（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠早期胚胎中nnos、inos和enos+mrna的表达.pdf

小鼠早期胚胎中n n o s 、i n o s 和e n o sm r n a 的表达 摘要 辍化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 熄一种具有自由基性质的生物活性分予，作为 一秘偿号分子，n o 焱狡髂院爨、耱经信号传撼、矗管扩张等生理过程中发挥善 重要的作用。生物体内的一氧化氮由一氧化氮台酶( n o s ) 倦化l 一精氨酸脱胍基 产生l 胍氨酸而成，觋已确认的氯化氮合酶旖3 种亚型，分别是神经元测n o s ( n n o s ) 、匿安型n o s ( e n o s ) 懿诱导型n o s ( i n o s ) 。n o s 楚一氧诬氢生成过或 中的限遽酶，因此巢组织中n o s 的量能线性殿应出该组织中n o 的量。 n o 作为一种多功能的分子，在许多生理系统的信号传递中起重要作用，近 年寒鸯诲多磅究表明辩。在髂内努晕耀题鼹发鸯申其鸯重要鹣谖节终曩。渤秘早 期胚胎的发育是个体发育的重要阶段，其发育进程受体内许多因素的调节和影 响。人们已从多个方面对早期胚胎发育过程作了大量的研究，然而对n o 襁早期 题骀中霹麓产生豹雯壤谖节终焉7 瓣较少。灸了搽谤瀚对小鬣晕赣题鼹发弯豹 影响，深入研究早期脓胎发育机制，揭示其发肖过程的调节飙绰，本研究聚用反 转录聚合酶链式反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s er t p c r ) 方法枪测了 夔棱懿器发鸯薅絮殛麓中n n o s 、i n o s 窝e n o s 瓣m r n a 夔表达漶提。结鬃凌明： 卜细胞胍胎到早期囊胚均有n n o s 和e n o sm r n a 的表达，卜细胞期到桑椹胍的相 对表达蠛有上升趋势，到早期囊胚又有所下降，经t 检验各期胚胎n n o s 和e n o s m r n a 戆辍对表达量茇努不显著( p 0 + 0 5 ) 。酴了零鬟囊篷，箕它各期豹晕麓憝赡 均有i n o sm r n a 的裁达，且相对表达量有所增加，到桑椹胚时相对表达量辍大， 经t 检验，卜细胞胚胎到8 一细胞胚胎的i n o sm r n a 的相对表达量差异不最著 ( p o 。0 5 ) ，纛桑懿释鞠其它各裁疑黪熬i n o sm r n a 豹藤对表速量差簿显著 ( p o 0 5 ) m r n ao fi n o sw a so n l ya m p l i f l e df r o m1 一c e l lt om o r u l as t a g ee m b r y o sa n d t h el e v e lo fe x p r e s s i o ng r a d u a l l yi n c r e a s e d t h ee x p r e s s i v el e v e lo f p r e b l a s t u l as t a g ee m b r y o si st h em o s t tt e s ts h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n o fi n o sm r n af r o ml c e l lt o8 - c e l1 s t a g ee m b r y o s i sn o t s i g n i f i c a n t ( p o 0 5 ) ，b u tt h ee x p r e s s i o no fi n o sm r n ai nm o r u l as t a g ee m b r y o si s s i g n i f i c a n t ( p n a l 嗍l 黼卜 唑 咚之+ 啪户 n o s i ( n n o s ) 蛋白由两部分构成：还原酶结构域，氧化酶结构域。氧化酶 结构域中有钙调蛋白( c a m o d u l i n ，c a m ) 结合位点，n o s ic 末端区域与n a d p h 细胞色素p 4 5 0 还原酶具有序列同源性，其中具有n a d p h 、黄素腺嘌呤二核苷酸 ( f l a v i na d e n i n ed i n u c l e o f i d e ，f a d ) 、黄素核苷酸( f l a v i nm o n o n u e l e o t i d e ，f m n ) 结合位点，作为转移至血红素的电子开源和贮藏处。尽管n o 氧化酶结构域与其 它哺乳动物蛋白无同源性，但在n o s 的几种异构体中均发现一高度保守的含3 2 0 个氨基酸残基的序列，其可能具有l - a r g 、血红素、四氢生物蝶啶( t e t r a h y d r o b i o p t e r i n ，b r h ) 的结合位点，因而可以推测出可能的电子流方向为： n a d p h 一( f a d f m n ) 一血红素 黄素在介导n a d p h 与血红素之间的电子传递过程中起重要作用。在n o 合 成的不同阶段，血红素需要单个电子，黄素能作为单电子供体，n a d p h 则不能， 而且在l - a r g 与n o s 氧化过程中，每分子n o 合成需1 5 分子的n a d p h ( 3 个 电子) 。但在每步催化过程中，n a d p h 只能提供偶数数量电子，故为了完整氧 化过程，n o s 可能贮藏一个在连续n o 合成循环中来源于n a d p h 的电子。f a d 、 f m n 各自能接受、贮存来源于n a d p h 的两个电子，故其亦能作为催化过程中 的电子贮藏处。因而在一轮n o 合成循环中，消耗2 个n a d p h ，其供应的4 个 电子储存于下一轮n o 合成要使用的黄素中。在下一轮循环中，上一轮贮存的电 子将与另外的n a d p h ，供应的两个电子一起被使用。故每个l a r g n o 循 环中要消耗1 5 个n a d p h 。事实上，鼠肝腺粒细胞还原酶中的黄素在氧化循环 过程中是能够贮存电子的。 总得来说，n o 的生物合成机制分为两步： 第一步：l - a r g 氧化合成n o h a r g ，n o s 血红素结合体需接受2 个电子以激 活氧气：此反应由【f e o 】”开始进行。通过l a r g 胍基n h 的氢抽提反应而形成 阴离子自由基，然后胍阴离子自由基与 f e o 2 + 的结合，而形成n o h a r g 及血红 素。 第二步：n o h a r g 转变成n o 、l - c i t 。此反应需一个电子从n o h a r g 中传递 至血红素，化学计量资料亦证实了末配对电子产物n o 的生成，n o h a r g 氧化还 原电位及热动力学研究发现一个氢原子从n o h a r g 转移至 f e o 】2 + 中。有可能， 底物的一个电子氧化过程发生在n o 生物合成的某一点上，但目前尚不清楚 n o h a r g 后中间体何时被氧化的。 从细胞色素p 4 5 0 还原酶及其底物诱导的血红素激活过程，我们可以类推出； 在n o s 作用下，l - a r g 介导的电子传递( n a d p h 一黄素一血红素) 过程也是 一个合理的过程。不过，c a 2 + 结合于n o s i 中心部位的c a 2 + c a m ，作为变构机 制，使n o s ic 末端还原酶结构域与n 末端氧化酶结构域发生重排，而促进电子 从黄索传递至血红索。若c a 2 + 与c a m 是分开的，则n o s 的结构域就不能发生 重排，也就不能出现电子传递。c a 2 + c a m 调节电子传递的机制完美地说明了 n o s i ，n o s i i i 是如何被细胞内c a 2 + 流动所控制的。细胞内c a ：+ 水平升高导致 c f + c a m 复合体形成，并与n o s i ，n o s i i i ( e n o s ) 结合而启动生物合成过程。 左旋精氨酸一一氧化氮代谢途径也称为l - a r g n o 通路。这一通路不仅是n o 的 途径，也是细胞排泄过量氮的一种方式。l - a r e j n 0 途径的发现不仅对深入地研 究生物攀捷貘了重要瓣蘩蘑，嚣虽瞧戈寻我治痪痰癍瑟途径焚定了基磷。 2 2 硝基扩血管物质一局部产生n o 的化合物 硝熬扩血管物质( n i t r o v a s d i t a t o r ) 进入机体后，通过一系列生化反成释放 n o ，发簿药理箨焉，磷墓扩盘蓉秘矮分类及毒拳凌转证如下豳掰示： 嘿o t 典 礤日o 鼙薅蘸毫謦簧 辅瞢馈 3 一氧化氮合酶 3 。l 一氧化氮合辩憋分类 生理条件下，动物体内n o 生物合成主要途径是一氧化氮合酶( n i t r i co x i d e s y n t h a s e ，n o s ) 的酶促反应1 1 4 1 。n o s 在酶促反威中不需要a t p ，因此该酶不能 穆为n o 台残酶。噻魏动物至少蠢三秘基嚣编璐三耱不同擒溅n o s ，经_ 过分子 克隆的n o s 的c d n a s 序列分析显示，它们的核黻序列以及对应的氨基酸序列约 有5 0 6 0 的同源性1 5 1 。s o u t h e r nb l o t 分析显示只有三种n o s 基因。哺乳动物 不同组织中豹n o s 分类，可按最邋n a t h a n 移x i e 戆势类方法( 表1 ) ，该分类方 法简单明了，并获得了公认 拍1 。目前，绝大多数文献中仍采髑n n o s 及e n o s ， 但有时用括弧注明前菊为( n o si ) ，厝者为( n o si i i ) 。m a c n o s 与h e p n o s 总称为 i n o s ，褒瓣注弱为( n o si i ) 。 融= l 稚 勿 一弋o o 秘 ，剐 h k 飞 表1 一氧化氮合酶命名法 t a b l e1n o m e n c l a t u r eo f n i t r i co x i d e s y n t h a s e 最初的命名法功能命名法 数字命名法 神经型n o s ( 结构型)神经结构型n o si 型n o s nn o s ( c o n s t r u c t i v e ) n c n o s t y p el 内皮型n o s ( 结构型)内皮结构型n o sh i 型n o s f i l en o s ( c o n s t r u c t i v e ) e e n o s n p e 巨噬细胞n o s ( 诱导型)可诱导型n o si i 型n o s m a c n o s ( i n d u c i b l e )i n o s t y o ei i n o s 单体分子质量随三种n o s 亚型不同而有差异。n n o s 的单体分子质量 为1 6 0k d a ，其氨基酸为1 4 3 0 个，但最近报告，分别为1 6 1k d a 与1 4 3 4 个。e n o s 的单体分子质量为1 3 0k d a ，其氨基酸数为1 2 0 3 1 2 0 5 个，而最近报告为1 1 5 3 个。以巨噬细胞、平滑肌细胞、肝细胞、关节软骨细胞为组织细胞来源的i n o s 单体分子质量为1 3 0 , - - 1 3 lk d a ，其氨基酸数为1 1 4 0 1 1 5 0 个，不过最近报告为1 2 0 3 个 1 7 1 。 3 2 一氧化氮合酶的生物学特点 结构型一氧化氮合酶( c n o s ) 存在于内皮细胞，另一种存在于神经元细胞 以及其它一些种类的细胞，包括肾小球囊细胞、b 一胰腺细胞、骨髂肌细胞、肺 上皮细胞以及胃和膀胱的一些细膨1 8 】。c n o s 的活性依赖于细胞内c a 2 + 浓度升高 导致的c a c a m 的活化，即只有细胞内钙离子浓度的升高方可迅速激活c n o s 。 而可诱导型一氧化氮合成酶i n o s 不依赖于细胞内c a 2 + 的升高。虽然所有的n o s 都需要与钙调蛋白( c a l m o d u l i n , c m ) 结合才能表现其催化活力，但只有i n o s 在静息细胞低c a 2 + 浓度条件下仍与钙调蛋白紧密结合而保持完全的催化活力伸】。 因此人们认为，e n o s 和n n o s 产生少量瞬时性的依赖于胞内c a 2 + 浓度的n o ， 而i n o s 催化产生大量的持续性的n o 直到底物消耗完。一般来说，i n o s 而不 是e n o s 和n n o s 催化产生大量n o 导致细胞或组织受损或死亡。然而，在某些 条件下，如组织的缺血再灌注及中风等过程中，充足的持续的高浓度细胞内c a 2 + 浓度使c n o s 也能产生大量的导致损伤作用的n o t 2 0 1 。i n o s 的调控主要是在转 录水平上的，刺激i n o s 表达的因子包括白细胞介素1 ( i l 1 ) 、白细胞介素一2 ( i l 2 ) 、肿瘤坏死因子一a ( t n f a ) 或脂多糖( l p s ) ，以及通常起配合作用的 6 干扰素一y ( i n f y ) 1 2 1 1 0 其它一些刺激剂包括能提高c a m p 水平的物质也可诱 导i n o s 的活化。而核转录因子n f r b 似乎是它们激活i n o s 的共同中介。n o 本身也可导致n f r , b 的转移，显示n o 可能可以充当自身合成反馈调控物2 2 1 。 3 3 一氧化氮合酶对一氧化氮生物合成的调控 n o 的生物合成主要受n o s 基因的表达、n o s 酶的活性及其底物和辅助因 子供给的影响。c n o s 催化合成p m o l l 水平的n o ，是c n o s 基因结构性表达 的结果，因此，c n o s 催化合成的n o 量主要取决于d n o s 的酶的活性、底物浓 度和辅助因子供给。e n o s 酶活性主要受细胞内c 2 + c a m 的激活和n o 的反馈 性抑制调节，n o 对e n o s 的抑制机理是n o 与c n o s 活性中心的血红素铁形成 复合物，使c n o s 失活1 。磷酸化水平也影响c n o s 的活性，体外研究结果显 示，对c n o s 的磷酸化作用导致其活性下降。此外，n c n o s 基因和e c n o s 基因 仍然存在基因的表达调控。例如，脑缺血、慢性盐胁追可使大鼠脑n c n o sm r n a 水平上升 2 4 1 ；而慢性缺氧会使大鼠和猪上皮细胞e c n o s 的表达增强，使人和牛 的内皮细胞e c n o s 的转录下降。n c n o s 基因表达中还存在m r n a 替换性剪切调 控；e c n o s 基因可能也存在亚细胞定位调控，并有实验证据显示e c n o s 只在细 胞的特定部位分布1 2 引。 i n o s 催化合成n m o l l 水平的n o ，约为c n o s 的1 0 0 0 倍。i n o s 是只有在 诱导作用下才表达的一种n o s ，其基因表达水平和活性受多种因素影响且具有 组织和细胞特异性1 2 6 1 。i n o s 与c a 2 + 亲和性很高，在基态c a 2 十水平下就可结合， 显示催化活性。因此，i n o s 催化合成n o 的调控主要受i n o s 基因水平和n o 反馈调节的影响【2 7 】。i n o s 基因表达水平的调控以转录水平的调控为主，在基因 的各个层次上进行；n o 对i n o s 的反馈调节与对e n o s 的反馈调节机制不同， 通过使i n o s 形成二聚体对其酶的活性产生抑制作用。此外，n o 还通过诱导p 5 3 表达，由p 5 3 相关途径抑制i n o s 基因表达水平【2 8 1 。许多刺激剂可诱导i n o s 基 因的表达，如白细胞介素1 ( 几1 ) 、白细胞介素2 ( i l 一2 ) 、a 一肿瘤坏死因子( t n f d ) 、脂多糖( l p s ) 以及y 一干扰素( i n f y ) 等【”。 4 一氧化氮的作用机制 n o 是一种旁分泌物质，可作为一种细胞内信使物质，其短暂的半衰期 ( t l ，2 = 5 1 0 s ) 又表明其具有激素样作用。n o 有亲脂性，能自由通过细胞膜， 7 低浓度的n o 刺激血红素蛋白s g c ，使三磷酸鸟苷( g u a n o s i n e t f i p h o s p h a t e g t p ) 转变成c g m p ，再依次特异性调节蛋白质磷酸化、离子通道的传导性、磷脂酶活 性；大量的n o 合成可见于免疫激活的巨噬细胞中，具有抗微生物和肿瘤活性。 4 1 环磷酸鸟苷的作用 n o 的作用靶( 受体) 是s g c ：n o 和g c 活性基团上的铁( f e 2 + ) 结合， 激活该酶，促进g t p 环化，产生c g m p ，升高的c g m p 再刺激c g m p 依赖的蛋 白激酶，调节磷酸二酯酶活性和离子通道的传导性，舒张血管，抑制平滑肌细胞 ( s m c ) 增殖，抑制血小板黏附和聚集，增加神经递质释放。因此，n o 的作用 与血红素( h b ) 的g c 催化g t p 转化为c g m p 的活性有关。 n o 激活s g c 的机 1 0 l - s g c 是一组二聚体血红蛋白，具有典型原卟啉的 可见吸收光谱。除铁外，铜也是一种具电子传递功能的金属。s g c 的两个公证的 血红素血红素结合位点是：一个恒定的半胱氨酸存在于s g c 的n 或1 3 亚单位 中，其两侧序列与鱼细胞色素p 4 5 0 中的等同：组氨酸仅存于1 31 亚单位中，且 在一4 位置上还保留一个亮氨酸，尽管s g c 的n o 激活机制尚需完善，目前倾向 于：n o 结合于s g c 的血红素部分，通过血红素- 铁复合体的解离，诱导s g c 的 构象发生变化而导致s g c 具催化活性的位点的抑制或激活。n o 是s g c 作用最 强、最有效的激活剂( c o 、羟自由基等也能激活s g c ) 。n o 过量刺激s g c 可导 致可逆性或不可逆性的酶的不应性。虽然s g c 的基本作用不依赖于血红素的含 量，但不含血红素的s g c 将不具有与n o 结合的能力。 环磷酸鸟苷的作用机制：1 调节c g m p 依从性离子通道；2 调节磷脂酶活性； 3 交叉激活c a m p 依赖性蛋白激酶；4 激活c g m p 依赖性蛋白激酶。 4 2 非环磷酸鸟苷的作用 n o 的大多数功能依赖于c g m p 信号传导机制。不过，免疫诱导的或c a 2 + 非依赖性n o s i i 产生的大量n o ，几乎能与每种细胞、蛋白质发生反应。活体条 件下，n o 能与0 2 、氧自由基、铁血红素、含巯基蛋白质等发生反应。多数情况 下，这些反应导致完整细胞及全酶功能的散失，活化的巨噬细胞能利用这些反应 中的部分功能作为对细菌、原虫、病毒的非特异性防御机制。因此，可以推测到 还存在有非c g m p 依赖的作用机制。还有人认为，n o 可通过不依赖于c g m p 的 作用机制来降低泡液中的游离c a ：+ 浓度而发挥生理作用。如n o 直接作用于靶细 胞，调节受体的敏感性。 尽管n o s 的作用机制尚不太清楚，但是利用酶学方法和免疫学组化技术已 经揭示出n o s 在哺乳动物的各种组织中存在【3 1j ，而且在鱼类、两栖类、甚至低 等无脊椎动物、细菌【3 2 ，3 3 1 等中也存在。一些细菌还能利用其它酶系和底物合成 n o 。因此，n o 的生命合成在生物界可以说是普遍存在。 由于n o s 分布的广泛性、n o 生物化学反应的复杂性口4 1 、n o 作用靶位【3 5 】 以及n o 生物学作用的多样性【3 ”，而n o 一旦生成其生物化学反应和生物学作用 很难控制，因此n o 的生命合成必将收到严格的控制。已有证据表明，n o 的生 物合成从一开始n o s 的转录翻译以及翻译后修饰就受到严格的调控，每催化n o 生物合成的过程中还受n o 的反馈调节、底物与辅助因子的可用性( a v a i l a b i l i t y ) 、 内源性l - a r g 类似物以及内源性蛋白抑制剂1 3 7 4 0 l 等多种因素的调控。 5 一氧化氨的生物学作用 n o 作为一种新型信号分子，具有调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等 功能；作为一效应分子，参与炎症与组织损伤恢复，在呼吸、消化、循环、免疫、 生殖等全身多系统的生理、病理及其有关临床疾病中起着重要作用：1 松弛平滑 肌；2 抑制血小板聚集及黏附，抗血栓形成；3 杀死或抑制病原体；4 抑制肿瘤 生长；5 寺申经传导功能：中枢神经系统和外周神经系统的信使物质。 有趣的是，n o 可能又是一种最不典型的神经递质。它不像其它递质储存于 突触颗粒中，不是以胞吐方式释放而是以扩散方式到达靶1 7 i 标：它也不作用于典 型的细胞表面受体，它的受体是鸟苷酸环化酶活性基团上的铁离子。但n o s 在 脑内分布并不完全与鸟苷酸环化酶分和相符合，因此，n o 可能在脑内还通过其 他途径发挥作用。 十余年的研究表明，n o 的内源性生物合成在哺乳动物机体各组织细胞普遍 存在，且在进化上具有保守性。不仅高等生物具有，而且低等生物也具有，并且 催化n o 生物合成的n o s 酶蛋白氨基酸序列在各生物之间以及各型n o s 之间具 有高度的同源性，因此内源性n o 生物合成的生物学意义必然具有多样性。n o 生物学作用多样性表现在其作用效果依n o 的来源与产量、n o 的作用靶位和机 体状况而异，有生理的、病理的、药理的和毒理的之别。 生理浓度的n o 参与诸多生理过程，在心血管系统中作为血管舒张的生理调 9 节剂【4 ”， 在免疫系统中作为免疫调节剂h 2 1 ，在神经系统中兼具神经递质和神经 调节的双重作用，在内分泌系统中具有激素样作用【矧。随着研究的深入，发现 越来越多的病理变化或来源于n o 生成不足或是n o 生成过量【4 ”。n o 生成不足， 自然n o 介导的生理过程无法完成。如在心血管系统中，n o 生成不足将出现高 血压症状。而n o 生成过量，过量的n o 将通过与蛋白质、脂肪、核酸等生物分 子相互作用损坏机体组织，破坏细胞、机体稳态，对机体产生毒性。这种情况的 发生源于诱导型n o s ( i n o s ) 在免疫刺激作用下被诱导生成，催化n o 持续大量 产生1 4 “。其目的本来是为了抑制或杀死病毒、细菌和肿瘤等寄生物，但是，由 于机体组织有更多的n o 作用靶位使得n o 不可避免地伤及机体自身组织。 n o 生物学作用主要是作为信使分子广泛地参与胞间与胞内信号传递而实现 的。n o 作为胞间信使表现为血管舒张的生理调节剂、神经递质和神经调节、免 疫调节和旁分泌激素。作为胞内信使，n o 主要通过作用于细胞信号系统而发挥 作用。当然n o 作为胞间信使肯定也是通过作用于细胞信号系统而起作用的，只 是n o 来源于其它细胞。 细胞信号系统是由于传递者在细胞这一层次组成的一个传递和信号转导的 网络系统。细胞信号系统稳态的维持是细胞生命活动j 下常进行的基础。而细胞信 号系统稳态维持的物质基础则是参与细胞信号系统的蛋白质、酶以及由蛋白质和 酶所控制的小分子，这些大分子和小分子之间相互调节( c r o s s t a l k ) 的有序进行 使得细胞稳态得以维持。n o 以其特有的生物化学反应性和富含n o 潜在作用位 点( 如血红素非血红索金属离子巯基和酪氨酸残基等) 的蛋白质和酶的作用，通 过改变蛋白质和酶的构象而调节其活性从而广泛地与细胞信号网络系统。至今已 发现受n o 调节的细胞信号系统的蛋白质和酶有g 蛋白，s g c 、i 型腺苛酸环化 酶、蛋白激酶c 、离子通道、离子泵、受体、a d p 核糖基转移酶和蛋白磷酸化 酪氨酸磷酸酶( p h o s p h o t y r o s i n ep r o t e i np h o s p h a t a s e ) 等【4 ”5 1 。n o 调节的参与细 胞信号系统的蛋白质和酶必将随着研究的深入而增加，因为大多数蛋白质和酶都 存在n o 潜在的作用位点。n o 通过对以上蛋白质和酶的活性调节而调节细胞内 第二信使、离子稳态以及其它蛋白质和酶的磷酸化，脱磷酸化、a d p 一核糖基化等 共价修饰，n o 对细胞信号系统成分的调节在细胞内通过级联放大和互相作用而 实现n o 修饰功能的网络化，最终调节细胞功能。 1 0 n o 不仅参与细胞信号网路系统，而且还影响遗传信息的保持，调节遗传信 患翡爨遴鞠表达。n o 对逶蕊售患豹影豌毽括蘧个方瑟；一方羲，n o 聚霹逶遭 与核酸碱基作用而破坏核酸结构t 5 期，又可通过抑制d n a 连接酶的活性而抑制对 d n a 损伤的修复1 53 。，导致细胞毒蚀和遗传毒性；另一方面，n o 也可通过激活 d n a 攒绕修复酶搿l 鼷修复按经熬d n a 。虽然这耱骛复有羁予逶簧镕惑l l 孽绦持， 但是，窳修复过程中消耗大量的n a d 和a t p ，因此这种n o 对d n a 损伤修复 酶活性的激活被认为甜细胞整体怒有害的，并被认为是n o 神经毒性的熏要表 臻。n o 瓣遗揍售惑徒递蟊表达弱影穗燹涉及多令方瑟，包据壤坏d n a 调节蛋 白的结构、抑制d n a 合成过程中的关键酶活性、影响转录因子n f - k b ，a p 一1 ， c r e b ，o x y r 等的活性1 5 5 - 5 7 】，通过与铁离子调节因子作用在转录后水平控制基 因嚣表遮 5 嚣1 ，苁瑟爨理n o 露遗传信患弱缝挎、转遴和表达瓣全遂程瀵节。 6 一氧化氮在生殖系统中的作用 n o 作为一种多功能的分子，在许多生理系统的信号传递中起重要作用，其 在生殖活动中的作用逐渐受到人们的关注而成为生殖生物学家研究的新领域。在 生殖系统中，n o 参与精子的发生、精子的获能、卵母细胞的成熟和排卵、胚胎 发育、胚胎植入和妊娠维持等多种重要的生殖活过程6 m 6 1 】。 6 1 n o 在雄性生殖系统中的作用 6 1 2 n o 对精子发生的作用 z i n i 等【6 2 】利用e n o s 单克隆抗体免疫组化定位n o s 蛋白发现，在睾丸精子 发生全部阶段的l e y d i g 细胞和s e r t o l i 细胞的胞浆中，可见e n o s 的表达，而且 在附睾和输精管上皮细胞及所有组织的内皮细胞中也发现有e n o s 分布。i f 常生 殖细胞中未发现有e n o s 的分布，但从退化的和凋亡的生精内精原中检测到 e n o s 的存在。康友敏等【6 3 】采用免疫组织化学染色及体视学图象分析等方法，对 生后1 d 至生后2 4 月龄的大鼠睾丸e n o s 的表达的变化进行了系统研究，结果提 示n o 参与精子的生成及睾丸的分泌过程，衰老时e n o s 阳性表达显著增加，这 种变化可能会抑制睾酮的分泌，最终会影响睾丸的生精功能。另外，早熟脱落的 精母细胞和精子细胞中亦发现有较强的e n o s 表达。提示e n o s 在精子生成和生 殖细胞退化中具有一定的作用。在某些疾病情况下，n o 生成过多使睾丸生精功 能及精子生活内环境发生改变，造成少精、死精、精子质量差导致不育。有研究 发现，在局部缺血的黎丸中，在缺j 舡第1 天内就可以观察到灶性精子紊乱。用免 疫组纯方法捡溅n o s 殛蠡发瑗，京鼹帮竣盘纛熬睾蔻辘应帮位，在怼落弱小管 生精上皮细胞胞浆中有特别强的免疫染色，提示精子发生过程紊乱与n o s 含量 增多有关。 & 1 。3 n o 对糖子瀣力瓣影穗 n o 对精子运动功能的影响具商剂量依赖效应。有研究发现；n o 在低浓度 ( 硝普钠( s n p ) ：1 0 9 1 0 _ 7 m o l l ) 时显著促进精子运动；在中等剂量( s n p ： 1 0 “1 0 。t o o l ) 瓣对精子运动影响甚皴；懑浓度( s n p 1 0 m o l l ) 薅 则明显抑制精子运动【棚。c r e e c h 等鄹也同样证宓了n o 在低浓度( s n p ：l x l 0 6 m ) 时对精子活力的促进作用和蔼i 浓度( s n p ：1x 1 0 _ 2 m ) 时的抑制作用。目前 试隽，n o 簿羝藏子潺力霹戆与搀潮缍蘧呼蔽畜关，瑟与罐麓缀蕤内e g m p 合痰 无关。精子运动需要消耗a t p 作为能源，对呼吸的抑制可能干扰a t p 的产生， 从而抑制精子的运动。n o 抑制a t p 合成酶活性，降低细胞内a t p 水平，已在 多穗缡耱沟被证翻f 删。嚣努，n o 与释啜链伐 垂 垒蔽豹超氧爨离子反应生袋禚毒 的过氧化亚硝酸根离子( o n o o 一) ，亦是导致精子运动能力下降的原因之一。 低浓度的n o 促进精子运动的机制目前仍不清楚。h e l l s t o m 等6 7 1 认为照n o 对氧鑫露基鹣薅握臻凄予簇囊爱避甄豫承乎下降造藏豹。毽蹇骞不霜鼹点，商天 认为可能与n o 存在的氧化还原状态有关，因其状态不同，可以对细胞起破坏或 保护作用【6 踟。 6 。i 。4n o 对耱予获楚纛臻俸发藏( a i r ) 熬彩嚷 哺乳动物精子的获能和a r 魁精卵结合、正常受精的前提，具有极其蕨要的 生殖生蠼意义。抑制精予的获能和降低a r 百分率必然导致生育能力低下。 h e r r e r o 等1 6 9 1 在骚究入类精子n o 豹产生与糖予获链嚣穗子蛋癌酪氯酸磷羧纯关 系时发现，培养介质中n o 释放荆促进了人卵泡滤液( f f ) 所诱导的a r ，而 n o s 抑制物则降低了a r 百分率；同时发现，n o 参与调节精予蛋白酪氨酸磷酸 恁，强暴精予获戆秘被n o 潺节涎熬羹裴磷酸稼蠢紧密联系。h e r r e r o 等入还发 现，孕酮可赢接刺激获能后鼠精子n o s 活性，同时可引起精予中前列腺索e z ( p g e ：) 增多和继发的a r 。而在孕酮诱导的a r 中，e g m p 水平没有改变。提 示杰孕瀚诱发翁矮侮茨瘦孛，n o 至少痒为鞠蕤肉薅饺逶过蘩l 激p g e ：生戏露起 1 2 作用。r e v e l l i 等7 0 】证实，由卵泡滤液蛋白( p f f ) 诱导的a r 被血红蛋白和l 刀豆氨酸所抑制；而s n p 、s 亚硝基一乙酰青霉胺( s n a p ) 、亲核n o 供体( d e t a n o n o a t e ) 等则能提高a r 百分率。至于n o 浓度对精子获能和a r 的影响，目 前尚不清楚。s e n g o k u 等人【7 1 1 实验证明，低浓度n o ( s n p ：1 0 8 1 0 m o l l ) 可提高精子获能，但不影响精子活力和a r 百分率。另有研究表明高浓度n o 能 够抑制精子获能和降低精子a r 百分率【7 2 】。 6 2 n o 在雌性生殖系统中的作用 6 2 1 n o 对卵巢功能的调节作用 研究表明，卵巢中存在着n o 产生系统，它是一种重要的卵巢功能调节因子。 n o 参与卵巢中卵泡发育、成熟、排卵以及黄体溶解过程。 卵泡膜细胞和颗粒细胞中的存在e n o s 蛋白表达，在卵泡和已排出的卵母细 胞中也存在e n o s 的特异性表达，n o 代谢产物硝酸盐亚硝酸盐在体内循环系统 中的含量随着卵泡发育进程而增加，说明卵巢中产生的n o 对卵泡发育具有重要 作用。e n o s 基因敲除研究表明，基因敲除小鼠的卵泡和卵母细胞发育出现缺陷， 表现为生长卵泡数量减少、排出的卵母细胞减数分裂成熟异常，只有少数卵母细 胞发育至第二次减数分裂中期，卵母细胞的死亡率较高【7 3 l 。据s h u k o v s i k i 等人 ”j 报道，在体情况下使用n o s 抑制剂可以抑制人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 诱导的 大鼠卵巢的排卵过程，而n o 供体可以逆转这种抑制作用，说明n o 参与卵巢排 卵过程。e n o s 基因敲除小鼠排卵率明显降低，仅为正常小鼠排卵率的5 0 ，而 且卵巢中新形成的黄体数( 相当于卵巢的排卵数) 较正常小鼠少1 7 4 1 。这些研究 结果说明在小鼠排卵过程中n o 有重要作用。进一步研究发现，i n o s 亚型是排 卵过程的主要参与者，它催化产生的n o 通过促进前列腺素e 和前列腺素f 合 成的增加，从而刺激卵泡破裂及促进卵巢排卵【7 5 】。 n o 对卵巢性腺类固醇激素分泌也起着重要的调节作用。卵巢分泌的性腺类 固醇激素主要为雌激素和孕酮，现在证实n o 能调节雌激素和孕酮的合成。l i s a 等使用n o s 抑制剂和n o 的供体，证明n o 能下调大鼠卵巢分泌雌激素和孕酮， 但d o n g 等在大鼠整体卵巢体外培养模型上，却发现n o s 抑制剂l n a m e 能上 调孕酮的分泌而下调雌二醇的分泌，并且可逆转p g f 2 。对孕酮分泌的抑制【7 6 l ，可 见有关n o 对孕酮分泌的影响，不同作者的结果有争议。但目前大多数的研究支 持n o 上调孕酮分泌的实验结果，因为敲除小鼠e n o s 基因后，小鼠卵巢分泌孕 酮显著下降。 6 2 2 n o 对卵母细胞成熟及排卵的影响 卵母细胞成熟包括核成熟和质成熟，是指卵母细胞恢复减数分裂并进一步发 育到第二次减数分裂中期的过程。卵母细胞的成熟需要特定的基因在特定的时期 准确地表达。虽然，目前已有的结果表明有多种分子参与了上述过程，但第一个 研究n o 对卵母细胞成熟影响的是j u n 等( 1 9 9 7 ) 。他在体外灌注免卵巢模型上的 研究证明：灌注液中加入l n a m e 并不影响被灌注卵巢排出的卵子的减数分裂 的成熟。随后，a l b i n a 等( 1 9 9 8 ) 否定了j u n 等的实验结果。因为a l b i n a 等发现： 小鼠体内注射n o s 抑制剂，抑制n o 的产生后，不仅排出的卵子数量减少，而 且卵子的减数分裂也不正常。紧接着a l b i n a 等又于2 0 0 0 年报道1 7 7 】：敲除e n o s 基因的小鼠，卵巢重量下降，卵巢中卵丘一卵母细胞复合体( c o c ) 数目下降，将 c o c 在体外培养，发现减数分裂恢复的情况和1 9 9 9 年报道的结果相似。2 0 0 1 年k a z u o 等的实验进步证实：n o 在卵母细胞成熟中起着关键的作用，而且这 种影响和卵丘细胞有关f 7 8 】。 排卵是一个极其复杂的过程，涉及多种卵巢细胞，需要多种信息传递途径和 多种特定基因的控制性表达。目前大量的资料表明n o 与排卵有关。s h u k o v s k i 等( 1 9 9 4 ) 发现n o s 非特异性抑制剂a g 和l - n m a 都能剂量依赖性地显著抑制大 鼠的排卵，且此抑制作用能被一氧化氮供体s n p 逆转。 6 2 3 一氧化氮与着床的关系 由于一氧化氮的半衰期极短，为证明子宫蜕膜在胚胎着床期间的确产生一氧 化氮，研究人员采用多种技术检测子宫蜕膜n o s 的表达及其活性。例如：免疫 组化技术可在小鼠子宫蜕膜组织检测到i n o s 和e n o s 的免疫性。有文献报道【7 9 1 ， 从妊娠第6 d 开始，小鼠胚胎着床部位的i n o s 含量较其四周显著上升，并且持 续上升至妊娠8 d ，e n o s 的含量也有相同的变化，其含量于妊娠第6 7 d 达峰值。 为探讨一氧化氮在着床过程中的作用，人们设计了相关的动物模型：给予妊 娠动物n o s 的竞争性抑制n 一硝基一l 一精氢酸甲基酯( l - - n a m e ) ，观察其对 胚胎着床的影响，从而间接地了解一氧化氮在着床过程中的作用。n o v a r o 等对 妊娠大鼠官腔注射l - - n a m e ，发现着床的胚胎数减少了5 0 进一步说明一氧化 氮在着床过程中的作用。着床过程需要血管渗透性增加以及囊胚着床部位子宫静 止。一氧化氮作用内皮原性舒张因子，具有强大的血管舒张作用，它还可增加血 管的通透性，抑制平滑肌收缩，因此一氧化氮可能通过这些机制在着床过程中发 挥作用。 6 2 4 一氧化氨与胎盘屏障的关系 胎盘是母体与胎儿物质交换的重要场所，也是母体对胎儿产生免疫耐受及 母体保护胎儿免受某些外源性病原体侵袭、维持妊娠的屏障。研究表明，巨噬细 胞来源的i n o s 在胎盘组织中广泛分布，并与某些免疫因子相互作用，是维持胎 盘屏障作用的基础。免疫组化显示，正常孕妇各孕期羊膜及绒毛膜间质的纤维细 胞均存在i n o s 。蜕膜组织c d l 4 巨噬细胞阳性，而在c d l 4 单核巨噬细胞浸润的 胎膜组织同时显示有i n o s 存在，羊膜上皮和绒毛滋养细胞则无i n o s ，说明蜕 膜巨噬细胞和胎膜纤维细胞的n o s 参与构成正常妊娠胎盘免疫屏障。 6 2 5 一氧化氨与孕期的关系 妊娠期由于胎儿生长发育的需要，母体将发生一系列适应性变化：血容量增 加，血压下降，血液重新分布；胃肠道平滑肌蠕动减弱。许多动物和人体实验发 现，妊娠期多种组织中一氧化氮合成酶( n o s ) 催化活性增加，一氧化氨代谢产物 水平升高。沈文洁等研究也发现，妊娠妇女外周血一氧化氮终产物显著高于非孕 期妇女，而一氧化氮具有扩张血管、舒张平滑肌、抑制血小板粘附聚集的作用， 从而认为一氧化氮是母体适应妊娠的一种生理性变化。c h w a l i s z 8 0 1 等用荧光分光 光度计测定了不同时期正常妊娠妇女的妞浆一氧化氮变化，发现正常孕妇的血浆 一氧化氮值从孕早期开始显著高于正常非妊娠妇女，在孕中期达高峰，从孕晚期 开始明显下降，产后逐渐接近非孕状态，说明妊娠期间母体血管内皮细胞合成、 释放一氧化氮增加。s h il 【8 l 】等提出妊娠期问一氧化氮在维持胎儿获得足够的皿 液供应中起主要作用。近年研究又表明，妊娠时一氧化氮还可抑制子宫收缩，分 娩时因一氧化氮释放减少，可减弱其对子宫收缩的抑制作用，有利于分娩。 6 2 7 一氧化氮与分娩发动的关系 关于分娩发动富缩产生的原理，目前仍不甚清楚，主要学说认为分娩发动与 母儿的内分泌状况有关。m o n c a d a 8 2 1 等认为，随着妊娠的进展，胎儿、胎盘循环 系统合成、释放一氧化氮减少，子富收缩额度增加，此种作用受雌、孕激素的影 响。y a l l a m p a l i 8 3 1 认为，孕酮通过调节血管壁中l 一精氨酸及组织细胞内c g m p 的含量来完成此种调控反应的，即分娩前孕酮水平增高，促进一氧化氮合成、释 放增加，抑制子宫收缩。而分娩时孕酮水平降低，使之一氧化氮减少，导致它收 缩增强，并触发和维持分娩；分娩后一氧化氮进一步减少，有利于子宫复旧。 7 一氧化氮的研究方法 n o 的研究主要是通过研究n o 的生物合成对分子、细胞、组织及机体的影 响从而为阐明生物学现象的机制，并为治疗与n o 生成有关的疾病提供有效的方 去。n o 的研究方法正随着人们对n o 认识的深入以及生物学技术的发展而变得 越来越有助于提供接近机体自然状态的有关n o 的信息。 n o 的最强研究主要集中于研究n o 或蕴一氧化氮物质( n i t r i c o x i d e g e n e r a t i n ga g e n t s ) 即那些能提供酶促和非酶促反应生成或释放n o 的物质 ”，如硝普钠( s o d i u mn i t r o p r u s s i d e ，s n p ) 、亚硝酸盐、亚硝酸酯、有机硝酸酯、 s 皿硝酸青霉胺( s n a p ) 、3 一吗啉代斯德亚胺( s i n ) 、羟胺以及l 。a r g 对组织 器官的作用或对来自组织器官的s g c 的影响。8 0 年代中期随着内源性n o 生物 合成途径的发现，人们认识到n o 的生物合成是在一种特别的酶的催化作用下由 氧化l a r g 的胍基氨而生成的。这样，蛋白质、酶和核酸技术就以极快的速度引 入到n o 的研究中来，尤其是分子生物技术的引入极大的丰富了n o 的研究方法， 同时也使得人们对n o 的认识更加深入。综合该领域的研究成果，有关n o 的研 究方法可归纳如下： 1 ) 利用外源性蕴一氧化氮物质作为n o 的来源来模拟n o 对分子、细胞、组织 器官和机体的作用。这些化合物在n o 的早期研究中为确立n o 的生物学作用以 及为阐明一些抗高血压药物的作用机制起着重要作用，一些蕴氧化氮物质至今 仍作为n o 的供体在广泛应用着8 5 j 。 2 ) 利用n o 清除剂( s c a v e n g e r ) 来研究n o 被清除时的影响。n o 具有自由基性 质，既有氧化性又有还原性，有较强的化学性，能以多种方式与不同的物质发生 化学反应。 3 ) 利用n o s 的诱导剂或阻断剂来改变n o s 的酶活性来观察n o 生成变化的后 果。 4 ) 组织化学和细胞化学技术的应用不仅有助于了解n o s 的分布、定位，而且有 1 6 助于阐明n o s 表达的功能及其对组织发育的关系。 5 ) 利用现代分子生物学技术提供对n o s 基因进行操作来研究n o 的生物学作 用。对n o s 基因进行基因敲除技术( g e n ek n o c k o u tt e c h n i q u e ) 这些最新生物学 技术在n o 研究中的应用更客观的地认识n o 的生物学作用，为研究某些疾病的 病因以及为之提供根本的治疗方法开辟了一条道路。 总之，n o 测定方法在不断改进。n o 化学性质活泼，半衰期短，除应用电 子自旋共振光谱法e s r 和电化学方法能直接测定组织细胞中n o 的含量外，目 前建立的检测方法主要是基于n o 生成和代谢特性及生理功能，测定组织细胞内 c g m p ，l c i t ，n o z 一n 0 3 一含量和n o s 活性反映组织细胞n o 含量以及采用分 子生物学技术检测n o sm r n a 的表达。这些方法包括：电化学法、e s r 法、c g m p 法、胍氨酸含量测定法、n 0 2 一n ( 3 3 - 含量的测定、形态学方法、血红蛋白测定法、 化学发光法和分子生物学技术。现在有的生物公司有专门的测定n o 或n o s 的 试剂盒出售。 8 一氧化氮与早期胚胎发育