t i cr e l a t i o n s h i p sb e t w e e n m u t a n ts t r a i n sa n dt h e i rp a r e n ts t r a i n s ，b u ta l s or e m a r k a b l ed i f f e r e n c e sa td n al e v e l k e y w o r d s ：b r e w e r sy e a s t ，y e a s ts e l e c t i v eb r e e d i n g ，i n v e r t a s e s ，d i a c e t y lr e d u c t a s e s ， l l y 2g e n e 。r a p d 4 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本入在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ：曾垮 ，口吕年占月够日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解r - - g f l 大学有关保留、。使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密) ( 请在以上相应括号内打4 ) 日期：争4 衫年玉月搴日 日期：夕t 7 略年f 月墨e l 一， 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术然定酵母突变株的初探 第一章前言 一、啤酒的历史 人类有文字记载的历史有5 0 0 0 年左右，但人类酿造啤酒的历史可以追溯到 1 0 0 0 0 年前的创世之初，即人类开始种植谷物的时代i n 。古代啤酒的成因众说纷 纭，莫衷一是。但有一点是毋庸置疑的，大麦是啤酒诞生的首要条件。古代的啤 酒原料主要是大麦，其次是小麦和黑麦，所以那时的人们把它叫麦酒、大麦液、 大麦酒。产生啤酒的另一个先决条件是容器。那时的陶器是古人生活中的必需品， 新石器时代最重要的新技术之一就是发明了陶器。 唣酒的历史非常的悠久，可以说啤酒是历史上记录最晕的世界性饮料。古蒂 腊哲学家柏拉图曾说过，发明啤酒的人是最大的智者。如果说中东远古的苏美尔 人发明了啤酒的话，那么古埃及人将啤滔作为日常饮品，创造了古代啤酒的辉煌； 由子宗教的原因，当古代啤酒在中东消失之时，欧洲人在漫长的中世纪，建立了 无数的啤酒作坊，保整了啤酒的火释；躁尔曼人薪火相传，以他们无穷的智慧发 展了啤酒，率先将啤酒花应用于啤酒酿造，形成了现代啤酒的概念。1 7 世纪开 始，啤酒的火种从欧洲擞向全世界星火燎原。啤淄最终成为名副其实的世赛饮品， 从而造福全人类1 2 1 。 1 9 世纪末，洋啤酒随着坚船剽炮褥以登陆中西市场，上海街头出现了欧洲 来的“皮”酒广告。1 9 0 0 年开始，俄国人和德国人相继在哈尔滨和青岛设立啤酒 作坊和小型工厂生产嚓酒。1 9 0 4 年，哈尔滨出现了首家中国入办的啤酒厂：东 北三省啤酒厂，迈出了中国啤酒业的第一步。1 9 1 5 年之后，中国人在北京、烟 台、上海、广州等遗陆续建厂，实现洋啤酒国产化，意义十分深远 3 1 。解放质， 中国啤酒业得到了迅速的恢复和发展。改革开放后，啤酒产量更是突飞猛进。 二、啤酒的营养功潮 啤酒消费的增长和啤酒工业的发展不仅与经济发展水平相适应，也与啤酒的 营养价值丰富，是一种健康的饮料酒有关。啤酒中糖和蛋白质豹眈例最符合人类 的营养平衡，所含蛋白质几乎完全被人体吸收和利用。每升啤酒的热量可达4 3 0 卡，相当子6 ，7 枚鸡蛋、o 7 5 升牛奶或5 0 克奶油。啤酒含有1 7 种氦基酸，多种 维生素及矿物盐等物质。 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术鉴定酵母突变株的初探 1 9 7 2 年7 月1 日在墨西哥召开的第九次世界营养食品会议上，把啤酒正式 列为营养食品【4 1 。这是因为，啤酒具备营养食品三个重要条件：( 1 ) 啤酒含有多 量和多种氨基酸；( 2 ) 啤酒含有较高的发热量；( 3 ) 易被人体消化和吸收。 啤酒的营养特点( 1 ) 卫生：啤酒是以麦芽、大米、酒花、啤酒酵母和水为 原料，在不锈钢设备中经过精心酿造而成，整个生产过程卫生监控严格，环境清 洁，不添加人工化学制剂、色素和防腐剂，是绝对可靠的天然纯食品。( 2 ) 防病： 加速新陈代谢：啤酒中低含量的酒精、核酸能增加大脑血液的供给，扩张冠状 动脉，并通过提供的血液对肾脏的刺激而加快人体的代谢活动；预防高血压： 啤酒是低钠饮料，可减少人体对钠的过量吸收而预防高血压；减少心脏病发病 机率：据美国加州奥克兰大市的帝王永久医疗中心的试验表明，啤酒中的叶酸有 助于降低人们血液中的半胱氨酸，而半胱氨酸含量高是心脏病诱发因素之一。( 3 ) 酒花是”绿色黄金”：波兰医学家认为啤酒花可治失眠症、神经衰弱症、骨质疏松、 动脉硬化及消化不良等症，用啤酒花泡茶能辅助治疗肾脏疾病：近年来，日本又 大量报导了酒花具有抗癌作用，因此酒花有”绿色黄金”之称。( 4 ) 延缓衰老：现 代医学研究发现，人体中代谢产物一超氧离子和氧自由基的积累，会引发人类的 心血管、癌症和加速衰老。啤酒中存在着多类抗氧化物质，例如谷胱甘肽可消除 人体内的氧自由基，是人们公认的延缓衰老的有效物质，荷兰科学家甚至认为啤 酒保健作用更优于葡萄酒。( 5 ) 利尿：啤酒富含矿物质，可保持人体细胞内外渗 透压平衡，有利于人们解渴和利尿。 三、我国啤酒工业的现状和展望 啤酒工业属于轻工业。而轻工业是我国消费品工业的主体。我国已成为世界 轻工产品生产大国，一些主要产品产量居世界前列，例如啤酒的产量就位居世界 首位。近2 0 年来，我国经济大发展，迎来了啤酒业的黄金时期。1 9 9 3 年啤酒产 量1 3 0 0 万千升，超过德国，居世界第二位；2 0 0 2 年产量2 3 7 5 万千升，超过美 国，成为世界第一啤酒生产大国【5 】，2 0 0 7 年仅1 月至6 月的啤酒累计产量为1 8 7 1 1 万千升，比2 0 0 6 年同期增长1 6 1 6 。中国是一个啤酒产销大国，啤酒产销量连 续5 年位居世界第一，以至于国外诸多资本纷纷涌入；但我国又是一个啤酒小国， 在世界许多国家的主流消费场所，人们都很难找到中国品牌的身影。而且，我国 啤酒产量的绝对值虽然相当大，但人均啤酒消费量却低于世界水平。因此，我国 6 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术撩定酵母突变株的初探 啤酒市场的潜力巨大。 基前，我国啤酒工鲎发展呈现新的特征：啤酒企业规模不断扩大，集团纯、 规模化稳步发展。随着我国啤酒工业的发展，从2 0 0 1 年开始，我囡啤酒出1 3 量 连年增加，到2 0 0 3 年出口量达到1 5 万千升，凄秘额达7 6 0 0 万美元，超过避霞 量和进口额。青岛啤酒是我国出口啤酒最多的企业，占全国出口总量的5 0 以上， 在海外深受欢迎。青岛啤酒、嘉士伯、深圳金威、啥容滨啤酒和燕京啤酒等矗个 品牌出口量占全国出口总量的8 6 。 虽然我圈啤酒工业发展迅速，但我酒啤酒工鼗还存在一些翔题：啤酒行业经 济效益未能随产量同步增长，岛国际先进水平相比仍有较明显的差异。今后必须 坚持品牌建设，以品牌竞争取代价格竞争，建立企业核心竞争力。建立企监核心 竞争力之重要的方面，是产品应具有较强的差异性，生产技术保持相对优势地位， 从露为消费者提供更宥特色的哮酒阍。 四、影响啤酒风味的主要物质 啤酒发酵分为主发酵期和成熟期两个阶段。在主发酵期，啤酒酵母将麦芽汁 转化成嫩啤酒并代谢形成风味物质。成熟期是指酵母停止生长到啤酒澄清这一阶 段，传统的方法是将啤酒在低温下贮存3 - 6 周。在此期间发酵液中的二氧化碳达 到饱和，不溶物质通过沉降除去，胶体稳定性得到改善和啤酒风味成熟。其中除 了风味成熟，其它各项均能在短时间内完成，如采用人工充c 0 2 、离心法分离酵 母、添加一些非生物稳定剂( 硅胶、单宁酸、蛋白酶等) 吸附、沉淀及分解那些高 分子蛋白质和多酚物质，从而达到缩短后酵时间并满足以上后酵和贮藏的目的。 因此，啤酒的风味成熟成为啤酒后酵和贮藏的时间限制因素，如果能缩短啤酒风 味的成熟时间，就可以减少啤酒的总发酵时间。啤酒风味不成熟不是由于缺少某 些物质，而是由于在主发酵期间，酵母代谢产生影响啤酒风味的某些代谢物质没 有排除到人们能够接受的程度。啤酒风味成分主要有挥发性酯类、醇类、羰基化 合物、酸类、酚类化合物及含硫化合物等，来源于啤酒的原料大麦芽及其它谷物 辅料、酒花和酵母的发酵作用。 1 、双乙酰 双乙酰是啤酒发酵过程中酵母菌产生的一种代谢副产物，它在啤酒中的含量 超过其闽值就会给啤酒带束种馊饭味，因此双乙酰是影响啤酒质量的关键因素 7 优瞧啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术鉴定酵母突变株的初探 之一，也是决定啤滔成熟与否的重要标志。双乙酰的风味阂傻( 0 。l m g l q ) 毙较 低，对淡爽型的淡色储减啤酒来说，双乙酰含量以控制在0 1 m g l 1 以下为宜， 对高档啤酒昀要求，最好控制在0 0 5 m g l 一以下【硼。在啤酒中，双乙酰的含量不 仅影响啤酒的风味，而且它的积累与还原还影响啤酒的成熟度，成为缩短啤酒发 酵周期的重要限制因素。因此，选商低双乙酰哮酒酵母菌种具有降低成本、提高 生产能力的重要意义。 1 。1 双乙酰的形成 由图1 1 可见，双乙酰是酵母异亮氨酸、缬氨酸生物合成途径中的副产物， 是由洳乙酰乳酸经非酶促的氧化脱羧反应自发产生的。研究结果洚l 表明，所有测 定过的酵母及其他微生物在形成缬氨酸的过程中均产生过量的a 乙酰乳酸。原因 是催化乙酰乳酸的一个碳原子转移到邻位碳原子还原成二羟基异戊酸( d h i v ) 的乙酰乳酸还原异构酶( 刚) 其效率非常之低。这样使前体物质洳乙酰乳酸积累， 部分分泌出细胞进入啤酒中，慢慢转化威连二酮双乙酰。一部分双乙酰又被 酵母吸收还原成乙偶姻( 3 羟基丁酮) ，然后还原成丁二醇( 见图1 2 ) 。乙偶姻 在啤酒中的含量 醚低( 1 5 2 0m 扩l 。为正常值) ，且昧闽值较高( 5 0m g l 一) ，2 ， 3 丁二酵的昧阂值也较高，因此它们对啤酒风味几乎没有不良影响1 9 j 。从图l 。2 ， _ 中还可以看出，乙酰乳酸脱羧酶( a c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e ) 可以直接将乙酰乳 酸降解成乙偶姻，而不形成双乙酰，但遗憾的是啤酒酵母中不含有此酶。 8 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术龆定酵母突变株的初探 苏氨酸m n 珏l 苏氨酸脱氮酶 两瞄辫 酮1 酸k b丙酮酸 2 , 3 - - 戊二二醇 异是氨酸l i e 缓氨酸 蹇蘸酸2 一丁二尊 注：细胞内| | 细胞井 圈1 1 酵母中异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成途径及双乙酰的形成9 l f i g 1 1b i o s y n t h e s i so fi s o l e u c i n e ，v a i n ea n dl e u c i n ea n df o r m a t i o no f v i c i n a ld i k e t o n ei ny e a s t 黼萄帮 话性乙醛 l i 工i 酮缎 l 建一乙酝乳酸食成酶a 疆嘲 口一乙酰乳酸一一缬氨酸 非酶链化脱羧la 一乙缴乳陂脱羧酶 双乙溉己偶则 l 烈乙蹴还原酶 乙稿娴 l 乙孵脱缴酶 2 ，3 一。墨4 酶 图1 2 啤酒中双乙酰的产生及降解的主要反应过程 f i g 1 2t h e f o r m a t i o na n dr e m o v a lo fd i a c e t y ld u r i n gt h eb e e rb r e w i n g 2 啤酒发酵中双乙酰的控制 9 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术鉴定酵母突变株的初探 。2 。l 选用优良的酵母菌种 0 【乙酰乳酸是双乙酰的前体物，催化0 【乙酰乳酸生成的酶是小乙酰乳酸合成 酶。不同酵母菌株具有不同的伐乙酰乳酸合成酶活力，形戒双乙酰前体物质的差 异很大。因此要使啤酒中的双乙酰含量降低，应选用较低的0 【乙酰乳酸合成酶活 力的菌株。编码静乙酰乳酸合成酶( e g4 1 3 1 8 ) 的基因己被鉴定，命名为勉堙， 它位于酵母细胞染色体x i i 上【l l 】。 就同一酵母菌株而言，接种量愈高，新生细胞忿少，双乙酰嚣体物质形成的 峰值也愈低。在同等条件下，强壮的酵母对双乙酰的还原能力大；反之，若酵母 衰退、发酵迟缓、贮存时间长或高温贮存，则发酵力就弱，其还原双乙酰的能力 低，生成双乙酰的量就多。凝集性强、沉淀快和分散不良的酵母，还原双乙酰慢。 酵母交界，混有呼吸缺陷型的小菌落变异株( p e t i t e ) 会增加了i d c 乙酰乳酸的积累和 减少对双乙酰的还原，足以使双乙酰含量远远超过其味阂值。因为这种变异株不 同程度地降低了缬氨酸、异亮氨酸生物合成途径中的各种酶的活力。 1 2 2 优化发酵工艺 有关啤酒发酵过程中啤酒酵母代谢产物双乙酰形成的控制与调节已有许多 研究报道f 1 2 - 1 4 1 。下面就一些发酵条件对双乙酰形成的影响作一简要介绍 控制麦汁质量：作为双乙酰形成的前体物质0 c 乙酰乳酸，是缬氨酸生物合成 中的副产物，增加发酵液中缬氨酸的含量，就可以反馈抑制酵母中a 一乙酰乳酸形 成，减少双乙酰的生成量，降低酵母的还原负荷，而啤酒发酵液中缬氨酸的含量 是随麦芽汁中c t 氨基酸的含量增高而增加的，因此，适当提高麦芽汁中伐氨基酸 的含量，就可以在一定程度上减少发酵液中双乙酰的含量。一般认为，麦芽汁中 攫氨基酸控制在1 8 0 2 0 0m g l 以时，可以减少发酵过程中双乙酰的形成。 控制麦汁的p h 值：将接种麦汁的p h 值降低至4 4 左右，在此p h 值下既不影响 发酵速度，又可减少酗乙酰乳酸的生成量，但洳乙酰乳酸分解为双乙酰的速度加 快。 提高主发酵温度：适当地提高主发酵温度是公认的降低双乙酰含量的有效措 施。提高发酵温度可以加快a 。乙酰乳酸向双乙酰的转化，只有转化成双乙酰，才 有双乙酰还原的发生。 提高罐压：当外观发酵度达7 0 以上，外观糖度降至3 5 0 p 时，将罐压由 i o 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术黪定酵母突变株的初探 0 1 m p a 升至0 1 4 m p a ，这样既可避免酵母过早沉降，又可以促进双乙酰渗入细 胞内，剩用酵母细胞加速双乙酰的还原。 1 2 3 添加a 一乙酰乳酸脱羧酶 伐乙酰乳酸脱羧酶可以催讫程乙酰乳酸直接脱羧生成乙偶姻，丽不经过形成 双乙酰的步骤，因此将此酶引入啤酒发酵过程中，可以极大地缩短啤酒熟化期， 提高啤酒厂的生产施力陋瑚。 鑫然氧化脱羧0 2e 0 2 a 一乙酰乳酸五_ 叶双乙酰 。 啤酒发酵正常途径 i 。| 还踩酶 a - 乙酰乳酸脱羧酶 “。、- i 工 。一、 晶峰乙偶姻 图1 3a 乙酰乳酸脱羧酶的作用 f i g 1 3t h ef u n c t i o no fa c e t o l a c t a t ed e c a r b o x y l a s e 2 、醛类 酵母在较低温度下( 7 5 9 0 ) 发酵产物主要是乙醇，随发酵温度升高副产物 会隧之增加，其中包括醛类物质，给哮洒带来辛辣味、不成熟味及其德不良懿味。 作为酵母代谢直接产物的乙醛，是醛类物质中最重要的代表物。它由丙酮酸 经不可逆脱羧丽形成。乙醛也是啤湮中含量最多的醛类。 2 1 乙醛代谢 乙醛是酵母的中闻代谢产物，由酵母糖代谢产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙 醛，在发酵前期大量生成的乙醚，随着发酵的不断进行，会被乙醇脱氢酶还原为 乙醇焉浓度不断降低，乙醛的消除对乙醇的生成来说也缀重要溷。一般来说下 面发酵至发酵度为3 5 6 0 时，乙醛含量最高【1 7 l 。乙醛的代谢机制见图1 4 。 优良啤酒酵母菌株的选育及运用r a p d 技术鉴定酵母突变株的初探 图l 。4 乙醛的代谢途径1 1 8 】 酯的生物合成 f i g 1 4t h em e t a b o l i cp a t h w a yo fa c e t a l d e h y d e 从图1 4 可以看出，乙醛是酵母从糖到乙醇的代谢途径中的一个代谢分支点， 在发酵过程中，酵母细胞通过e m p 途径将糖类分解成丙酮酸，然后焉酮酸在酵 母产生的丙酮酸脱羧酶的催化下产生乙醛和二氧化碳。酵母代谢形成的乙醛既能 还原成乙醇又能氧化成乙酸。 2 2 乙醛对啤酒风味的影响 乙醛属于生青类物质，这些物质赋予啤淄不纯正、不成熟、不协调的口味和 气味，在啤酒中乙醛的味阈值为1 0m g l 1 同，优质啤洒中乙醛含量一般在8m g l 以下玎9 1 。当哮酒中乙醛含量超过阕值时，会给人一种不愉快的粮糙苦味感觉， 含量过高时，给啤酒一种辛辣的腐烂的青草味或青苹果味。乙醛的存在还影响着 啤酒口味的成熟渊。总之它们的存在对哮灏没有任何的好处，只有不利的影响， 在啤酒中乙醛的含量越少对啤酒的风味越有利，因此在啤酒生产中，要尽可能降 低乙醛的含量。 2 3 影响乙醛含量的因素 2 。3 1t 艺条件 工艺条件对乙醛有较大的影响【2 i l 。国内外研究工作者对此都进行过研究，得 出了一些结论，但有些结论不致。例如v i n c e n ts 等人研究发现麦汁的p h 值 升高( 如p h 5 。8 ) 或降低( 如p h 4 8 ) 时，发酵产生的乙醛含量都会有所下降【2 2 】，但有 1 2 径 一 优良啤溉酵母菌株的选育及运用r a p d 技术髅定酵母突变株的初探 的认为提高麦汁p h 值，增加麦汁通风量和增加酵母接种量，有利于乙醛的形成 1 7 l 。发酵液的p 差值对乙醛的影响不同的研究有不同的结果，这可裁是由予所焉 的酵母菌种的差异所导致，但是可以肯定的是，菠汁的p h 不同会对酵母的代谢 产生一定的影响，进而会对乙醛的含量产生影响。因此要褥到品质一致的啤酒， 就要严格控制麦汁的p h 值的致性。 发酵后靛氧气的存在会导致乙醛含量的反弹这是毽为发酵震期吸氧会导致 酵母的繁殖，酵母的繁殖肯定会产生乙醚( 经e m p 途径) ，而发酵后期发酵液中 悬浮的酵母很少，酵母不麓将这时产生乙醛全部还原成乙醇，从而导致乙醛含量 的上升。 2 3 2 杂蓍对乙醛含量的影晌 麦汁或接种酵母染有杂菌时，会对啤酒风味产生影响【2 3 j ，同样也会对乙醛 的含量产生影响。麦汁或接种酵母串污染肠抒菌科的细菌时，会引起乙醛含量的 上升。 3 、高级醇 啤酒中高级醇是指3 个碳原子以上的醇类的总称，主要包括正丙醇、异丁醇、 异戊醇，活性戊醇、参一苯乙醇等，对啤酒风味影响最大的是异戊酵( 可占总高 级醇的5 0 ) 和p 一苯乙醇【7 1 ，异戊醇的含量若超过阈值( 5 0m g l 1 ) ，饮后使人 感到头疼。援丙醇含量超过高级醇总量的2 0 时，饮后感到有不良丽味，并易“上 头， 。高级醇对啤酒风味具有重大影响，适宜的高级醇含量及各种高级醇之间 的比例可使漓体丰满圆润，口感柔和协调，赋予啤酒厚感、泡沫细腻，使啤酒具 有丰满、筋骨之感；超过一定含量，具有明显的杂醇味，还会使消费者饮后头痛、 头晕、发坠弦懿。除某些特种啤酒外，一般的啤酒中，大量的高级醇是不受欢迎 的，表l 。1 是啤酒中常见高级醇的味阈值f 7 1 ，总高级醇的味阙值在6 0 1 0 0m g l - 1 的范围。 优良啤酒酵母麓株的选育及运用r a p d 技术鉴定瓣母突变株的初探 表1 1 啤酒中高级醇的味阚值 t a b 1 1t h et h r e s h o l do fh i g h e ra l c o h o l sc o n t e n ti nb e e r 3 1 高级醇的形成和代谢 啤酒中绝大多数的高级醇是在主发酵期间形成的，形成高级醇的代谢途径有 两种：一是1 9 0 7 年由德圜化学家埃尔利希提出的有氨基酸形成高级醇的途径， 即降解代谢途径，其代谢过程包括氨基酸被转氨为伐酮酸，酮酸脱羧成醛，醛还 原为醇。二是合成代谢途径，即利用糖类为碳源，无机氮为氮源，经由氨基酸合 成途径，形成q 一酮酸，酮酸脱羧和还原，就形成了高级醇。在生成高级醇的这两 条途径中，合成途径占7 5 ，而埃尔利希( 降解) 途径只占2 5 。其代谢途径 见图l 。5 、图l 。6 【1 钠。 上+ 卜k 洲一冀l 一洲+ 卜洲 l 图1 5 埃尔利途径 f i g 1 5e h r l i c hm e t a b o l i cp a t h w a y 干 r 一饯一嘲叶魁渊- d 呻雕嫩渊 图1 6 合成代谢途径 f i g 1 6s y n t h e t i cm e t a b o l i cp a t h w a y 3 。2 影响高级醇生成的因素 1 4 优良啤酒潴母菌株的选育及运用r a p d 技术髂定酵母突变株的初探 在啤酒发酵过程中影响高级醇生成的因素很多包括酵母菌种、发酵原料和发 酵工艺盼2 b2 6 1 。 3 2 1 酵母菌种与酵母的增殖 不同的酵母菌种生成高级醇靛量差别很大，可达5 0 以上。高发酵度的菌种 倾向于形成较多的高级酣7 1 。高级醇是酵母合成细胞蛋白质时的副产物，如果发 酵时酵母增殖倍数过大，产生的高级醇就多。医焉，尽可能控制发酵过程中酵母 的增殖倍数小于4 ，酵母的接种密度在( 1 5 2 o ) , , 1 0 7 m l 范围，可保证发酵旺 盛时酵母细胞数小于6 1 0 7 m l ，能较好地降低唪酒中的离缴醇含量。此外，应 保证麦汁中m 9 2 + 、z n 2 + 、泛酸生物素等的合理含量，控制酵母生长，也可以降 低高级醇含量。酵母菌种对啤酒高级醇觞形成起决定性作用，因此，制造不同类 型的啤酒，啤酒酵母菌种的选择是非常重要的。 3 2 2 原料 在发酵原料中，麦汁的质量对酵母的高级醇生成量影响较大，当麦汁中仅一 氨基氮含量较低或过嵩时，都会产生较多的高级醇；麦汁中馑一氨基氮含量较高 时，酵母增殖密度大，可以形成较低的离级醇。麦汁中可发酵糖的含量越高，发 酵越旺盛，高级醇含量越高。麦汁p h 值越高，酵母代谢形成的有机酸越多，则 高级醇相应减少。一般来说控制定型麦汁的p h 值在5 2 5 6 之间，可明显减少高 级醇的生成量。 3 。2 3 发酵工艺 发酵温度对高级醇含量的影响是相当关键的。高级醇的生成主要是在主发酵 期，发酵周期的前5 天是生成高级醇的敏感期，主发酵温度越低，生成的高级醇 越少，僵是，发酵周期会延长。综合考虑高级醇的含量和发酵周期，一般应结合 自身实际情况，采用不同的发酵温度。发酵度越离，表明发酵越旺盛，酵母增殖 倍数越大，对氮源的需求越高，代谢副产物高级醇越多。 总之，影响啤酒高级醇的因素是多方面的，也比较复杂，只要采用优质的原 料，制定合理的糖化工艺，选用优良的酵母菌种，实施低温发酵、高温还原双乙 酰的工艺可以降低啤酒中高级醇的含量。但也要综合考虑具体的工艺，并结合企 业的实际情况，兼顾到啤酒的翻昧、色泽、泡沫、酒体及稳定性，以酿制独具特 色的优质啤酒，满足消费者的需求。 1 5 优鼹啤酒酵母蒲株的选育及运用r a p d 技术鉴定酵母突变株盼初探 4 、有枕酸 4 1 啤酒中有机酸的分类