（分析化学专业论文）荷正电聚合物为探针共振光散射光谱法检测生物大分子.pdf

两南大学硕+ 学位论文中文摘要 荷正电聚合物为探针共振光散射光谱法检测生 物大分子 分析化学专业硕士研究生杜娟 指导教师郑鹄志副教授 黄承志教授 ( 摘要) 自从1 9 9 3 年p a s t e r n a c k 等人利用普通的荧光分光光度计建立共振光散射技术以来，共振光散射 技术现得到了广泛的运用，已分析科学领域的重要一部分。 蛋白质和核酸都是重要的生物大分子，是生命体的土要基本物质，在生命活动中扮演着重要角 色。因此对它们进行测定是分析工作者的重要内容。本文选用了一线性阳离子高分子聚合物，聚( 4 乙烯基n 乙基) 吡啶季铵盐作为探针，利用共振光散射光谱法分别建立了测定蛋白质和d n a 的新 方法，并将该探针用于杂交检测中。主要研究内容如下： 1 研究了聚合物与蛋白质的相互作用，优化出最佳反应条件，通过计算得到了蛋白质与聚合物 的结合比、结合常数等数据，建立了一种测定蛋白质的新方法。在p h 值为7 5 4 的b r 缓冲介质中， 体系在4 7 0 n m 处产生最人的共振光散射信号，在最佳实验条件下反应体系增加的r l s 值与b s a 和 h s a 分别在3 5 1 0 母2 1 1 0 。7m 和3 3 l o 9 1 7 1 0 7m 范围内成线性，检出限分别为1 2 1 0 母m 和 1 2 1 0 dm 。并利用此方法对蛋白合成样进行了测定，测定结果令人满意。 2 研究了聚合物与小牛胸腺d n a 的相互作用，优化出最佳反应条件，通过计算得剑了d n a 与 聚合物的结合比、结合常数等数据，建立了一种测定d n a 的新方法。在p h 值为7 0 的p b s 缓冲、离子 强度为0 0 3 0 0 m 的介质中，体系在3 4 4 8 n m 处产生最大的共振光散射信号，在反应的最佳条件下反应 体系增加的r l s 与小牛胸腺d n a 的浓度在0 0 9 0 0 至2 7 0g g m l 范围内成线性，检出限为1 7 n g m l 。 3 将聚合物用t - d n a 杂交的检测当中，基丁聚合物与单链d n a 和双链d n a 反应前后r l s 信 号的不同，实现了完全互补序列与单碱基错配序列及非互补碱基序列的区分，建立了一种简单、快 速、免标记的d n a 杂交检测方法。在p h 值为7 0 ，离子强度为0 0 3 0 m 的p b s 缓冲介质中，在4 7 0 n m 处产生最人的共振光散射信号，在最佳条件下，靶物d n a 在5 0 5 0 0 n m 的浓度范围内线性良好， 检测限约为2 n m 。 关键词：共振光散射聚( 4 一乙烯基一n 一乙基) 吡啶季铵盐d n 蛋白质 两南大学硕十学伊论文a b s t r a c t i p o l y m e o fb i o m r e s o n a n c e l i g h t ra sap r o b ef o rt h e a c r o m o l e c u l e sb y s c a t t e r i n g m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m s i t r yp o s t g r a d u a t e ：j u a nd u s u t a s s o c i a t ep r o f e s s o rh u z h iz h , g b u p e r v i s o r ：a s s o c i a t eps s o rhh l p r o f e s s o rc h e n g z h ih u a n g a b s t r a c t s i n c et h ee s t a b l i s h m e n to fr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) t e c h n i q u eb yp a s t e m a c ke ta 1 u s i n gc o m m o nf l u o r i m e t r i ci n s t r u m e n ti n19 9 3 ，i th a sb e e na p p l i e dw i d e l ya n dd e v e l o p e d q u i c k l y ，n o wi ti san e c e s s a r yp a r ti na n a l y t i c a lr e s e a r c h b o t hp r o t e i na n dn u c l e i ca c i da r ei m p o r t a n tb i o m a c r o m o l e c u l e s t h e ya r et h em a t e r i a l b a s eo fl i f e ，a n dp l a yv e r yi m p o r t a n tr o l e si np r o c e s so fl i f e s oi ti so fs p e c i a lv a l u et ot h e d e t e r m i n a t i o no ft h e s eb i o m a c r o m o l e c u l e s ，t h i st h e s i sc h o o s eap o s i t i v ec h a r g e dp o l y m e r , q u a t e r n i z e dp o l y ( 4 - v i n y l - n - e t h y l ) p y f i d i n i u m ( p v p c 2 h s b r ) a sap r o b e ，u s i n gr e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n gt e c h n i q u e ，e s t a b l i s h e dn e wd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fp r o t e i na n dd n a ，a n du s e t h i s p o l y m e ri n t o t h ed e t e r m i n a t i o no fd n ah y b r i d i z a t i o n t h em a i nc o n t e n t so f i n v e s t i g a t i o ni nt h ec o n t r i b u t i o na r ea sf o l l o w s ： 1 w es t u d i e dt h er e a c t i o nb e t w e e np o l y m e ra n dp r o t e i n ，f o u n do u tt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s ，a n do b t a i n e dt h eb i n d i n gr a t i o na n db i n d i n gc o n s t a n te ta 1 b yc a l c u l a t i o n ，a n d e s t a b l i s h e dan e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n i nt h eb - r b u f f e ro fp h7 5 4 ，r l s o fp o l y m e r - p r o t e i ns y s t e mw i t ht h em a x i m u ms c a t t e r i n gp e a kl o c a t e da t4 7 0 n m u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n s ，o v e rt h er a n g eo f3 5 x 1 0 9 - 2 1 x 1 0 。7 mf o rb s aa n d3 3 x 1 0 - 9 1 7 x 1 0 mf o rh s a w i t ht h el i m i to fd e t e r m i n a t i o n1 2 x10 - 9 mf o rb s aa n d1 2 x10 - 9 mf o rh s a w ea l s ou s et h i s m e t h o dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fs y n t h e t i cm i x t u r e so f p r o t e i n s ，t h er e s u l t sw e r es a t i s f i e d 1 1 两南大学硕十学何论文 a b s t r a c t 2 w es t u d i e dt h er e a c t i o nb e t w e e np o l y m e ra n dc a l ft h y m u sd n a ( c t d n a ) ，f o u n do u t t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，a n do b t a i n e dt h eb i n d i n gr a t i o na n d b i n d i n gc o n s t a n tb yc a l c u l a t i o n ， e s t a b l i s h e dan e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd n a i nt h ep b sb u f f e ro f p h 7 0w i t hi o n s t r e n g t ho 0 3 0 0 m ，r l so fp o l y m e r - d n as y s t e mw i t ht h em a x i m u ms c a t t e r i n gp e a l 【l o c a t e d a t3 4 4 8 n m u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt o t h ec o n c e n t r a t i o no fd n ao v e rt h er a n g eo f0 0 9 0 0t o2 7 0i t g m l ，w i t ht h el i m i to f d e t e r m i n a t i o nl7 n g m l 3 w eu s et h i sp o s i t i v ec h a r g e di n t ot h ed e t e r m i n a t i o no fd n a h y b r i d i z a t i o n ，p r o p o s e da s i m p l ea n ds p e e d ya s s a yf o rs p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d es e q u e n c e sa n ds i n g l e - b a s em i s m a t c h b a s e do nt h ed i f f e r e n tr l ss i g n a l so fp o l y m e r s s d n aa n dp o l y m e r d s d n a ，a n de s t a b l i s h e d an e wn o n - l a b e l e dm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd n a h y b r i d i z a t i o n 。i nt h ep b sb u f f e ro f p h 7 0 ，i o ns t r e n g t h0 0 3 m ，r l so fp o l y m e r - d n as y s t e mw i t ht h em a ) ( i m u ms c a t t e r i n gp e a k l o c a t e da t4 7 0 n m u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no ft a r g e td n a o v e rt h er a n g eo f5 0t o5 0 0 n m w i t ht h e l i m i to fd e t e r m i n a t i o na b o u t2 n m k e y w o r d s ：r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ；q u a t e r n i z e dp o l y ( 4 - v i n y l - n - e t h y l ) p y r i d i n i u m ( p v p c 2 h s b r ) ；d n a ；p r o t e i n i i i 两南大学硕十学位论文 缩乍亏符号对照表 缩写符号对照表 i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了标注。 学位论文作者： 签字日期：口7 年驴占月口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保 密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： 粗埔 签字日期： o 弋年口月p 7 日 导师签名：每名多乞 签字日期：口r go b y 3 口7 日 两南大学硕十学何论文第1 章综述 第1 章综述 1 。1 共振光散射光谱法简介 1 1 1 光散射现象 当一束光通过介质时，在入射光以外的各个方向都能观测到光强的现象即为光散射 现象。光是一种电磁波，在传播时其交变的电磁场与可极化的介质分子发生强烈的相互 作用，这些介质分子会被诱导产生以电磁场的频率振荡着的电偶极子。根据电磁理论， 振动着的电偶极子是一个二次波源，在各个方向上发射的电磁波就是散射波。如果介质 均匀，则产生的散射光互相抵消，如果是不均匀介质，就出现了光散射现象【i 】。 根据粒子的颗粒大小不同，又可以发生两种情况，一是当微粒直径大于入射光波长 很多倍时，这时候的散射光被认为是光的反射或折射。二是当微粒直径小于入射光的波 长时，就能产生光的散射。光散射现象是一种常见的物理现象，早已被人们所熟识。1 8 6 9 年，英国科学家丁达尔发现了胶体溶液的丁达尔散射现象，并对其进行了深入的研究。 能产生散射现象的一般是溶胶，散射光的强度随粒子体积的减小而明显减弱，所以真溶 液的散射光很弱。另外，散射光的强度还随分散体系中粒子的浓度增大而增强，所以， 可以掘此来区分胶体和溶液。 根据入射光与散射光波长的不同关系，光散射又可以分为弹性散射、准弹性散射、 非弹性散射三种情况： ( 1 ) 弹性散射( e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) ，是指光与散射质点作用时没有能量改变，散射 光波长与入射光波长相等的散射，又称为经典散射或静态光散射，瑞利散射、丁达尔散 射都属于这一种。 ( 2 ) 准弹性散射( q u a s i e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) ，是指由于散射质点不停地做布朗 运动而引起的多普勒效应导致了散射光波长以入射光波长为中心展开的现象，导致散射 光波长与入射光波长有微小的差别，即为动态光散射。 ( 3 ) 非弹性散射( i n e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) ，是指光与散射质点作用时有能量增加 或损失的散射，散射光波长不等于入射光波长，即在作用过程中有频率位移产生，拉曼 散射、布里渊散射都属于非弹性散射，其中拉曼散射是现在研究最深入，使用最广泛的 散射。 1 1 2 共振光散射光谱法简介 1 9 9 3 年，p a s t e m a c k t m 利用普通的荧光分光光度计研究了卟啉在d n a 上的聚集，发 现了灵敏而丰富的信号，从而建立了共振光散射( r l s ) 技术。1 9 9 5 年，p a s t e m a c k 正式 - 两南人学硕十学位论文第1 章综述 提出了共振光散射技术1 3 j 这一名词，并且指出了该技术的优点：( 1 ) 操作简便；( 2 ) 灵 敏度高。并将其成功的应用于卟啉类化合物4 郴】、金属配合物【i i 】、及叶绿素分子等有 机染料的自组装和聚集行为的研究中。 共振光散射主要是指当入射光位于或接近分子吸收带时，电子吸收的电磁波频率与 散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光能量并产生的再次散射。共振光散射是一种散 射波长等于入射波长的弹性散射光，其强度与颗粒尺寸、溶液浓度、溶液折射率的波动 值以及入射波长等因素有关 1 3 , 1 4 】。在普通的荧光分光光度计上，采用相等的激发和发射 波长进行同步扫描，得到的同步荧光光谱即为共振光散射光谱【1 5 。1 引。在仪器的条件一定 时，体系的共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比，此为共振光散射光谱法定量分析 的理论基础【1 7 , 1 9 , 2 0 。 1 1 3 共振光散射技术在生物大分子分析中的应用 共振光散射光谱法由于具有分析速度快、灵敏度高、操作简便等优点而倍受分析工 作者的关注，在分析化学的各个领域都得到了广泛的运用，涵盖了无机金属离子【2 1 以】、 表面活性剂2 5 1 、蛋白质【2 6 ，2 7 1 、核酸 2 8 - 3 1 】、糖类【3 2 】、抗癌药物【3 3 - 3 5 1 、纳米粒子例等众多 分析领域。现阶段，共振光散射光谱法与紫外可见吸收光谱法、荧光光谱法等光谱法 互为补充，是一种重要的分析方法。 1 。2 共振光散射光谱法应用于蛋白定量检测 生命活动涉及多种物质的参与、相互作用和转化，其中最重要的当属核酸和蛋白质。 蛋白质是人、动物、植物和微生物等细胞的主要成份，是生物性状的直接表达者，担负 着各种各样的生理功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行。蛋白质的研究对生 命科学、生物化学、临床医学等都有十分重要的意义。蛋白质的定量分析是生化、药物、 食品及临床分析最常涉及的内容，也是临床检验中诊断疾病及检查疾病治疗后康复情况 的重要指标，又是许多生化药物分离提纯和质量检验中最常用的手段。 1 2 1 蛋白的常用检测方法 测定蛋白质含量的方法有很多，早在1 8 8 3 年，k i e l d a h l 就发明了凯式定氮法，这也 是测定蛋白含量最经典的方法。目前最常用的是分光光度法和荧光光度法，近年来，又 发展了许多种新的分析方法。 1 2 1 1 凯式定氮法 凯式定氮法测得的是蛋白中的总氮量。测定的原理是依据蛋白样品加热分解产生 氨，用酸吸收后再进行滴定。根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。凯式定 氮法可以用于标准蛋白质含量的准确测定，但灵敏度很低，操作费时，并且，由于测得 2 两南：欠学硕十学何论文 第1 章综述 的是蛋白中的总氮量再进行的换算，蛋白中的非蛋白氮会对其产生很大的干扰。如之前 的三聚氰胺事件，不法分子正是利用了蛋白检测的这一漏洞，往奶粉中加入了含氮量高 达6 6 7 的三聚氰胺，从而提高奶粉的蛋白质检测量。 1 2 1 2 分光光度法 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基，在2 8 0 n m 附近 有特征的紫外吸收峰，因此可以直接利用蛋白质的吸收光谱测定纯的蛋白质溶液以及分 析蛋白质的结构信息【3 7 l ，该方法操作简单、灵敏、快速，但因为在2 6 0 n m 附近有核酸 的特征光吸收，因此在测定的时候存在着较大的干扰。 绝大部分蛋白质在可见光区无吸收，但蛋白质可以和许多试剂相结合，发生反应引 起颜色的变化，从而可以在可见光区进行蛋白质的分析。常用的探针可以分为四类：金 属探针、染料探针、金属络合物探针、纳米粒子探针。 ( 1 ) 金属探针 常用的测定方法有双缩脲法、劳里法、4 喹啉甲酸法( b c a 法) 等。 双缩脲是第一个用比色法进行蛋白质浓度测定的方法。它是基于蛋白质的双缩脲反 应的方法【3 8 】。当含有两个或以上肽键的物质在碱性条件下与铜离子反应后，能形成紫 色或紫红色的络合物，这一反应即为双缩脲反应，生成的络合物在5 4 0 n m 处有紫外吸 收峰，颜色的深浅与蛋白质的浓度成j 下比，而与蛋白的组成无关，因此受蛋白的特异性 影响较小，且操作简便快速。但该方法灵敏度较低，所需要的样品量大，因此，常用于 需要快速但精密度要求不太高的蛋白质含量的测定。 劳罩法【3 9 】由劳罩等人于1 9 6 1 年建立，至今仍是定量测定蛋白质的最常用方法。该 方法是在双缩脲方法的基础上发展的。在双缩脲试剂的基础上，又增加了一种增强显色 的试剂一磷钼酸和磷钨酸的混合液，它们被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，生 成深蓝色的复合物，增加了显色量。从而提高了灵敏度。与紫外吸收法和双缩脲法相比， 劳里法线性范围宽，灵敏度也高了许多，但抗干扰能力较差，费时较长，要精确控制操 作时间。并且，劳里法还受蛋白质的特异性的影响。 4 喹啉甲酸法( b c a 法) 4 0 l 是2 0 世纪8 0 年代新发展起来的一种新的吸光光度法， 是对劳里法的改良。这种方法的反应简单，几乎没有干扰物质的影响。此法的原理是： 在碱性条件下，肽键与c u 2 + 络合生成络合物，二价铜离子被还原为一价。b c a 试剂可 以特异性的与c u + 结合，形成稳定的有颜色的复合物，在5 2 6 n m 处有吸收峰，且颜色 的深浅与蛋白的浓度成正比。但该方法的反应时间较长，且会使蛋白发生不可逆的变性。 ( 2 ) 染料探针 染料探针的测定原理是基于染料与蛋白的相互作用，引起最大吸收峰位置的位移和 溶液颜色的变化，从而实现对蛋白的定量测定。最早用于蛋白测定的染料是甲基橙【4 。 考马斯亮蓝法【4 2 1 是1 9 7 6 年b r a d f o r d 提出建立的，是以考马斯亮蓝g 2 5 0 ( g b b 2 5 0 ) 3 两南大学硕十学伊论文 第1 覃综述 测定微量蛋白的方法，故又称为b r a d f o r d 法。该法是根据蛋白质与染料结合的原理设 计的。考马斯亮蓝在游离状态下呈棕红色，与蛋白质结合后颜色由棕红色转变为青蓝色， 最大吸收峰位置由4 6 5 n m 变为5 9 5 n m ，通过测定5 9 5 n m 处的吸光度即可以知道其与蛋 白质结合的含量，蛋白质在1 1 0 0 0 9 9 的范围内，吸光度值都与蛋白质的浓度成正比， 故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝法快速简便，灵敏度高，是测定蛋白的最常用 的方法。 ( 3 ) 金属络合物探针 金属络合物探针可以和有机试剂结合，生成有色的二元络合物，该络合物与蛋白质 再进行结合，生成三元络合物，颜色更为加深，因而可以用作蛋白质测定的探针。 ( 4 ) 纳米粒子探针 纳米粒子其因所具有的独特的物理化学性质正在被广泛的运用于分析检测中，越来 越受到人们的关注。金属胶体，如金 4 3 , 4 4 1 、银f 4 5 , 4 6 已_ j 广泛的应用于蛋白质分析当中。 1 2 1 2 荧光光度法 荧光光度法是另一种测定蛋白质的常用方法，与之前的分光光度法相比要更为灵 敏。在蛋白质分子中存在色氨酸、酪氨酸、苯并氨酸等残基，这些残基在吸收了紫外光 以后，能够发射荧光，激发波长在2 8 0 n m ，发射波长为3 4 0 3 5 0 n m 。与紫外方法相比， 这种方法要更为灵敏，且核酸对其没有干扰。但蛋白质本身的荧光较弱，检测灵敏度低， 现在也常用蛋白质与染料的作用来实现对蛋白质的定量测定、反应机理研究或构象分 析。常用的荧光染料探针有两类，分别是有机荧光探针和稀土荧光探针。 ( 1 ) 有机荧光探针 蛋白质与有机染料结合后，有时会使染料的荧光升高，有时会使染料的荧光降低， 视具体情况而定，这就是定量测定的基础。最常用的有机荧光探针有1 苯胺基奈一8 磺 酸4 7 1 和2 对甲胺基奈一6 磺酸等4 引。此外，常用的探针还有曙红y 、吖啶红、q ，p ，丫，6 四( 对 羧苯基) 卟啉等【4 9 - 5 。 ( 2 ) 稀土荧光探针 稀土金属离子有未满的f 层电子，属于非惰性结构，所以具有光、磁活性，当其配 位环境改变时，其光、磁活性也会相应的发生改变，因此稀土离子也是一类很重要的荧 光探针。e u ( i i i ) 和t b ( i i i ) 是最常用的两种稀土荧光探针，已被用来研究蛋白的结 合部位【5 2 - 5 3 1 。 此外，常用的荧光光度法还有荧光偏振法、时间分辨荧光光谱法、激光诱导时间分 辨免疫分析法等等。 总之，与分光光度法相比，荧光光度法测定蛋白质含量最大的优点是灵敏度高，其 测定条件更接近生命体的生理环境，能较大程度的保持蛋白的活性，因而在蛋白质乃至 生命科学研究中都具有重要的意义；但它仅适用于有荧光的体系，因而使用范围受到限 4 西南大学硕十学伊论文第1 章综述 制。 1 2 2 共振光散射光谱法检测蛋白简介 与其他方法相比，r l s 法测定蛋白质能大大提高测定的灵敏度，减少操作过程，而 且可以使用的探针的种类也更多。目前，已成功用于蛋白质分析的探针有以下几种：染 料探针、金属络合物探针、表面活性剂探针、纳米粒子等。 ( 1 ) 染料探针 有机染料探针是研究最多的一类蛋白质共振光散射探针，灵敏度也较高。蛋白质染 料探针主要包括有：酸性偶氮类，酸性三苯甲烷类和卟啉类三种。 酸性偶氮类染料包括单偶氮、双偶氮和三偶氮等。偶氮磺i i i 【5 4 】能与蛋白质结合，表 现为共振光散射信号的增强，散射峰出现在3 6 7 n m 、4 4 6 n m 、6 0 2 n m 处。该法选择性较 高，大部分的金属离子、氨基酸及表面活性剂等对其的干扰都较小。4 一偶氮溴变色酸苯 荧光酮【5 5 】在p h0 5 1 8 时能与微量蛋白质进行结合，3 3 7 n m 处共振光散射峰增强，并与 蛋白质的浓度在0 2 4 0 m g l 的范围内成正比，可用于血液和尿液中蛋白质的测定。依 波西隆蓝( e p b ) 5 6 】是一种含磺酸基的单偶氮阴离子染料，在p h l 5 5 0 之间的b r 缓 冲体系中，e p b 与蛋白质结合后共振光散射信号显著增强，波峰位于4 0 0 和5 5 0 n m 处。 由此对蛋白质进行测定，并测定了合成样品和血清样品中的蛋白质。 酸性三苯甲烷类染料中，最常用的染料是铬天青s ( c a s ) 。在p h 值为3 5 的柠檬 酸钠n a o h 缓冲介质中，蛋白质能与c a s 通过静电作用结合【57 1 ，引起共振光散射信号 的增强，最大波长位于3 7 0 n m 处。可检测低至0 0 2 r t g m l 的蛋白，并可以用于测定尿 液中的微量蛋白质。依思明蓝【5 8 】是对氨基取代的三苯甲烷类染料，它能与血清白蛋白 通过疏水作用结合，表现出r l s 信号的增强，特征峰出现在3 6 7 4 n m 。由此建立了痕 量血清蛋白的共振光散射分析法。在p h 3 9 8 的条件下，溴酚蓝【5 9 1 与蛋白质结合，引起 共振光散射信号的增强，最大峰出现在3 3 4 n m 处，其强度与蛋白质浓度成正比。 卟啉由于静电引力和疏水作用，常形成分子聚集体。卧p 、丫、6 4 ( 5 磺基噻嗯基) 卟啉【6 0 1 在蛋白质存在下能发生j 型聚集，4 3 6 1 n m 处的共振光散射信号增强，从而实现 了对蛋白质的定量测定。 ( 2 ) 金属络合物探针 金属络合物探针早期的应用是用于分光光度法测定蛋白质。1 9 8 3 年，f u j i t a 6 1 1 首次 利用金属络合物邻苯三酚红m o ( v i ) ，使其与蛋白质作用，生成蓝色复合物，该复合 物的最大吸收峰位于6 0 0 n m 。最近几年，越来越多的研究者发现金属络合物与蛋白质作 用生成的更大分子量的聚合体具有强烈的共振光散射信号，且在普通荧光分光光度计上 就能准确测定，因而现在金属络合物作为测定蛋白质的光散射探针也被广泛使用中。 ( 3 ) 表面活性剂探针 两南大学硕十学何论文 第1 章综述 蛋白质在小于其等电点的p h 介质条件下带正电，带大于其等电点的p h 条件下带 负电，因而能够与阴离子或阳离子型的表面活性剂通过静电作用进行结合，形成离子缔 合物。表面活性剂的分子量大，链很长，蛋白与其结合后形成很大的聚集体，因而能够 显著的增强r l s 信号【6 2 - 6 4 1 。 ( 4 ) 溶胶和纳米粒子 随着科学技术的发展，人类的认识领域由宏观世界逐渐发展到了微观世界，而纳米 科技也迅猛发展了起来。纳米材料的运用也越来越广泛。纳米粒子的尺寸在1 1 0 0 n m 之间，是大于原子、小于通常的微粒，介于微观和宏观之间，是一种典型的介观系统。 与其他的材料相比，纳米粒子所具有的特殊结构使它具有表面效应、量子尺寸效应、协 同效应和宏观量子隧道效应等特性6 5 - 6 6 。与传统的染料探针相比，纳米粒子具有比表面 积大，易于吸收介质中的带电微粒而带电荷，激发光谱宽且连续分布，光化学稳定性好， 不易光解等优点，从而可以作为测定蛋白的光散射探针。w a n g 6 7 1 使用h g s 纳米粒子， 在p h 为5 0 3 的介质环境中使其与丫球蛋白相互作用，共振光散射信号在2 0 0 7 0 0 n m 的波长范围内显著升高，最高峰出现在3 6 2 n m 。散射信号的增强与蛋白的浓度在 1 0 1 4 0 n g m l 的范围内成线性关系，检测限可达2 n g m l 。由此建立了一种新的测定球 蛋白的方法，且不需要对试样中的血清白蛋白进行分离。c h e n 6 8 1 使用c d s p a a 复合纳 米粒子测定了纳克级的蛋白，最大散射峰出现在3 8 0 n m 处。除此之外，纳米金和纳米 银也常用于蛋白质的测定当中【6 9 啪】。 1 3 共振光散射光谱法检测核酸 核酸是一类十分重要的生物大分子，是核苷酸通过磷酸二酯键聚合而成的多聚体。 它的主要功能是贮存、传递和表达生物体的遗传性状。核酸是遗传信息的载体，是基因 表达的基础。根据核苷酸单元中糖组分的不同，核酸分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核 糖核酸( i 斟a ) 两大类。 1 3 1 核酸的常用检测方法 目前，已有多种测定核酸的方法，如分光光度法、荧光光度法、共振光散射法、化 学发光法、红外光谱法、拉曼光谱法、色谱法、探针技术法、显微光度法等。其中主要 的测定方法是分光光度法和荧光光度法。 1 3 1 1 分光光度法 核酸是由磷酸根、戊糖和含氮碱基三部分组成，d n a 含有四种碱基：腺嘌呤( a ) ， 鸟嘌呤( g ) ，胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) ；r n a 也含有四种碱基：腺嘌呤( a ) ，鸟 嘌呤( g ) ，胞嘧啶( c ) 和尿嘧啶( u ) 。因而可以基于其组成成分对它进行测定【7 1 , 7 2 。 核酸中嘌呤碱和嘧啶碱分子都具有共轭双键，所以核酸在紫外光区内有强烈的吸 6 两南大学硕十学伊论文第1 辛综述 m l 皇! ! ! 曼曼曼! ! 曼曼曼曼曼蔓曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼! ! ! 曼笪曼曼曼曼曼曼曼曼! ! 曼皇曼曼曼曼皇曼皇量曼! 曼曼曼曼曼曼曼量曼量 收，最大吸收峰位于2 6 0 n m 附近，所以可以根据此性质对核酸进行测定1 7 又7 4 j 。该方法 简便快速，但体系中存在蛋白时，蛋白2 8 0 n m 处的吸收峰会对其产生很大的干扰，准 确性较差。 核酸中含有磷酸根分子，所以核酸的含磷量与核酸含量成正比，d n a 的含磷量为 9 2 ；r n a 的含磷量为9 5 ，可根据核酸样品中的含磷量计算出样品中核酸的含量。 此方法的准确度较好，灵敏度也较高，但操作步骤复杂，需要将核苷酸先用强酸消化使 有机磷氢化为磷酸根，再通过测定磷酸根的方法测定d n a 中磷的含量，因此，试样中 存在的无机磷也会给实验带来误差。 在酸性水溶液中，核酸的嘌呤核苷键易于水解，产生去嘌呤酸，继而形成糖醛衍生 物，生成的衍生物可与一些试剂发生显色反应，据此可以定量测定核酸。常用的试剂有 二氨基苯甲酸【7 5 】、二苯胺【7 6 l 、硫代巴比妥酸【7 7 】等。 核酸分子具有双螺旋结构，有机小分子可以嵌插入其中与核酸发生作用，也可以因 静电作用发生分子间作用，从而引起试剂的光学性质的变化。多核苷酸中两个单核苷酸 残基之间的电离具有较低的p k a 值( p k a = 1 5 ) ，当溶液中p h 值大于4 时，核酸会全部离 解成多阴离子状态【7 8 】，可以与许多阳离子有机染料结合，发生光谱的变化，实现定量 测定。此类分析方法具有简便、快速、灵敏和准确等特点，但蛋白质对该类方法的测定 体系干扰较严重。目i j ，作为标记物测定核酸的阳离子型有机分子一般都是具有刚性平 面结构的有机分子，如甲基绿【7 9 】、甲苯胺蓝【8 0 1 、乙基紫剐和甲基紫【8 2 】等。 1 3 1 2 核酸的荧光分析法的研究 相比分光光度法，荧光分析法通常较分光光度法有更高的灵敏度，是研究核酸的重 要分析方法之一。但与蛋白质相比，核酸的内源荧光更弱，量子产率很低，因而不能像 蛋白质那样利用内源荧光进行直接测定。因此科研工作者致力于寻找荧光试剂与其反应 并用于测定。目前，用于研究核酸的荧光试剂主要有以下三类。 ( 1 ) 有机小分子 这类较为经典的有机荧光探针中，最常用的就是溴化乙锭( e b ，结构式见图1 1 ) 及 其二聚体或类似二聚体的衍生物。溴化乙锭是一种杀锥虫的染料，化学名为3 ，8 二氨 基5 乙基6 苯基菲锭筠。人们于1 9 9 6 年首次将溴化乙锭作为荧光探针用于核酸的测定 当中【8 3 】。在溴化乙锭的分子中含有一较为刚性的平面结构，能够嵌入核酸的双螺旋结 构的沟区进行结合，使e b 分子中的苯环的转动受到限制，其荧光能够得到显著增强， 约为5 0 1 0 0 倍，测定时激发波长在5 4 6 n m ，发射波长位于5 9 0 n m 。该方法操作简便、 灵敏度高、稳定性好。 但是，e b 本身的性质并不稳定，而且是一种强诱变剂和强致癌物，在一定程度上 限制了它的应用。因而寻找其它的使用较方便的荧光探针的研究常有报道，如亚甲蓝 ( m b ) 、耐尔蓝( n b ) 、藏红t ( s t ) 、中性红【抖髂】等。 7 两南大学硕十学伊论文第1 章综述 h 2 n n h 2 c h 3 b r 图1 1 溴化乙锭( e b ) 分子式 ( 2 ) 药物分子 药物分子荧光探针实际上可以算做是有机荧光探针。抗癌药物分子必须与肿瘤细胞 中的d n a 发生反应，阻断d n a 的复制和转录，从而防止癌细胞扩散。许多抗癌药物 与d n a 反应后，发生了荧光光谱的变化，可根据光谱的变化情况判断抗癌药物的药效， 研究其机理，提高疗效。此类探针有：亚德罩亚霉素、阿霉素、光神霉素、竹红菌甲素、 小檗碱、利凡诺等【8 9 。9 3 1 。 ( 3 ) 稀土离子 稀土离子具有独特的荧光性能，当其与核酸作用后，它们的共振能带与核酸配体在 紫外光激发下的三重态相重叠，发生从核酸到稀土离子的无辐射能量转移，使得稀土离 子的荧光强度得到加强，成为研究核酸的一类较重要的荧光探针。作为核酸荧光探针， 研究较多的稀土离子是t b ( i i i ) 。1 9 7 3 年，f o r m o s a 9 4 1 发现，t b ( i i i ) 与鸟嘌呤核苷磷酸 ( g m p ) 作用后，其荧光强度能增加许多倍。 1 3 2 共振光散射应用于核酸定量检测 1 9 9 3 年，p a s t e m a c k l 2 】建立了共振光散射技术，并将其用于研究卟啉在d n a 上的聚 集，共振光散射技术开始广泛运用于核酸的测定当中。常用的探针有有机染料探针、阳 离子表面活性剂探针、金属离子配合物探针、纳米粒子探针等。 ( 1 ) 有机染料探针 有机染料探针是最常用的测定核酸的共振光散射探针，卟啉类试剂就是首先被用作 核酸光散射分析的染料。仅、1 3 、丫、6 四( 对三甲基氨基卟啉，简称t a p p ) ，它是一个 8 两南大学硕+ 学位论文 第1 章综述 带j 下电荷的大环共轭分子，与卟啉取代基上的正电荷和大环共轭体系与核酸骨架上的磷 酸根和碱基等分别发生静电作用和疏水作用。在p h 值为7 4 8 ，离子强度为0 0 0 4 m 的 环境下，t a p p 与d n a 反应，产生r l s 信号的增强，最大散射峰位置约在4 3 2 n m 左右 【”】。可以检测纳克级的核酸，且卟啉在d n a 上聚集模式随d n a 和卟啉的不同浓度比 也有两种不同的聚集模式。 除卟啉外，用于测定核酸的有机染料探针还有很多，d n a 在水溶液中解离带负电， 所以通常能与一些阳离子染料结合。如三苯甲烷类阳离子染料，醌亚胺类阳离子染料等。 常用的三苯甲烷类阳离子染料主要有乙基紫、结晶紫、甲基紫、罗丹明b 、灿烂甲 酚蓝等。在近中性介质中【9 5 】，乙基紫与d n a 的结合物在5 1 0 n m 处有一共振发光峰， 其发光强度与核酸呈线性关系，用于痕量核酸的定量测定，检出限可达1 5 4 n g m l 。在 p h9 2 1 0 5 的范围内，加入d n a 可以导致结晶紫共振光散射信号的增强【9 引，最大峰出 现在5 1 2 n m ，且其强度与d n a 的浓度呈线性关系。甲基紫【97 j 在p h = l 的条件下与d n a 作用，引起共振光散射信号的增强，最大峰位于3 4 4 n m ，反应在5 分钟之内就能完成， 在2 小时之内信号稳定，且蛋白和其他金属离子对其的影响都很小。 醌亚胺类阳离子染料如藏红t 、中性红、亚甲基蓝等都可以在核酸分子表面进行长 距离组装，能产生特征的共振光散射光谱。在p h 7 6 7 8 和低离子强度条件下，中性红 【9 8 】与小牛脱氧核糖核酸( c t d n a ) 作用产生5 3 5 n m 为特征的共振光散射增强光谱，共振光 散射信号的增强的机理为d n a 导致中性红的聚集。藏红t 在p h 为7 0 5 ，离子强度为 0 0 0 4 5 m 的条件【叫与核酸作用，出现三个特征散射峰，分别位于3 2 8 、4 7 2 、5 7 2 n m 处。 机理的研究也说明了这三个峰的生成是由于藏红t 在d n a 表面的长距离自组装所致， 将其用于核酸的测定，可测定达纳克级的核酸。 有时候，单纯的有机染料探针直接用于测定的灵敏度不够高，所以，常加入一些试 剂，以起到增敏的作用。表面活性剂的分子量大，链很长，所以常常被用来做增敏剂。 在阳离子表面活性剂c t m a b 的存在下，在p h 值为2 2 1 的介质环境中l l 叫孔雀石绿的 共振光散射信号产生增强的作用，c t m a b 对体系不仅没有干扰还有增稳的作用，由此 建立了一种测定d n a 的新方法。 ( 2 ) 阳离子表面活性剂探针 核酸与阳离子表面活性剂之间的静电引力和疏水力促进了阳离子表面活性剂核酸 离子缔合物的形成，所以可以直接利用阳离子表面活性剂作为散射探针。在近中性介质 中，l i u 1 0 1 】对溴化十六烷基吡啶( c p b ) 、溴化十四烷基吡啶( t p b ) 、氯化十六烷基二甲基 苄基胺( c d b a c ) 、氯化十四烷基二甲基苄基胺( z e p h ) 和溴化十六烷基三甲胺( c t a b ) 等5 种阳离子表面活性剂与核酸的相互作用进行了系统的研究，这几种表面活性剂本身的散 射信号十分微弱，但当其与d n a 结合后散射信号急剧增强，研究表明散射信号的强度 不仅与阳离子表面活性剂的结构和分子量有关，而且强度的变化还与核酸构象转变有密 9 两南人学硕十学何论文第1 幸综述 切联系，有望成为研究核酸构象的有用手段。 ( 3 ) 金属离子及其络合物探针 在p h 为2 2 1 的酸性介质中，a 1 3 + 与d n a 发生静电作用【1 0 2 1 ，产生以2 9 1 n m 为特征 峰的共振光散射增强光谱，铝离子主要与d n a 表面的磷酸根相结合，该方法的检出限 在纳克级。金属螯合阳离子c o ( i i ) 一4 ( 5 氯2 吡啶) 偶氮】一l ，3 ，二氨基苯( c o ( i i ) 一5 c 1 p a d a b ) 在碱性条件下( p i l l l 5 1 2 o ) 能在核酸分子上堆积【1 7 】，在5 4 7 n m 处产 生强烈的共振光散射峰，可用于纳克级核酸的检测，方法的灵敏度高。 ( 4 ) 纳米粒子探针 纳米粒子的优越性能使其也广泛的运用于核酸的检测当中。如l i t l 0 3 1