（微生物与生化药学专业论文）rhop1工程菌的发酵及其产物的纯化、复性与活性检测.pdf

研究生导师和课题指导小组介绍 导师简介： 王世立，男，1 9 6 0 年1 1 月出生，研究员，硕士生导师。主要从事药理、 基因工程及蛋白质药物的研究开发工作。 课题指导小组成员： t 韩金祥，男，1 9 6 3 年1 0 月出生，研究员，博士，博士生导师。主要从 事微生物与生化药学、医学分子生物学的研究工作。 宋长征，男，1 9 6 4 年1 1 月出生，研究员，博士，硕士生导师。主要从 事病毒疫苗、基因工程与基因分析的研究工作。 作。 张翠，女，1 9 5 5 年2 月出生，副研究员。主要从事细胞生物学的研究工 张筻林，男，1 9 7 2 年6 月出生，助理研究员。主要从事基因工程和蛋白 质药物的研究开发工作。 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用 他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学 院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权 利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单 位仍然为山东省医学科学院。 论文作者签名：笾鹾 导师签名：二二兰= 芝耋一 日期：丝! 童年。月三兰日 山东省医学科学院 功 2 0 0 6j ；i ；颀i 研究生学位论文 中文摘要 o p 1 ( o s t e o g e n i c p r o t e i n 1 ，o p 1 ) 又名骨形态发生蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i c p r o t e i n 7 ，b m p - 7 ) ，属于转化生长因子b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 ，t g f - 8 ) 超家族中的一员，具有强大的骨诱导活性，能刺激未分化的日j 充质细胞的增殖及 其向成骨细胞或软骨细胞方向分化，并促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的分 泌。临床上已将o p 1 用于骨缺损、骨折、脊柱融合术以及整形外科的治疗研究。 随着研究的深入，发现o p 1 的生物学功能不仅限于其诱导成骨活性，而且涉及全 身许多器官的发育和形成，在骨、肾、肾上腺、膀胱和脑组织以及某些骨肉瘤细 胞中都有表达在多种肾脏疾病动物模型中，o p 1 可以阻止肾小球和肾小管间隙 纤维化，恢复输尿管阻塞和糖尿病肾病动物模型的肾脏功能和结构。 直接从动物骨基质等组织中提取和纯化获得的天然o p 1 量非常有限，方法复 杂，成本较高，而且用于人体可能存在异源排斥反应，大大限制了其在基础研究 和临床研究中的应用。随着基因工程技术的发展，越来越多的生物活性因子可以 通过不同的表达系统来大量生产。o p 1 也相继在不同的表达系统中得到表达，其 中主要分为真核表达系统和原核表达系统。真核表达系统具有活性高、表达蛋白 可糖基化等优点，但其表达载体构建复杂、蛋白表达量低且纯化困难。原核表达 系统具有操作简便、基因稳定、可大量生产等优点，但由于表达产物以包涵体形 式存在，因此需要对表达产物进行纯化、复性和生物学活性的研究，同时为了提 高目的蛋白的产率，需要对表达r h o p 1 工程菌的发酵条件进行优化。 研究目的： 本实验在先前已有的研究基础上，通过对表达r h o p 1 工程菌的发酵条件的 优化，拟建立一种稳定、高效的发酵工艺。为获得高纯度、有活性的目的蛋白， 在对r h o p 1 纯化后进一步比较影响r h o p 1 复性的因素，确定最佳复性条件，并 初步探索疏水色谱法一步纯化和复性，提高复性效率。同时采用体外、体内两种 方法测定大肠杆菌表达的r h o p 1 生物学活性，拟建立r h o p 1 活性测定的标准并 为其质量控制和临床应用提供实验依据。 研究方法： 1 对表达r h o p - 1 的工程菌进行摇瓶培养，摸索不同菌种，培养基、p h 值、 接种量、诱导时机、诱导时间等对目的蛋白表达量的影响。放大至发酵罐3 0 c 培养，通过调节转速和通气量使培养基溶氧保持在2 0 以上，利用2 m o l l n a o h 和l m o l lh c l 调节p h 值，补充氮源和碳源，待菌液o d 6 0 0 在1 2 - 1 5 范围内时， 3 山东省医学科学院 四 2 0 0 6j f f ；烦究生学位论文 迅速升温诱导表达，诱导4 h 后，收集菌体。w e s t e r nb l o t 鉴定目的蛋白r h o p 1 ， 并比较不同发酵批次的重复性，检测多次传代后的工程菌的稳定性 2 超声裂解收集的菌体，经多次洗涤后收集包涵体，用高浓度的变性剂溶 解包涵体。利用离子交换法和疏水色谱等方法对r h o p 1 进行层析纯化，考马斯 亮蓝法测定蛋白质浓度；通过改变温度、p h 值以及添加一些促复性剂对r h o p 1 进行复性，t o t a l l a b 软件分析分析蛋白纯度和二聚体含量。通过对包涵体蛋白先 透析复性，在低浓度变性剂的条件下纯化目的蛋白，并尝试疏水色谱法对r h o p 1 复性，以提高复行效率。 3 比较r h o p 1 对不同细胞生长的影响，筛选一种敏感的细胞株作为体外活 性测定的效应细胞，采用改良m t r 、p n p p 和r t - p c r 等方法检测r h o p 1 对效 应细胞增殖、a l p 活性和基因表达的影响，同时通过小鼠肌袋埋植实验观察植 入r h o p 1 埋植剂后的组织病理切片和钙含量的变化，检测其体内活性。 研究结果： 1 表达r h o p - 1 的工程菌经发酵培养后0 d o 。达1 0 0 左右，每升培养液可 获得2 0 9 左右菌体，目的蛋白表达量占菌体蛋白的3 0 以上。多次传代后经 s d s p a g e 、酶切鉴定、测序分析表明工程菌菌种遗传稳定，w e s t e r nb l o t 鉴定表 明所表达的外源蛋白即为目的蛋白r h o p ，1 。 2 经过包涵体洗涤和纯化后r h o p 1 纯度可达9 8 以上。确定了在低温 ( 4 ) 、p h 9 0 条件下并添加0 2 m o l l l - a r g 和3 m m o i l g s h 、0 3 m m o l l g s s g 的复合复性缓冲液对r h o p - 1 复性效果较好。疏水复性获得的r h o p 1 二聚体含量 在5 0 左右，但有部分蛋白沉淀在介质上，需要进一步改进条件。 3 n i h 3 t 3 细胞可作为r h o p - 1 体外测活的靶细胞，体外活性测定结果显示 r h o p 1 在一定浓度范围内，实验组细胞增殖数、碱性磷酸酶水平和骨钙素m r n a 表达水平明显高于阴性对照组。在体内r h o p 1 埋植剂植入小鼠肌间隙两周后， 与对照组相比可以提高钙含量，并且有明显的成骨趋势。 结论： 建立了稳定、高效的工程菌的发酵工艺，r h o p - 1 经过纯化、复性后具有良 好的生物学活性。n i h 3 t 3 细胞作为r h o p 1 的效应细胞在体外检测r h o p - 1 活性 具有较好的重复性和灵敏性，确定了大肠杆菌表达r h o p 1 的生物学活性测定的 方法。 关键词：重组人成骨蛋白1 ；发酵；纯化；复性；生物学活性 4 山东省医学科学院2 0 0 6 届硕 研究生学位论文 a b s t r a c t o s t e o g e n i cp r o t e i n 1 ( o p - 1 ) ，a l s oc a l l e db o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n - 7 ( b m p a i sam e m b e ro ft r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - b ( t g f - b1s u p e rf a m i l y i th a sp o w e r f u l b o n ei n d u c t i o na c t i v i t ya n dc a l la c c e l e r a t eu n d i f f e r e n t i a t e dm e s e n c h y m a lc e l l s p r o l i f e r a t ea n dd i f f e r e n t i a t ei n t oo s t e o b l a s to rc h o n d r o c y t e i ta l s op r o m o t e st h e p r o l i f e r a t i o no fo s t e o b l a s ta n dt h es e c r e t i o no fa l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a l p ) a c c o r d i n g t ot h e s e , o p - 1h a sb e e na p p l i e dt ot h ec l i n i c a lt r e a t m e n tr e s e a r c h e s ，s u c ha sb o n e d e f e c t , f r a c t u r e ，s p i n a lf u s i o na n dc o s m e t i cs u r g e r y i nf u r t h e rs t u d i e s , t h eb i o l o g i c a l f u n c t i o n so fo p 1 a r en o to n l yl i m i t e di nt h ea c t i v i t yo fi n d u c i n gb o n ef o r m a t i o n ，b u t a l s or e l a t e dt ot h eg r o w t h sa n df o r m a t i o n so fm a n y o r g a n si nt h eb o d y i ti se x p r e s s e d i nt h eb o n e ，k i d n e y , a d r e n a l ，b l a d d e r , b r a i na n ds o m eo s t e o g e n i cs a r c o m ac e l l s i n m a n ym o d e l so fk i d n e yd i s e a s e s ，i tc a np r e v e n tt u b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i sa n dr e c o v e r t h ea n i t a a lm o d e l sr e n a ls t r u c t u r ea n df u n c t i o no fu r e t e r a lo b s t r u c t i o na n dd i a b e t i c n e p h r o p a t h y i t i sc o m p l i c a t e da n dc o s t l yt oe x t r a c ta n dp u r i f yn a t u r a lo p - 1d i r e c t l yf r o m a n i m a lb o n em a t r i xb u tal o wp r o d u c t i o na n dp o t e n t i a lh e t e r o g e n e o u sr e j e c t i o nt o h u m a nb o d y t h e s el i m i t e do p 1 sa p p l i c a t i o n so fb a s i ca n dc l i n i c a lr e s e a r c h e s w i t h t h ed e v e l o p m e n to fg e n e t i c c n g i n e e r i n g , m o r ea n d m o r eb i o l o g i c a la c t i v ef a c t o r sw e r e p r o d u c e d i nd i f f e r e n t e x p r e s s i o ns y s t e m s i tw a sr e p o r t e dt h a to p 1h a db e e n s u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di n d i f f e r e n t e x p r e s s i o ns y s t e m s s u c ha s e u k a r y o t i ea n d p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m s t h ep r o t e i nf r o me u k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mh a s t h eg o o dq u a l i t yo fh i g ha c t i v i t ya n dg i y c o s y l a t i o n b u ti ti sc o m p l i c a t e dt oc o n s t r u c t e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rw i t hl o wp r o d u c t i o na n dt h ed i f f i c u l tp u r i f i c a t i o n t h e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mh a sa d v a n t a g e so fc o n v e n i e n c e ，g e n e t i cs t a b i l i z a t i o n ， a n de a s yt op r o d u c ei nag r e a tq u a n t i t y b e c a u s et h ee x p r e s s i o np r o d u c te x i s t si nt h e f o r mo fi n c l u s i o nb o d y , t h i sr e s e a r c hf o c u s e sm a i n l yo i lt h ep u r i f i c a t i o n ，r e n a t u r a t i o n a n db i o l o g i c a c t i v i t y o fe x p r e s s e dp r o d u c t s i m u l t a n e o u s l y , t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so ft h ee n g i n e e r i n gb a c t e r i ae x p r e s s i n gr h o p - 1s h o u l db eo p t i m i z e dt or a i s e t h ey i e l do f t h ei n t e r e s t e dp r o t e i n o b j e c t i v e ： o nt h eb a s i so f p r e v i o u sr e s e a r c h ，1 h a v e b e e nt r y i n gt oo p t i m i z et h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ee n g i n e e r i n gb a c t e r i ae x p r e s s i n gr h o p - 1t oe s t a b l i s ha 5 山东省医学科学院2 0 0 6 届硕j 二研究生学位论文 s t a b l ea n dh i g h p e r f o r m a n c ef e r m e n t a t i o np r o c e s s i no r d e rt oo b t a i nr h o p - 1w i t h h i g hp u r i t ya n dh i g ha c t i v i t y , t h ei n f l u e n c e df a c t o r so nr h o p - 1r e f o l d i n gw e r ef u r t h e r d e t e c t e da n dt h eo p t i m a lr e f o l d i n gc o n d i t i o nf o rr h o p - 1w a sd e t e r m i n e da f t e r p u r i f i c a t i o n h i cw a sa p p l i e di np u r i f i c a t i o na n dr e n a t u r a t i o n 砒t h es a m et i m et o e l e v a t et h ee f f i c i e n c yo fr c n a t u r a t i o n t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fr h o p - 1e x p r e s s e di ne c o l iw a sa s s a y e ds i m u l t a n e o u s l yw i t ht w om e t h o d si nv i t r oa n di nv i v ot oe s t a b l i s ha s t a n d a r d i z e dm e t h o df o rt h ea s s a yo fr h o p - 1a n dp r o v i d ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o r t h eq u a l i t yc o n t r o la n dc l i n i c a la p p l i c a t i o n m e t h o d s ： 1 s t u d yt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n ts t r a i n s , m e d i a , p h ，i n o c u l u m ，a n dt h et i m eo f i n d u c t i o no nt h ee x p r e s s i o no fr h o p 1t h r o u g hs h a k i n gc u l t u r e t h ee n g i n e e r i n g b a c t e r i aw e r ec u l t u r e db yt h ef e r m e n t e ru n d e r3 0 w i t hd i s s o l v e do x y g e nk e p t b e y o n d2 0 b yc o n t r o l l i n g r o t a t i o ns p e e da n dv e n t i l a t i o n p hw a sr e g u l a t e db y 2 m o l ln a o ha n di m o l lh c ia n dt h en i t r o g e na n dc a r b o ns o u r c ew a ss u p p l i e dt o t h em e d i u md u r i n gt h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r ew a sr a p i d l yr a i s e df o r4 h o u mt oi n d u c et h ee x p r e s s i o no fr h o p - 1w h e nt h eo p t i c a ld e n s i t y ( o d e o ) w a s b e t w e e n1 2a n d1 5 t h ei n t e r e s t e dp r o t e i nw a si d e n t i f i e db yw e s t e r nb l o ta f t e r c o l l e c t i n gt h eec o l i e x p r e s s e dr h o p - 1 s i m u l t a n e o u s l y d i f f e r e n tb a t c h e sw e r e c o m p a r e dt oa s s a yt h er e p r o d u c i b i l i t yo ff e r m e n t a t i o na n dt h es t a b i l i t yo fe n g i n e e r i n g b a c t e r i aw a sd e t e c t e da f t e rh i g hp a s s a g e 2 t h ei n c l u s i o nb o d yw a se x t r a c t e da n dd i s s o l v e db yh i g hc o n c e n t r a t i o n d e n a t u r a n ta f t e rc r a c k i n gt h eb a c t e r i ab yu l t r a s o n i c a t i o na n dr e p e a t e dw a s h i n g r h o p - 1w a sp u r i f i e db yi o ne x c h a n g em e t h o da n d h y d r o p h o b i cc h r o m a t o g r a p h ya n d t h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a sa s s a y e db yc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u em e t h o d r h o p - 1 w a sr e f o l d e db ya l t e r i n gt h et e m p e r a t u r e , p ha n ds o m ec o m p o u n d st of a c i l i t a t et h e r e n a t u r a t i o n t h ep u r i t ya n dd i m e rc o n t e n to fr h o p 1w e r ea n a l y z e db yt o t a l l a b s o f t w a r e t h ei n t e r e s t e dp r o t e i nw a sp u r i f i e du n d e rl o wc o n c e n t r a t i o nd e n a t u r a n ta f t e r t h ei n c l u s i o nb o d yw a sd i a l y s e da n dh i ew a sa p p l i e dt oe l e v a t et h ee f f i c i e n c yo f r e n a t u r a t i o n 3 t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc e l l st r e a t e dw i t hr h o p 1w o r ec o m p a r e di no r d e rt o s e l e c tas e n s i t i v ec e l ls t r a i na st h ee f f e c t o rc e l lf o rt h eo b s e r v a t i o no fb i o l o g i c a l a c t i v i t yi nv i t r o i m p r o v e dm t ra n dp n p pa n dr t - p c rm e t h o d sw e r cu s e dt o a n a l y z et h ee f f c c t o rc e l l sp r o l i f e r a t i o n ，t h ea c t i v i t yo fa l pa n dt h eg e n ee x p r e s s i o n 6 山东省晖学科学院2 0 0 6 屙颀j 。哿f 究生学位论文 a tt h es a m et i m e ，i t sa c t i v i t yw a s a n a l y z e dw i t ht h ev a r i a t i o no fp a t h o l o g i c a ls e c t i o n a n dc a l c i u mc o n t e n tb yi m p l a n t i n gr h o p 1i n t ot h et h i i g hm u s c l e so fm i c ei nr i v e r e s u l t s ： 1 a f t e rt h ef e r m e n t a t i o no ft h ee c o l is t r a i n e x p r e s s i n gr h o p 1 ，0 d 伽m r e a c h e d1 0 0a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fb a c t e r i aw a sa b o u t2 0 9 ll b t h ei n t e r e s t e d p r o t e i nw a sa b o v e3 0 o ft o t a lb a c t e r i ap r o t e i n s o u rr e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h e e n g i n e e r i n gb a c t e r i aw e r es t a b l ea f t e rb i g l lp a s s a g eb ys d s p a g e ，i d e n t i f i c a t i o no f p l a s m i db yd i g e s t i n gu s i n gr e s t r i c t i o ne n z y m e sa n ds e q u e n c i n g t h er e s u l to fw e , s t e m b l o td e m o n s t r a t e dt h a tt h ei n t e r e s t e dp r o t e i nr h o p - 1w a so b t a i n e d 2 t h ep u r i t yc o e f f i c i e n to fr h o p - 1w a sa b o v e9 8 a f t e rw a s h i n gt h ei n c l u s i o n b o d ya n dp u r i f i c a t i o n t h eo p t i m a lc o m p o u n d sr e f o l d i n gb u f f e rw i t h0 2 m o l ll 恕， 3 m m o l lg s ha n d0 3 m m o l lg s s gu n d e rl o wt e m p e r a t u r e ( 4 ) a n dp h 9 0c a n 缸c i l i t a t et h er e n a t u r a t i o no fr h o p 1 t h ec o n t e n to fr h o p 1d i m e rw a s5 0 a f t e r r e f o l d i n gb yh i c t h ec o n d i t i o no fh i c n e e dt ob eo p t i m i z e db e c a u s et h ep r o t e i nw a s d e p o s i t e di nt h ec h r o m a t o g r a p h ym e d i a 3 n i h 3 t 3c a l l sw e r es e l e c t e da st h ee f f c c t o rc e l lf o rt h eo b s e r v a t i o no f b i o l o g i c a la c t i v i t y nv i t r o t h el e v e lo fc e l l sp r o l i f e r a t i o na n da l p a n dt h ee x p r e s s i o n o fo s t c o c a l c i nm r n aw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nt h et e s t g r o u pw i t hac e r t a i n c o n c e n t r a t i o no ft h o p - 1t h a nt h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u p t h eg r o u p nv i v ow a s e m b e d d e dw i t hr h o p - 1i n t ot h i g hm u s c l e sf o rt w ow e e k sa n dt h ec a l c i u mc o n t e n ta n d t h et e n d e n c yo fo s s i f i c a t i o nw e r es i g n i f i c a n t l ye l e v a t e dc o m p a r e dw i t ht h en e g a t i v e c o n t r 0 1 c o n c l u s i o n ： t h es t a b l ea n dh i g h - p e r f o r m a n c ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fe n g i n e e r i n gb a c t e r i a h a sb e e ne s t a b l i s h e da n dt h er h o p - 1e x p r e s s e di ne c o l ih a ss a t i s f a c t o r yb i o l o g i c a l a c t i v i t ya f t e rp u r i f i c a t i o na n dr e f o l d i n g n i h 3 t 3c e l l sh a v et h ef a v o u r a b l ec h a r a c t e m o fr e p r o d u c i b i l i t ya n ds e n s i t i v i t ya st h ee f f c c t o rc e l lf o rt h eo b s e r v a t i o no fb i o l o g i c a l a c t i v i t y nv i t r o t h em e t h o dt oa s s a yt h eb i o l o g i ca c t i v i t yo fr h o p - 1e x p r e s s e di ne c o l ih a sb e e ne s t a b l i s h e d 。 k e yw o r d s ：r e c o m b i n a n th u m a no s t c o g e n i cp r o t e i n 1 ( r h o p 1 ) ；f e r m e n t a t i o n ； p u r i f i c a t i o n ；r e n a t u r a t i o n ；b i o l o g i c a la c t i v i t y 7 山东省医学科学院衄2 0 0 6 届硕十研究生学位论文 主要符号表 8 山东省医学科学院 衄 2 0 0 6 届硕卜研究生学位论文 第一部分前言 1 成骨蛋白1 的研究进展 1 1o p 1 的研究背景与分子结构 1 9 6 5 年美国的骨科医师u r i s d l 】从脱钙骨基质( d b m ) 中发现有一种物质能 在异位诱导新骨形成，进一步分析证明这种能在异位诱导新骨形成的物质是一种 蛋白质，他将此命名为骨形态发生蛋白( b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n s ，b m p s ) ， b m p s 广泛存在于骨胶原纤维、骨膜及骨髓基质中，大部分与胶原结合，少部分 与骨结合或呈游离态它们对多数细胞的增殖、分化、凋亡以及胚胎发育、器官 的形成起着重要作用。1 9 9 0 年美国哈佛大学的o z k a y n a k 2 1 在分析牛成骨蛋白提 取物时，从中分离出3 种转化生长因子1 3 ( t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b ，t g f 1 3 ) 家族的同序物，发现其中一种为新的蛋白，将其命名为成骨蛋白1 ( o s t e o g e n i c p r o t e i n ，o p 1 ) ，另外2 种后来证实是b m p - 4 和b m p - 3 同年英国剑桥大学遗传 学研究所的c e l e s t e 3 l 也筛选出一种蛋白，命名为骨形态发生蛋白7 ( b o n e m o r p h o g e n c t i ep r o t e i n - ，b m p - 7 ) ，并以该蛋白c d n a 序列片段为探针筛选出入 骨形态发生蛋白7 基因。c e l e s t e 进一步对b m p - 7 和o p 1 进行氨基酸序列分析， 证明二者实际上是同一种蛋白1 3 1 除b m p 1 是一种蛋白酶外，其余的b m p s 从 氨基酸序列上看均属于转化生长因子1 3 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - e ，t g f - 1 3 ) 超家族中的成员，即在氨基酸序列中有7 个保守的半胱氨酸。o p 1 作为b m p s 中的一员，具有强大的骨诱导活性，已有的研究表明它具有较强的刺激成骨或成 软骨的能力，能在体内外诱导未分化的间充质细胞向软骨细胞或成骨细胞分化， 促进骨源性碱性磷酸酶和胶原蛋白等的m r n a 的表达，同时可以刺激间充质细 胞和成骨细胞的增生，诱导成纤维细胞分化为成骨细胞 4 , 5 1 。 人的o p 1c d n a 全长1 2 9 3 b p ，在开放读码框编码下产生的o p 1 前体蛋白 由信号肽、前体肽和成熟肽3 部分组成，含有4 3 1 个氨基酸，o p 1 在细胞内以 前体形式合成。c 末端在蛋白水解酶的作用下此前体蛋白可在体内被剪切加工为 含1 3 9 个氨基酸的成熟o p 1 蛋白，分子量为1 5 6 k d ，o p 1 单体含有3 对二硫 键，其中c y s 6 7 - c y s - 1 3 6 和e y s 7 1 c y s 1 3 8 两对二硫键构成一个环，第三对二硫 键c y s - 3 8 - c y s 1 0 4 穿过的环中部，共同形成含有1 0 个氨基酸的半胱氨酸结，从 结点出发的4 组1 3 折叠呈手指样突起，n 螺旋与结点尾部相对，垂直于指的轴 线，成为手的根部。肽链n 末端对应手的拇指，因此，o p 1 单体空间结构大致 成“手掌状”，o p - 1 常以二聚体形式存在，由一个单体的a 螺旋与另一单体的 指部区域相作用形成的，由两条成熟单体在第1 0 3 位半胱氨酸经二硫键连接而成 9 山东省医学科学院i 酉 2 0 嘶届硕士研究生学位论文 嘲在形成同源二聚体的同时，o p - 1 可与其它亚型结合成异源二聚体如 b m p - 4 o p 1 、b m p - 2 o p 1 ，它们具有更高的生物学活性。 图1 - 1o p - i 的二级结构( 单体) 图1 - 2o p - i 二聚体的立体结构 f i g l 1t h e x n m r ys t r u c t u r eo f o p - i l ：i g l - 2n m n t o e h c r a i c a ls t 哪c t u mo f o p - id i r e c t 1 2o p 1 的受体信号传导途径 o p 1 通过结合b m p 家族受体发挥作用，目前已知b m p 受体( b m p r ) 有： b m p r - i ( b h 但r i a 和b m p r - i b ) 及b m p r - b r - i 胞内区的近膜部 分( n 端) 有高度保守的丝氨酸甘氨酸( g s ) 结构域，是活化起始的部位与 之相比，b 伊r - 有一个较大的羧基末端序列，其中富含甘氨酸和丝氨酸( 约占 2 2 ) b m p r 近膜部分缺少b m p r - i 的g s 特征结构域。b 础p r ia 与b m p r - ib 结构相似，它们的胞外段都很短，近膜侧有保守的“c y s 盒”胞内有s t k 活性区域。b m p r 可以自身磷酸化，同时还可以磷酸化上游的b m p r - ia 及 b p r - i b b m p r - i a 、b m p r - i b 及b m p r - i i 各自与b m p 的亲和力很弱， 不能单独介导信号传递。b m p 与b m p r - 结合时，b m p r - i 使b m p r - i 上g s 域磷酸化然后b m p r - i ( b m p r - ia 和b m p r - ib ) 与两分子b m p r - 1 i 形成 具备b m p 高亲和力的异四聚体，为丝氨酸，酪氨酸激酶受体在信号转导中 b m p r - ia 起主要作用，1 型受体作用于s m a d l 或s m a d 5 ，并使其磷酸化，激 活的s m a d l 或s m a d 5 再结合s m a d 4 ，这个复合物进入细胞核，与特异的启动调 控组件结合，调控作用于下游因子( 如c - m y e ) ，影响一些特定基因的转录，从 而参与细胞的胞内生理活动( 图1 - 3 ) 这个过程可使成肌细胞转化为成骨细胞， 此时不再需要b m p 的存在 t j l y e h 等 9 1 利用反义寡核苷酸抑制原代培养的胎鼠 颅骨( f e t a lr 砒c a l v a r i a ，f r c ) 细胞表达的b m p 受体来观察发现抑制b m p - i 型 受体3 种亚型( 活化素受体i 。b m p r - ia 和b m p r - ib ) 中任何一种亚型的 表达，对o p l 增强ir e 细胞碱性磷酸酶活性的作用影响都不大，抑制b m p - i o 山东省医学科学院l i 卫2 0 0 6 届颂f ：研究生学位论文 型受体的表达却可使这作用减弱5 0 。由此可知，对b m p 受体表达的调节可 影响o p 1 的信号传导。 圈1 - 3b m p 和t g f - b 超家族信号传导途径的相互关系 f i 9 1 - 3t h es i g n a lt r a n s f o r m a t i o np a t h w a y so fb m pa n dt g f - bt m p e r f a m i l y 1 3o p 1 的生物学作用 1 3 1o p 1 在胚胎发育过程中的作用 o p - 1 在生命早期是一种刺激中胚层器官形成的重要因子，b m p 受体和配体 的亚单位在整个胚胎发育过程都有表达，其作用是调节细胞的生长、分化、增生 和凋亡，并影响细胞系的建立研究发现，b m p - 7 在人和小鼠整个胚胎期许多 组织中均有表达( 如牙芽、心、脑、肾、骨以及小肠等) ，b m p 7 对脑组织、骨 骼系统、眼、肾脏、肝脏和心脏组织的发育调节作用是多变和复杂的。 1 3 2o p 1 在骨骼系统的作用 a s a h i n a 等1 1 0 l 在胎鼠颅骨( f r c ) 细胞软骨内成骨模型中观察到o p 1 可阶段 特异性地诱导原始成骨祖细胞的定向分化如在早期( d