（营养与食品卫生学专业论文）产γ谷氨基甲酰胺合成酶的菌株的选育.pdf

摘要 y - 谷氨基甲酰胺合成酶( y g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ，y g m a s ) ( e c 6 3 4 1 2 ) 是一种连接酶，可在a t p 和m n 2 + 存在的条件下催化谷氨酸和甲胺合成 y - 谷氨基甲酰胺。y - 谷氨基甲酰胺与茶氨酸( y 谷酰基乙酰胺) 的结构很相似， 因此在一定条件下y 谷氨基甲酰胺合成酶可同样催化谷氨酸和乙胺合成茶氨 酸，这为茶氨酸的合成提供了又一思路。 目前国外报道该酶主要存在于细菌体内，包括普通生丝微菌，假单胞菌以及 一些以甲胺为唯一碳氮源的海生甲基营养生物。近年来国外关于y 谷氨基甲酰 胺合成酶合成茶氨酸的研究报道较多，但是尚未见到关于假单胞菌液态发酵生产 y - 谷氨基甲酰胺合成酶的相关报道，鉴于此，本论文对假单胞菌液态发酵生产 y 一谷氨基甲酰胺合成酶进行了研究。首先利用紫外线诱变假单胞菌，从中筛选 出产y - 谷氨基甲酰胺合成酶酶活较高的优势突变菌株；然后通过 p l a c k e t t - b u n n a n 和r s m 响应面设计优化发酵条件，提高酶产量：最后对y 谷氨 基甲酰胺合成酶进行粗提并研究了其部分酶学性质，以期为y 谷氨基甲酰胺合 成酶的进一步研究提供理论基础和科学依据。 主要研究结果有： 首先，以假单胞菌为出发菌株，对其进行紫外诱变处理，经过初筛复筛获得 了一株产y 谷氨基甲酰胺合成酶酶活较高并且遗传稳定性较好的优势突变菌株 u v 1 9 。 其次，以紫外诱变获取的优势突变菌株为实验菌株，发酵所产y 谷氨基甲 酰胺合成酶酶活为指标，筛选出了发酵产酶的最适碳源、氮源、溶氧转速、培养 温度、培养时间、诱导底物，并通过p l a c k e t t b u r m a n ( p b ) 设计筛选发酵培养的主 要影响因素，确定了突变菌株液态发酵产酶培养基主要影响因素为葡萄糖 q 卸0 0 0 3 ) 、蛋白胨( p _ o 0 2 4 4 ) 、起始p h 值c o = o 0 0 3 3 ) 和装液量胪o 0 1 2 2 ) 。 再次，在p b 设计实验的基础上，以y 谷氨基甲酰胺合成酶酶活为指标，运 用响应面法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , r s m ) 的旋转中心组合试验设计对筛 选出的主要影响因素迸一步优化，确定了优势突变菌株发酵产y 谷氨基甲酰胺 合成酶最适宜的发酵产酶条件：葡萄糖1 5 0 r d l 、蛋白胨1 2 0 9 l 、氯化钠5 0g l 、 硫酸镁o 2r d l 、磷酸二氢钾0 5g l 、甲胺盐酸盐1 0 9 l 、起始p h 值6 5 、装液 量7 2 ml 2 5 0 ml 、发酵时间4 2 h 、温度3 0 、转速1 6 0 r m i n 。 最后，对优势突变菌株所产y 谷氨基甲酰胺合成酶进行粗提，对粗酶的部 分特性( 最适温度及温度稳定性，最适p h 及p h 稳定性，金属离子等的影响) 进行研究，确定该酶与底物的最佳作用时间为4 0 m i n ，最适反应温度为4 0 ， 1 0 3 0 间稳定性较好，最适反应p h 为7 5 ，p h 5 5 - 6 5 范围内稳定性较好，金 属离子m n 2 + 、m 9 2 + 对y - 谷氨基甲酰胺合成酶有一定的激活作用。 关键词：假单胞菌，y 一谷氨基甲酰胺合成酶，紫外诱变，p l a c k e t t b u n n a i l 设计， 响应面分析，酶学性质 a b s t r a c t y g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ( 丫- g m a s ) ( e c6 3 4 12 ) i sal i g a s e ，w h i c h c a nc a t a l y t i cg l u t a m a t ea n dm e t h y l a r n i n es y n t h e s i s y g l u t a m y l m e t h y l a m i d ei nt h e p r e s e n c e o f a t pa n d m n 2 + 7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d e a n dt h e a n i n e 0 - e t h y l a m i n o - l - g l u t a m i ca c i d ) o w n a v e r y s i m i l a r s t r u c t u r e ， s o 7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e c a l ls t i l l c a t a l y t i cg l u t a m a t ea n de t h y l a m i n e s y n t h e s i st h e a n i n eu n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n s ，t h i sp r o v i d e san e wi d e af o rt h e a n i n e p r o d u c t i o n y - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ，i nf o r e i g nc o u n t r i e s ，w a sr e p o r t e dm a i n l y i nt h eb a c t e r i a lb o d y s ，i n c l u d i n gh y p h o m i c r o b i u mv u l g a r e ，p s e u d o m o n a s ，a n ds o m e m e t h y ln u t r i t i o nm a r i n e sw i t hm e t h y l a m i n ea st h es o l ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e s i n r e c e n ty e a r s ，l o t so fr e s e a r c ho n7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s ef o r m i n gt h e a n i n e a r er e p o r t e di na b r o a d b u tw eh a v en o ty e ts e e nr e l e v a n t r e p o r t sa b o u tl i q u i d f e r m e n t a t i o no fp s e u d o m o n a s s p p r o d u c i n g7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ，i n v i e wo ft h i s ，t h ep a p e rp r e s e n t e dap r e l i m i n a r ys t u d yo nt h e7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d e s y n t h e t a s ep r o d u c t i o no fp s e u d o m o n a s s pb ys u b m e r g e df e r m e n t a t i o n f i r s t l y , w eu s e u v - i n d u c e d p s e u d o m o n a s s p t os e l e c tm u t a n t s t r a i nw i 廿l h i g h e r 丫- g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e t h e np l a c k e t t - b u n n a na n dr s mr e s p o n s es u r f a c e w a sd e s i g n e dt oo p t i m i z ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，a n di m p r o v ee n z y m ep r o d u c t i o n ； f i n a l l y , y - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s ew a sc r u d e da n dp a r to fi t se n z y m a t i c p r o p e r t i e sw e r es t u d i e di no r d e rt op r o v i d ef u r t h e rr e s e a r c hf o rt h e o r e t i c a lf o u n d a t i o n a n ds c i e n t i f i cb a s i s t h em a i n l yr e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： f i r s t , t h ei n i t i a ls t r a i np s e u d o m o n a s s pw a st r e a t r n e n t e db yu vm u t a g e n e s i s ，w e r e c e i v e dag o o dm u t a t i o n ss t r a i nu v - 19w i t hh i 曲7 - g l u t a r n y i m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e a c t i v i t ya n dh i 曲g e n e t i cs t a b i l i t ya f t e rs c r e e n i n ga n dr e s c r e e n i n g s e c o n d l y , t h e o b t a i n e d g o o d m u t a t i o n ss t r a i nf o rt h e e x p e r i m e n t s ， 7 - g l u t a r n y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s ea c t i v i t yb yf e r m e n t a t i o na si n d e x ，s c r e e n i n go u t t h eo p t i m u me n z y m ep r o d u c t i o nc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e s ，o x y g e ns p e e d ，c u l t u r e t e m p e r a t u r e ，i n c u b a t i o nt i m e ，s u b s t r a t e i n d u c e d ， a n dt h em a i nf a c t o r si n f l u e n c i n g f e r m e n t a t i o nw e r es c r e e n i n gt h r o u g hp l a c k e t t - b u r r n a n ( p b ) d e s i g n ，t h e ya r eg l u c o s e ( p = 0 0 0 0 3 ) ，p e p t o n e0 = 0 0 2 4 4 ) ，i n i t i a lp hv a l u e ( p = 0 0 0 33 ) a n dl i q u i dv o l u m e 护o 0 1 2 2 ) i _ - r l a g m n ，b a s e do nt h ep be x p e r i m e n t s ，7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s ea c t i v i t y i sf o re v a l u a t i o ni n d e x ，t h em a i nf a c t o r sw e r ef u r t h e ro p t i m i z e dt h r o u g hr e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d ( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , r s m ) c e n t r a lc o m p o s i t e e x p e r i m e n t a ld e s i g n ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o re n z y m ep r o d u c t i o nw a s d e t e r m i n e d ：g l u c o s e1 5 0 9 l ，p e p t o n e1 2 0 e , l ，n a c l5 0 9 l ，m g s 0 40 2 9 l ，k h z p 0 4 0 5 9 l ，m e t h y l a m i n eh y d r o c h l o r i d e1 o g l ，i n i t i a lp h 6 5 ，l i q u i dv o l u m e7 2 m l 2 5 0 m l ， c u l t u r et i m e4 2 l l ，c u l t u r et e m p e r a t u r e3 0 ，s p e e d1 6 0 r m i n f i n a l l y , v g l u t a r n y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s eo fd o m i n a n tm u t a n tw a sc r u d e ，p a r t o ft h ec r u d ee n z y m ep r o p e r t i e s ( o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dt e m p e r a t u r es t a b i l i t y , o p t i m u mp ha n dp ns t a b i l i t y , t h ei m p a c to fm e t a li o n s ，e t c ) w e r es t u d i e d ，t h er e s u l t s i n d i c tt h a tt h eo p t i m a le n z y m ea n ds u b s t r a t er e a c t i o nt i m ei s4 0 m i n , t h eo p t i m a l r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s4 0 c ，t e m p e r a t u r es t a b i l i t yr a n g ei s1 0 - 3 0 ( 2 ，o p t i m u mp hi s 7 5 ，p h s t a b i l i t y r a n g e i s p h 5 5 6 5 ，m e t a l i o n s m n 2 + ，m g j + c o u l d a c t i v e ? - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a ss p ：7 - g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ：m u t a g e n e s i sb y u l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o n ；p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n ：r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ；e n z y m e p r o p e r t i e s 目录 1 文献综述1 1 1 丫谷氨基甲酰胺合成酶研究进展1 1 1 1 丫谷氨基甲酰胺合成酶简述1 1 1 2 丫- 谷氨基甲酰胺合成酶主要来源1 1 1 3 丫- 谷氨基甲酰胺简述2 1 2 假单胞茵简述。2 1 2 1 假单胞菌属简介2 1 2 2 假单胞菌属分类2 1 2 3 假单胞菌产酶研究3 1 2 4 假单胞菌在分子生物学领域的研究6 1 2 5 假单胞菌在石油开采及降解领域的研究7 1 3 茶氨酸概述8 1 3 1 茶氨酸的药理作用8 1 3 2 茶氨酸的应用8 1 3 3 茶氨酸的合成与制备9 2 引言1 0 2 1 课题的立题背景及意义。1 0 2 2 本论文的主要研究内容l l 2 3 课题来源。“ 3 材料与方法1 2 3 1 材料。1 2 3 1 1 实验菌株。1 2 3 1 2 细菌培养基1 2 3 1 3 发酵培养条件1 2 3 2 主要试剂1 2 3 3 主要仪器1 3 3 4 磷钼酸法测无机磷含量1 3 3 5 蛋白质含量测定j 1 4 3 5 1 标准曲线的制作1 4 3 5 2 样品的测定1 5 3 6y 谷氨基甲酰胺合成酶的酶活检测方法1 5 3 6 1 茶氨酸合成反应1 5 3 6 2 丫谷氨基甲酰胺合成反应1 5 3 7 紫外诱变选育高产p 谷氨基甲酰胺合成酶菌株1 5 3 7 1 出发菌株生长曲线的制作1 5 3 7 2 单细胞菌悬液的制备1 5 3 7 3 紫外诱变1 6 3 7 4 致死率的测定1 6 3 7 5 突变菌株初筛1 6 3 7 6 摇瓶培养复筛1 6 3 7 7 遗传稳定性1 6 3 8 假单胞菌液态发酵丫一谷氨基甲酰胺合成酶单因素试验1 6 3 8 1 最适碳源的筛选1 6 3 8 2 最适氮源的筛选。1 6 3 8 3 最适溶氧转速的筛选1 7 3 8 4 最适培养温度的筛选。1 7 3 8 5 最佳发酵时间的确定。1 7 3 8 6 最适诱导底物的筛选l7 3 9 假单胞菌液态发酵产丫- 谷氨基甲酰胺合成酶培养条件优化1 7 3 9 1p l a c k e t t b e r m a n 设计筛选影响酶活的显著性因素1 7 3 9 2 二次通用旋转设计优化发酵条件18 3 1 0 丫谷氨基甲酰胺合成酶的粗提2 0 3 1 0 1 细胞破碎液的制备2 0 3 10 2 硫酸铵沉淀及透析2 0 3 1 ly 谷氨基甲酰胺合成酶的酶学性质研究2 0 3 1 1 1 酶与底物作用时间的测定2 0 3 1 1 2 酶的最适反应温度的测定2 0 3 1 1 3 酶的热稳定性的测定2 0 3 1 1 4 酶的最适反应p h 的测定j 。2 1 3 1 1 5 酶的p h 稳定性的测定2 1 3 1 1 6 金属离子对酶活性的影响。2 l 4 结果与分析。2 2 4 1y 谷氨基甲酰胺合成酶高产菌株的诱变选育2 2 4 1 1 出发菌株的生长曲线2 2 4 1 2 紫外诱变致死曲线2 2 4 1 3 筛选结果2 3 4 1 4 优势突变菌株遗传稳定性试验2 3 4 2 优势突变菌株u v - 19 产酶发酵单因素优化2 4 4 2 1 不同碳源对产酶的影响2 4 4 2 2 不同氮源对产酶的影响2 4 4 2 3 溶氧转速对菌株产酶的影响2 5 4 2 4 培养温度对产酶的影响2 5 4 2 5 发酵时间对产酶的影响2 6 4 2 6 不同诱导底物对产酶的影响2 6 4 3p l a c k e t t - b e r m a n 设计筛选影响1 , - g m a s 酶活的显著性因素2 7 4 4 最陡爬坡实验2 8 4 5 响应面分析实验结果2 9 4 5 1 响应面分析方案及结果。2 9 4 5 2 验证实验_ 3 4 4 6 丫谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液的酶学性质3 4 4 6 1 酶与底物作用时间的测定3 4 4 6 2 酶最适反应温度的测定。3 5 4 6 3 酶的热稳定性的测定3 5 4 6 4 酶的最适反应p h 的测定3 6 4 6 5 酶的p h 稳定性的测定3 6 4 6 6 金属离子对酶活性的影响3 7 5 主要结论3 8 参考文献3 9 致谢4 5 作者简介4 6 攻读硕士学位期间发表的论文。4 6 i i i 1 文献综述 1 1p 谷氨基甲酰胺合成酶研究进展 1 1 1 丫。谷氨基甲酰胺合成酶简述 丫谷氨基甲酰胺合成酶( 丫g l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ，y - g m a s ) ( e c 6 3 4 1 2 ) 在酶学中是一种催化化学反应的酶，其催化反应为：a t p + l 谷氨酸+ 甲胺 - 州山p + 磷酸+ n 5 一甲基l 谷氨酰胺。酶的3 个底物是a t p , l 谷氨酸和甲 胺，反应产物为a d p ，磷酸及n 5 甲基l 谷氨酰胺。这种酶属于连接酶，而且 是那种形成通用碳氮键的连接酶，系统命名是l 谷氨酸：甲胺连接酶 ( l - g l u t a m a t e ：m e t h y l a m i n el i g a s e ) ( a d p 形成) 。 酶的分子量为4 4 0 ，0 0 0 ，所以认为它是相同亚基的八聚体。在p h 7 5 ，4 0 下有最大活性。可以用乙胺、丙胺来代替甲胺作为反应底物，但是不能用d 谷 氨酸或者l 谷酰胺代替l 谷氨酸。乙胺代替甲胺作为反应底物能合成l 茶氨酸 ( 谷氨酸丫乙基酰胺，n ( 丫谷氨酰基) 乙胺) o 叫“肾赢一b 。八n c h 3 i 璺 。h 州一叫呜啪”帅一r 款p f 图i - i7 - 谷氨基甲酰胺合成酶酶促生成丫谷氮基甲酰胺的反应式 f i g 1 - 1 t h en 蒯o no f r - g l u t a m y l m e t h y l a m i d ef o r m i n gf r o m t - g l u t a m y l m c t h y l a m i d es y n t h e t a s c 1 1 2y 谷氨基甲酰胺合成酶主要来源 目前国外报道该酶的主要来源是微生物，包括普通生丝微茵i t 3 ( 如 h y p h o m i c r o b i u mv u l g a r ez v , h y p h o m i c r o b i u m ，假单胞菌( 如p s e u d o m o n a s a m i n o v o r a n , p s e u d o m o n a s 朋慰2 1 ) 以及一些以甲胺为唯一碳氮源的海生甲基营养生 物( 如m e t h y l o p h a g as p a a 3 0 j ，m e t h y l o v o r u sm a y sn o 9 t 3 j ) 。 l o g i n o v ae ta l t l 】报道了普通生丝微菌z v ( h y p h o m i c r o b i u mv u l g a r ez 功是如何 通过y - g m a 合成酶将甲胺甲基化连接到? - g m a 。k u n g 和w - a g n e r 【4 1 ( 1 9 6 9 ) 报道 在假单胞菌株m s 中，哥g m a 是甲胺新陈代谢的中间体，在? - g m a s l 谷氨酸： 甲胺连接酶( a d p ) ，e c6 3 4 1 2 作用，a t p 和m n 2 + 存在的条件下由谷氨酸和 甲胺合成。t o s h i o t 5 】就关于产甲胺的海生甲基营养生物m e t h y l o p h a g as p a a 3 0 中 酶催化g m a 合成和分解进行了报道。他认为? - g m a s 是一种诱导酶，只有在微 生物以甲胺作为唯一碳源和能源时才能被探测出来。同时继续报道了硫酸铵保护 酶失活条件下，m e t h y l o p h a g as p a a - 3 0 中7 - g m a s 的纯化和性质。因为酵母能 够利用糖发酵并耦合a t p 重建系统促使谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的发展， s a c h j k 0 1 6 依靠透性化细胞的茶氨酸合成反应从大约2 0 0 个甲胺和乙胺富集的细 菌中筛选出几个菌株。在m e t h y l o v o r u sm a y sn o 9 中发现了一种具有较高产茶氨 酸活性的新酶，并表明该酶就是g m a s 。s a c h i k o 7 进一步对于m m a y sn o 9 茶 氨酸合成酶基因的分子克隆和表达做以研究。对该酶基因与不同类型g s s 基因 进行了对比分析，从其在合成高浓度茶氨酸中应用的角度阐述了茶氨酸合成酶重 组体具有合成茶氨酸的特性，并在不同于其他几个g s s 催化性能的基础上确定 该茶氨酸形成酶是g m a s 。 1 1 3l r 谷氨基甲酰胺简述 k u n g 和脚e 一首次在假单胞菌p s e u d o m o n a sm s 中发现了p 谷氨基甲酰胺 的存在，证实它是一种不寻常的氨基酸，而且是甲胺代谢的早期产物，同时对它 的合成机理进行了研究。研究发现丫谷氨基甲酰胺是由谷氨酸和甲胺在a t p 和 m n 2 + 存在的条件下通过酶促反应合成的。 h i d e h i k oy o k o g o s h i s l 研究调查了丫谷氨基甲酰胺( 丫g m a ) ，绿茶提取物的 成分之一，对自然高血压老鼠( s h r ) 的血压影响。同时也研究了与7 - g m a 结 构相似的谷氨酸和p 谷氨基乙酰胺( 茶氨酸) 对自然高血压老鼠( s h r ) 的血压 影响。当在s h r 体内注射谷氨酸( 2 0 0 0 m g k g ) 时，血压并未有变化。而相同剂 量的茶氨酸降压效果显著。丫g m a 的注射也明显降低了s h r 的血压，它的降压 效果比注射茶氨酸更有效。 1 2 假单胞菌简述 1 2 1 假单胞菌属简介 伯杰手册记载，假单胞菌属拉丁学名( p s c u d o m o n a sm i g u l a18 9 4 ) 直 或微弯的杆菌，不呈螺旋状，0 5 - 1 0 1 - l m x l 5 - - 5 0 t t m 。许多种能积累聚b 羟 基丁酸盐为储藏物质 9 1 。没有菌柄也没有鞘。不产芽孢。革兰氏阴性，以单 极毛或数根极毛运动，罕见不运动者。有的种还具短波长的侧毛。需氧， 进行严格的呼吸型代谢，以氧为最终电子受体。在某些情况下，以硝酸盐 为替代的电子受体进行厌氧呼吸。不产生黄单胞色素。几乎所有的种不能 在酸性条件下生长。大多数种不需要有机生长因子。化能营养异养菌，有 的种是兼性化能自养，利用h 2 或c o 为能源。氧化酶阳性或阴性，接触酶 阳性。广泛分布于自然界。有的种对人、动物或植物有致病性。d n a 的g + c 为5 8 - 7 0 m 0 1 。 1 2 2 假单胞菌属分类 假单胞菌属种类繁多，它们与动植物、环境、生态和医学密切有关。此属由 于原来的描述极其广泛，使它包括了多种多样的需氧性革兰氏阴性极毛杆菌。帕 2 氏( p a l l c r o n i ) 用r r n a d n a 杂交证明此属的种至少可以分成5 个r r n a 同源群 【l o 】，这些r n a 同源群中有的可再分为几个d n a 同源组。帕氏r n ai 群分为荧 光、施氏、产碱3 个d n a 同源组。帕氏r n a i i 群包括葱头假单胞菌、类鼻疽假 单胞菌、鼻疽假单胞菌、唐菖蒲假单胞菌、青枯假单胞菌、皮氏假单胞菌和麝香 石竹假单胞菌。帕氏r n a i i i 群也有3 个d n a 同源组：食酸d n a 组包括食酸假 单胞菌和睾酮假单胞菌：敏捷d n a 组包括敏捷假单胞菌和德氏假单胞菌；黄 类黄d n a 组包括黄假单胞菌、类黄假单胞菌和帕氏假单胞菌。帕氏r n a i v 群包 括缺陷假单胞菌和泡囊假单胞菌。帕氏r n a v 群包括嗜麦芽假单胞菌、寡食假 单胞菌。其他假单胞菌属种类还有混合假单胞茵、少动假单胞菌、腐败假单胞菌、 嗜温假单胞菌、假单胞菌v e 一1 和v e - 2 ( 又称华丽单胞菌属和黄素单胞菌属) 。 1 2 3 假单胞菌产酶研究 微生物发酵产酶近年来在生物技术应用领域有着很广泛的应用。关于微生物 发酵产酶的相关报道很多，假单胞菌发酵代谢产酶也占据了很重要的地位。 田强等人【l l 】报道了温度对菌株p s e u d o m o n a ss p t u c l 3 菌体生长和产几丁质 酶的影响，提出t u c l 3 发酵生产几丁质酶的变温控制方案，通过对变温发酵的 主要工艺参数进行筛选和分析，得出t u c l 3 变温发酵产几丁质酶的最佳温度控 制措施。优化后的变温培养工艺可使发酵液几丁质酶酶活性达到1 7 3 7 1 u m l ， 比采用恒温发酵几丁质酶酶活峰值提高1 6 6 。 脂肪酶是一种重要的工业用酶，来自于假单胞菌的脂肪酶较来自其它菌株 的具有更强的温度、有机溶剂耐受性等比较优势，在有机合成、食品工业、药物 制造、油脂深：j 口- r 等工业应用方面应用潜力巨大f 1 2 1 。余琼【1 3 】从取自华中农业大 学的土样和长江流域及桂林桃花江水样中筛选到一株产低温脂肪酶的适冷菌，鉴 定其为假单胞菌，并命名p s e u d o m o n a ss p y t 3 4 8 。得到其最佳发酵条件为：玉 米浆2 0 0 ，豆饼粉2 5 0 ，蔗糖1 0 0 ，橄榄油0 5 7 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，k 2 h p 0 40 1 0 ，发酵温度8 c ，初始p h 值7 0 ，发酵时间4 8h ，装液量2 1 m l 2 5 0 m l ，转速1 8 2r m i n 。该条件下发酵酶活力可达到7 8 3 3 i7 m i 。该酶最适作 用p h 值为8 0 ，最适作用温度为3 0 ，在p h 值5 0 - - - 1 0 0 范围内、4 0 以下酶 活力较稳定。 谢宇【1 4 1 从土壤中分离出具有产壳聚糖酶能力的菌株，筛选出菌种y 4 为产壳 聚糖酶较好的菌株，并鉴定该菌株为施氏假单胞茵，同时，对菌株y 4 产酶条件 进行了研究，结果表明在p h 6 5 ，4 0 ，培养2 4h 时酶活力达到最大，提供了壳 聚糖降解的新思路。 王艳【1 5 】采用透明圈法，通过大量筛选得到8 株产壳聚糖酶的野生菌株。对 产壳聚糖酶最高的菌株y 8 的菌株形态特征和生理生化特征、生长曲线、培养时 间、培养起始p h 等生物学特性进行了试验并对该茵所产壳聚糖酶进行了抑菌实 验比较。y 8 菌株产壳聚糖酶酶活力为0 5 0 u m l ，依据伯杰细菌鉴定手册( 第 九版) ，初步鉴定为假单胞菌属的一个种。菌株y 8 的适宜培养p h 值为6 o 7 o ， 最适p h 值6 5 。适宜培养温度为2 8 - - 3 2 ，最适值3 2 。y 8 所产的壳聚糖酶 对细菌和真菌都有一定的抑制作用，对细菌的抑制作用要优于真菌。浓度为0 1 的壳聚糖酶抑菌能力高于1 壳聚糖，比o1 壳低聚糖的抑菌效果略高。 俞勇【1 6 】从南极乔治王岛冻土来源的7 6 株低温细菌中筛选到1 3 株低温脂肪 酶产生菌，对其中的b t s l 0 0 2 2 菌株进行鉴定。通过生理生化特征、1 6 sr d n a 基 因序列的同源性和系统发育分析发现，菌株b t s l 0 0 2 2 属于假单胞菌属，但与已 定名的假单胞菌有一定的差异，与未定名的p s e u d o m o n a ss p p s b 的亲缘关系最 接近，故将其暂定名为p s e u d o m o n a ss p b t s l 0 0 2 2 。对该菌脂肪酶的酶学性质初 步研究表明，酶的最适作用温度为2 4 ，对热敏感，6 0 处理3 0 m i n 仅残留2 5 酶活性，酶的适宜作用p h 范围在7 0 - 9 0 ，最适p h 为8 0 。 贺蒯 】采用摇瓶发酵法研究了不同碳源、氮源对恶臭假单胞菌s 1 干重和胞 内海藻糖合成酶酶活力的影响。通过正交试验得出其最佳培养基配方y 寸( g l ) ：葡 萄糖2 5 ，玉米浆1 5 ，麦芽糖2 0 ，豆粕水解液1 0ml l ，n a 3 c 6 h 5 0 7 - 2h 2 0o 5 ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 5 。优化后菌体密度、单位细胞产酶活力分别提高了1 4 4 倍和 7 2 1 6 。 刘晨光【堪l 从一株海洋假单胞菌中分离制备出一种具有纤溶活性的酶，对其 酶学性质进行实验研究。结果显示该酶的分子量是2 1 k d ，等电点是7 4 , - - , 7 5 ； 最适作用p h 是8 o ，最适作用温度是5 0 。该酶具有降解苯甲酰一l 精氨酸乙酯 盐酸盐( b a e e ) 的活性，酶的动力学分析表明：k m = 0 8 7 m m o l l ，v m a x = 1 8 0 x10 3 m m o l l s 。 徐虹【1 9 】比较了假单胞菌n x 1 在各种糖类物质、有机酸和氨基酸培养基上 生长和合成l 天冬氨酸p 脱羧酶o l ) 的情况，结果表明用不同的碳源培养基， n x 1 的生长和产酶表现出明显的差异。n x 1 能利用糖类物质生长，但a d l 合 成受阻遏。三羧酸循环中间体是a d l 合成的良好的碳源，谷氨酸是a d l 酶合 成最好的诱导剂，其诱导合成的a d l 是富马酸为碳源时的2 倍。对l 谷氨酸 ( l g l u ) 刺激a d l 酶生成的机理进行初步分析，认为l - g l u 通过自身( 而不是由 l g l u 衍生出的任何代谢物) 和a d l 合成的有关基因作用强烈诱导a d l 合成。 游银伟【2 0 】从黄海深海海底淤泥中筛选出一株产纤维素酶的适冷革兰氏阴性 杆菌m b 1 ，克隆和分析了m b 1 的1 6 s r d n a 序列( g e n b a n k 接受号：a y 5 51 3 2 1 ) ， 经鉴定为交替假单胞菌( p s e u d o a l t e r o m o n a s ) ，命名为p s e u d o a l t e r o m o n a s s p m b 1 。克隆了该菌适冷内切葡聚糖酶基因e e l a ( g e n b a n k 接受号：a y 5 5 1 3 2 2 ) ， 4 并在大肠杆菌b l 2 1 中进行了表达。重组e c o l i 菌体破碎后，获取上清液，其中 融合蛋白g s t - c e l a 浓度约为7 8 5 m g l 。分析了融合酶g s t - c e l a 的性质，其最 适反应温度为3 5 ( 2 ，最适反应p h 值为7 2 ，为中性适冷酶。实验结果为交替假 单胞菌低温纤维素酶的基础理论和应用研究奠定了基础。 金永杰【2 l 】对假单胞菌l 半胱氨酸合成酶的纯化和性质做了研究报道，假单 胞菌t s 1 1 3 8 的细胞浆液通过硫铵沉淀、s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤、 d e a e c e l l u l o s e5 2 离子交换、s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶过滤等分离纯化手段分别将从 l a t c 合成l - 半胱氨酸的两个酶l a t c 水解酶和l s c c 水解酶纯化了8 3 9 和 9 0 3 倍。s d s p a g e 鉴定均为单一条带，两种酶的相对分子质量分别为3 7 5 和 4 2 8k d ；酶反应的最适温度均为3 5 c ，最适p h 分别为7 o 和8 0 ；酶的米氏常 数分别为0 6 7 m m o l l 和o 15 m m o l l ，最大反应速度分别为0 3 9 x10 0 m m o l l m i n 和0 4 2 x1 0 。3 m m o l l r a i n 。 孟繁君f 冽采用假单胞菌发酵制备精氨酸脱亚胺酶，优化发酵