（分析化学专业论文）量子点的制备及其在生物分析中的应用.pdf

i l i x ad i s s e r t a t i o ni na n a l y t i c a lc h e m i s t r y l i l ll ll lll ll l ll ll l ll ll 、t18 4 4 5 9 2 p r e p a r a t i o n o fq u a n t u md o t sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n si nb i o l o g i c a la n a l y s i s b yy a n gd o n g z h i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r x us h u k u n n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j u l y2 0 0 8，吖 i 。j_一 1 1 l 一 t | ：。 k 步 么 气 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 = 亡己 思。 学位论文作者签名： 影毒之 日期： 谚g 7 岛 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 学位论文作者签名：彩另乞导师签名：钐我铷1 彳 签字日期： w 莎。7 身 签字日期： 。卿少驴 l 一 ， y 1 ， 一 、 ， ，1 j j i ，_ ， 、 时也存在光学稳定性较差、激发光谱范围窄、发射光谱较宽、与生物分子的背景荧光难 以区分等不可忽视的弱点，导致在应用中灵敏度下降。而量子点作为一种新型的荧光纳 米材料，弥补了有机染料的上述缺点，引起分析化学和生命科学领域的广泛关注。 荧光材料在获得广泛应用之前，必须具有普遍使用的制备方法。无论在国内还是国 际领域，量子点绝大部分是采用三辛基膦三辛基氧膦( t o p t o p o ) 体系在3 0 0 左右 高温合成的。由这种方法制得的量子点具有较好的光学性质和较高的荧光产率。然而， 采用t o p t o p o 体系合成量子点时，要求在试剂储存和制备过程中绝对无氧，合成条件 苛刻。同时，纵观国内外市场，量子点作为一种荧光试剂，价格非常昂贵。因此，研究 工作者开始寻求绿色、环保、更为有效的合成路线，以满足不同领域应用的需要。其中， 水相合成法和绿色有机合成法最引人瞩目。目前除c d t e 外，其它量子点如c d s 、c d s e 、 z n s 等在水相中均不能得到高质量的荧光性能。基于上述研究现状，本项研究立足于利 用廉价环保的绿色有机相法制备高质量荧光量子点，并考查它们在生物大分子标记以及 肿瘤细胞的免疫成像等领域中的应用。 首先，采用绿色无污染、价格低廉易得的石蜡作为反应溶剂和还原剂，在无需除氧 的条件下，选用长链不饱和酸一油酸作为反应配体和稳定剂，常见无机试剂为反应原料， 合成出c d s 、c d s e c d s 以及s e 掺杂的c d s 等三种纳米量子点。经光学性能表征，所制 备的三种量子点均具有荧光产率较高、半峰宽窄、峰形对称等优良的光谱性能；结构性 能表征表明合成的量子点尺寸分布均匀，为近似球形颗粒。最后，将制得的量子点经巯 基乙酸修饰后转移至水相，从而使其在生命科学领域中具有很好的应用前景。 其次，为了验证和考察采用油酸石蜡体系制备的量子点在生命领域中的应用情况， 经过实验实现了c d s e 量子点与生物大分子的链接，总结了量子点与酶、蛋白质等生物 大分子结合的作用规律。实验中选取四种具有代表性的生物大分子进行研究，分别为： 简单蛋白一牛血清白蛋白、胰凝乳蛋白酶，结合蛋白一牛血红蛋白以及c u z n 超氧化物 歧化酶。研究结果表明，量子点与简单蛋白结合后，蛋白质会以共价键形式结合在量子 点的表面，使其表面钝化，从而导致量子点荧光强度明显提高。然而，在量子点与结合 i i i h 东北大学博士学位论文摘要 蛋白的作用中，由于金属离子的影响，使其与蛋白质的作用复杂化，荧光光谱表现为蛋 白质与金属离子的双重作用结果，即简单蛋白使量子点荧光增强，而部分金属离子使荧 光减弱。 再者，基于与上述生物大分子的作用规律，利用量子点表面的羧基基团与抗体中氨 基基团之间的相互作用，分别实现了c d s e 量子点与兔抗人c e a 8 抗体以及羊抗兔免疫 球蛋白的结合，通过抗原一抗体之间的特异性反应，采用直接和间接方法分别完成了 c d s e 量子点对宫颈癌上皮细胞一h e l a 细胞的免疫标记与成像。间接方法可以消除量子 点在细胞表面的非特异性吸附，表现出比直接方法更好的标记效果。标记完成2 4h 后， 量子点标记的h e l a 细胞表面仍然呈现出了明亮的荧光，具有很好的荧光稳定性。 分别考查了巯基丙酸和半胱胺稳定的c d t e 量子点与纳米金纳米颗粒之间的相互作 用。利用金纳米粒子能够稳定而迅速地吸附蛋白质以及量子点能与蛋白质结合的特性， 以胰凝乳蛋白酶为桥梁，实现了纳米金与巯基丙酸修饰的c d t e 量子点之间的荧光共振 能量转移，为纳米颗粒与生物大分子之间的相互作用提供了新的研究思路。 简言之，本项工作以寻求简单、环保的制备高质量量子点的方法为出发点，建立了 制备一系列量子点的新方法。同时，讨论了量子点与生物大分子之间结合的作用规律， 并以此为基础，将量子点与抗体结合，实现了对肿瘤细胞的免疫标记和成像。此外，还 对纳米金与量子点之间的相互作用做了系统考查。研究还表明，在量子点的多功能化、 特异性检测等方面仍然存在很大的发展空间，是今后该领域很有前景的研究方向之一。 关键词：量子点；绿色有机合成法；荧光探针；蛋白质；酶；纳米金；细胞成像；荧光 共振能量转移 i v 、 一 州一r l 、 、 ， ，一 东北大学博士学位论文 a b s t r a c t p r e p a r a t i o no fq u a n t u m d o t sa n dt h e i r a p p l i c a t i o n si nb i o l o g i c a la n a l y s i s a bs t r a c t t h ek e ys k i l lf o rd e v e l o p i n gf l u o r e s c e n tp r o b e si st oe x p l o r ef i n ef l u o r e s c e n c em a t e r i a l s a n d r e a g e n t s w i t h h i 【g hs e n s i t i v i t y , g o o ds t a b i l i t y a n dd i v e r s i f i c a t i o n a l t h o u g hw i t h c h a r a c t e r i s t i c so f h i g h f l u o r e s c e n c e y i e l d s ， c o n v e n t i o n a l o r g a n i cd y e s s h o ws o m e s h o r t c o m i n g ss u c ha sn a r r o w e re x c i t a t i o n ，b r o a d e re m i s s i o ns p e c t r a ，l o w e rs e n s i t i v i t ya n d p o o rs t a b i l i t y , w h i c hl e a dt om u c hd i f f i c u l t yt od i s t i n g u i s ht h e mf r o ms e l ff l u o r e s c e n c eo f b i o - m o l e c u l e si na p p l i c a t i o n s q u a n t u md o t s ( q d s ) j u s tc o m et oo v e r c o m et h e s el i m i t a t i o n s o fo r g a n i cd y e sa n da t t r a c tm u c ha t t e n t i o no fr e s e a r c h e r si na n a l y t i c a la n db i o l o g i c a lf i e l d s f o ra n yf l u o r e s c e n tm a t e r i a l s ，f a c i l es y n t h e s i sm e t h o ds h o u l db ed e v e l o p e d b e f o ，r et h e y a r eu s e dw i d e l y n o w , q u a n t u md o t sa r em o s p r e p a r e du s i n gt o p f o p os y s t e mi nw h i c h r e a g e n t sa r ei n j e c t e di n t oa h o tc o o r d i n a t i n gs o l v e n tt r i n - o c t y l p h o s p h i n eo x i d e ( t o p o ) a t h i g ht e m p e r a t u r e ( a b o u t3 0 0 ) t h i sm e t h o dw o u l dn o tb ep o p u l a rb e c a u s et h es y n t h e s i s a n d s t o r a g ep r o c e d u r e sn e e dt ob eo p e r a t e du n d e rr i g o r o u sc o n d i t i o n ss u c ha sf u l lo fn i t r o g e n ， w i t h o u tw a t e ra n do x y g e ne t c , e v e nt h o u g ht h ea sp r e p a r e dq d sp o s s e s sg o o do p t i c a l p r o p e r t i e sa n dh i g hq u a n t u my i e l d s ( q y s ) f u r t h e r m o r e ，o v e r l o o k i n gt h em a r k e t sa th o m e a n da b r o a d ，q d s ，a sa t y p eo ff l u o r e s c e n c er e a g e n t s ，a r ev e r ye x p e n s i v e t h e r e f o r e ，i ti sv e r y i m p o r t a n tt os e a r c hg r e e n e ra n de f f e c t i v er o u t e st of u l f i lt h ed e m a n d si nd i f f e r e n tf i e l d s a m o n gt h e m ，s y n t h e s i sm e t h o d si na q u e o u ss o l u t i o na n dg r e e no r g a n i cl i g a n d sa t t r a c t e dm u c h m o r ea t t e n t i o n u n f o r t u n a t e l y , q d ss u c ha sc d s ，c d s e ，z n so b t a i n e di na q u e o u ss o l u t i o n u s u a l l ys h o wl o wq y s ，a l t h o u g ht h e yh a v eg o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t y b a s e do na b o v e s t a t e s ，t h ea i mo ft h ep r e s e n tw o r ki st os y n t h e s i z eh i g h q u a l i t yo d si nan e ww a ya n dt h e n u s et h e mi nm a c r o - m o l e c u l e sp r o b e s ，a sw e l la si m m u n o - i m a g i n g so ft u m o rc e l l s f o rt h ep r e p a r a t i o no fq d s ，a sd e s c r i b e di nt h es e c o n da n dt h i r dp a r to ft h i st h e s i s ，a c o n v e n i e n ta n de n v i r o n m e n tf r i e n d l i e rs t r a t e g y , i nw h i c hp a r a f f i nw a su s e da ss o l v e n ta n d r e d u c t a n tw h i l eo l e i ca c i da c t e da ss t a b i l i z e r , w a sa p p l i e dt op r e p a r ec d s ，c d s e c d sa n ds e d o p e d c d sq d s o p t i c a la n ds t r u c t u r ep r o p e r t i e si n d i c a t e dt h a tt h ea sp r e p a r e dq d ss h o w e d e x c e l l e n tf l u o r e s c e n c es p e c t r aw i t hn a r r o wf w h m ( t h ef u l lw i d t ha tt h eh a l fm a x i m u m ) ， v 东北大学博士学位论文a b s t r a c t g o o dd i s p e r s i b i l i t y a n dd e s i r a b l ef l u o r e s c e n c ey i e l d s t e mi m a g e si n d i c a t e dt h a tq d s d i s p e r s e dw e l l i n a q u o u ss o l u t i o na n dt h es h a p ew a sa p p r o x i m a t e l ys p h e r i c a l a f t e r m o d i f i c a t i o nw i t h2 - m e r c a p t o a c e t i ca c i d ，q d sw e r et r a n s f e r r e di n t oa q u e o u ss o l u t i o na n dg o t w a t e r - s o l u b l i t yf o rf u h e ra p p l i c a t i o n si nb i o l o g i c a ls y s t e m f o rt h ea p p l i c a t i o n so fq d si na n a l y t i c a la n db i o l o g i c a lf i e l d s ，as t u d ya b o u tt h e c o n j u g a t i o nb e t w e e nc d s eq d sa n dm a c r o m o l e c u l e sw a sc a r r i e do u t ，i nw h i c ht h ei n t e r a c t i o n r u l e sb e t w e e nq d sa n db i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e ss u c ha sp r o t e i n sa n de n z y m e sw e r e o b t a i n e d i nt h i sw o r kd e s c r i b e di nt h ef o u r t hp a r to ft h i st h e s i s ，f o u rk i n d so fp r o t e i n sw e r e c h o s e n ，t h e yw e r en o r m a lp r o t e i n s - b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dc h y m o t r p s i n ，a sw e l la s m e t a l l o p r o t e i n a s e c u z ns o da n db o v i n eh e m o g l o b i n e x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a t n o r m a lp r o t e i n sc o u l db ec o v a l e n t l yl i n k e dt oq d sa n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fq d s e n h a n c e dm a r k e d l ya f t e rc o n j u g a t i n gw i t hb s aa n dc h y m o t r y p s i nd u et ot h e i rp a s s i v a t i o n0 1 1 t h ed e f e c t so fq d s h o w e v e r , f o rt h ec o n j u g a t i o no fq d sw i t hm e t a l l o p r o t e i n ，t h ep r e s e n c eo f m e t a li o n sm a d et h ec o n j u g a t i o nb ec o m p l i c a t e da n dl e a dt ot h ef l u o r e s c e n c es p e c t r as h o w i n g t w ok i n d so fr e s u l t s ：t h en o r m a lp r o t e i n sc o u l de n h a n c ei t si n t e n s i t ya n dt h em a t a li o n si n m e t a l l o p r o t e i nc o u l dq u e n c hi t w i t ht h es i m i l a rl i n k i n gm e t h o da sd e s c r i b e da b o v e ，c d s eq d sw e r ec o n j u g a t e dw i t h r a b b i ta n t i - c e a 8a n t i b o d ya n dg o a ta n t i - - r a b b i ti g gt h r o u g ht h ei n t e r a c t i o no fc a r b o x y l i c g r o u p so nt h es u r f a c eo fq d sa n da m i n og r o u p so na n t i b o d y b yt h er e a c t i o nb e t w e e n a n t i b o d ya n da n t i g e n ，b o t hq d s a n t i b o d ya n dq d s - l g gp r o b e sw e r es u c c e s s f u l l yu s e dt o l a b e lh e l ac e l l s ，a sd e s c r i b e di nt h ef i f t hp a r t e x p e r i m e n t a lr e s u l t so ff l u o r e s c e n c ei m a g i n g i n d i c a t e dt h a tt h en o n s p e c i f i ca d s o r p t i o nc o u l db ee l i m i n a t e dt h r o u g ht h ei n d i r e c tl a b e l i n g m e t h o d t r a c k i n gt h es i g n a lo fi m a g i n gf o r2 4h ，q d ss t i l l e x h i b i t e dh i g ha n ds t a b l e f l u o r e s c e n c e i nt h es i x t hp a r t ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng o l dn a n o p a r t i c l e s ( n c s ) a n dc d t eq d sc a p p e d w i t hm e r c a p t o p r o p i o n i ca c i do rc y s t e a m i n ew e r es t u d i e d p r o t e i n sc a nb en o to n l ya d s o r b e d o nt h es u r f a c eo fg o l dn c s ，b u ta l s ol i n k e dt oq d si na p p r o p r i a t es o l u t i o na t m o s p h e r e b a s e d o nt h a t ，f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r s ( f r e t ) a s s e m b l eb e t w e e nq d sa n dg o l d n c sw i t hc h y m o t r y p s i na st h eb i n d i n gb r i d g ei s d e v e l o p e d t h i sw o r kp r o v i d e ds o m e v a l u a b l ei n f o r m a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo nt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s ma m o n gn a n o p a r t i c l e s i nc o n c l u s i o n ，t h i sw o r kb e g a nw i t hs e e k i n gf o ran e we n v i r o n m e n tf r i e n d l ya n ds i m p l e v 1 ， i1 【 0 1 1 v i i r 一 、 r一 j1，i 龟 ， 1 1 2 2 复合型纳米粒子4 1 2 3 磁性纳米晶体5 1 2 4 发光量子点一5 1 3 量子点的定义与性质6 1 3 1 量子点的定义一6 1 3 2 量子点的光学性质6 1 3 3 量子点的结构性质与表征9 1 4 量子点的制备1 0 1 4 1 高温有机相合成法1 0 1 4 2 水相合成方法1 2 1 4 3 微波辅助及其它方法1 3 1 4 4 量子点的表面修饰1 4 1 5 量子点的应用。1 5 1 5 1 量子点在生物医学中的应用1 5 1 5 2 量子点用于活体成像1 7 1 5 3 基于能量转移技术研究生物大分子之间的相互作用1 8 i x 东北大学博士学位论文目录 1 5 4 其它应用。2 0 1 6 本项工作的研究思路、主要内容和意义。2 1 第2 章有机相法合成c d s e i 甜s 纳米量子点。2 3 2 1 引言2 3 2 2 实验部分2 4 2 2 1 仪器设备及装置2 4 2 2 2 实验试剂2 4 2 2 3 实验方法2 4 2 3 结果与讨论2 6 2 3 1c d s e c d s 核壳结构量子点的合成2 6 2 3 2 反应温度的影响2 7 2 3 3 硫化钠加入量的影响2 8 2 3 4 量子点的光谱性能。3 0 2 3 5 量子点的结构特性3 1 2 4 小结3 3 第3 章有机相法合成c d s 及s e 掺杂的c d s 纳米量子点3 5 3 1 弓i 言3 5 3 2 实验部分3 5 3 2 1 实验仪器3 5 3 2 2 实验试剂3 6 3 2 3 实验方法。3 6 3 2 4c d s 及s e 掺杂c d s 纳米粒子的表面修饰3 7 3 2 5 性能测试3 8 3 3 结果与讨论。3 8 3 3 1c d s 及s e 掺杂c d s 量子点的制备3 8 3 3 2 反应条件与量子点的性能表征3 9 3 3 3 两种量子点的表面修饰4 4 3 4 j 、结4 5 第4 章c d s e 量子点与蛋白质的相互作用研究4 7 、 ， 一 一 r 4 3 3 量子点与c u z 1 1 s o d 和牛血红蛋白之间的相互作用5 1 4 4 量子点与蛋白质作用机理探讨。5 5 4 4 1 量子点与不含金属的蛋白质之间的相互作用5 5 4 4 2 量子点与含金属的蛋白质之间的相互作用。5 6 4 5 ，j 、结5 6 + 第5 章c d s e 量子点用于h e l a 细胞的荧光免疫标记与成像5 7 5 1 引言。5 7 5 2 实验部分5 8 5 2 1 实验仪器58 ， 5 2 2 实验试剂5 8 5 2 3c d s e 量子点的制各5 8 5 2 4c d s e 量子点与一抗和二抗的链接5 9 5 2 5 细胞的培养、固定与荧光显微成像5 9 5 3 结果与讨论6 0 5 3 1c d s e 量子点的光学性质6 0 5 3 2c d s e 量子点与一抗和二抗的链接6 0 5 3 3h e l a 细胞的直接标记j 6 2 5 3 4h e l a 细胞的间接标记6 4 5 4d 、结6 5 第6 章量子点与纳米金之间的相互作用研究6 7 6 1 引言6 7 x i x i i ， p l 、 东北大学博士学位论文 q d s n c s f r e t f w h m q y s s o d t o p t o p 0 n h s b s a c m c i g g c e a m p a t e m x r d e d x c f s f i t c s a e d x i i i 半峰宽 量子产率 超氧化物歧化酶 三辛基膦 三辛基氧膦 n 羟基琥珀酰亚胺 牛血清白蛋白 羧甲基壳聚糖 免疫球蛋白 癌胚抗原 巯基丙酸 透射电镜 x 射线衍射仪 能量色散x 射线荧光光谱 复合荧光二氧化硅微粒 异硫氰酸荧光素 选区电子衍射 ， ，、 、， 一 - - 一 东 8 0 究 也不是微观的简单累加，而是出现许多新的现象和规律，因而形成了- i - j 衔接微观和宏 观的崭新学科一纳米科技。它的基本涵义是在纳米尺寸范围内创造功能性材料、设备及 系统和对物质新性能及现象的探索。研究内容为尺寸在0 1 1 0 0a m 之间的物质组成、 运动规律、相互作用以及潜在的实际应用中所遇到的技术问题。主要包括纳米体系物理 学、纳米化学、纳米材料学、纳米生物学、纳米电子学、纳米加工学和纳米力学等七个 部分，它们之间既相对独立又相互交叉。其中，纳米材料是纳米科技发展的基础，也是 最为活跃，研究内容最为丰富的分支。纳米量子点是将材料的尺寸在三维空间内进行约 束，并达到一定的临界尺寸的材料，其行为具有量子特性，在受到光激发时会产生较强 的荧光。一般纳米材料通常应用于显示器、光电子元件、激光器等技术领域，而利用量 子点的荧光性能作为生物标记物在生命科学领域的应用被认为是一个出人意料并且令 人惊喜的新发现。 1 1 纳米材料 纳米材料在发展初期是指纳米微粒以及由其构成的纳米薄膜和固体。目前，广义的 讲，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构 成的材料。按照维数，纳米材料可以分为以下四类：( 1 ) 零维，是指在空间三维尺度均 为纳米级别的纳米材料，如纳米微粒、纳米团簇等；( 2 ) 一维，是指在空间三维中有两 维为纳米尺度的纳米材料，如纳米管、纳米棒、纳米线等：( 3 ) 二维，是指在空间三维 中有一维为纳米尺度的纳米材料，如多层膜，超薄膜等；( 4 ) 三维纳米材料，是指纳米 块体。 纳米材料的性质与其构成单元密切相关，而作为一类新的物质层次，这些介于宏观 和微观原子、分子尺度之间的纳米粒子体系表现出了许多与块状材料明显不同的性质和 新规律。对于量子点来说，它是相对较大的原子的团簇，属于零维纳米材料，它具有体 相材料的晶格结构和依赖于尺寸的电子结构。图1 1 是不同维度纳米材料的电子结构分 布图。 1 东北大学博士学位论文第1 章绪论 a b 叟e 剽t 丝 t e l k i k 止k j - 图1 1 三维、二维、一维和零维材料的电子结构【1 1 八能带结构，b 态密度 f i g 1 1t h ee l e c t r i c a ls t r u c t u r e so fm a t e r i a l sw i t hd i f f e r e n td i m e n s i o n a l i t y a b a n ds t r u c t u r e ，b d e n s i t yo fs t a t e 由图1 1 可以看出维度对电子态密度的影响趋势。随着维度降低，电子态密度逐渐 由连续分布过渡到类似于原子能级的分立分布，因此，在宏观上纳米材料表现出小尺寸 效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应及介电效应等性质。分别介绍如下： 小尺寸效应是指纳米材料中的微粒尺寸小到与光波波长或德布罗意波长、超导态的 相干长度等物理性质相当或更小时，晶体周期性的边界条件被破坏，非晶态纳米微粒的 表面层附近原子密度减小，使得材料的声、光、电、磁、热和力学等性质出现改变而导 致新特性出现的现象。 表面效应是指由于组成纳米材料的纳米粒子尺寸很小，微粒表面所占有的原子数目 远远多于相同质量的非纳米材料粒子表面所占有的原子数目，而随着微粒粒径的变小， 其表面所占粒子数目呈几何级数增加，纳米粒子的高表面积带来高表面能，使粒子表面 极其活跃，很容易吸附气体或与周围的气体发生反应。 当纳米微粒的尺寸达到与光波波长或其它相干波长等物质特征尺寸相当或更小时， 金属费米能级附近的电子能级由准连续变为离散并使能隙变宽的现象被称为纳米材料 的量子尺寸效应。 由于电子既具有粒子性又具有波动性，因此存在隧道效应。近年来，人们发现一些 宏观物理量，如微小颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量等也显示出隧道效应， 称之为宏观的量子隧道效应。宏观量子隧道效应将成为未来微电子、光电子器件的基础， 2 东北大学博士学位论文第1 章绪论 或者确立现存微电子器件进一步微型化的极限。当微电子器件进一步微型化时必须考虑 上述量子效应。例如，在制造半导体集成电路过程中，当电路尺寸接近于电子波长时， 电子就会通过隧道效应溢出器件，使器件无法正常工作，经典电路的极限尺寸大概在2 5 0 姗。 除上述主要性质之外，纳米材料还具有表面缺陷、量子隧穿等其它特性，这些特性 使纳米材料表现出诸如具有磁性、光学性能、热学性质和表面活性等许多独特的物理和 化学性质。 当前，纳米材料的研究已经在世界范围内普遍展开，并得到迅速发展。已经举办多 次国际会议，有关研究报道也急剧增长。其中，美国、德国、日本、俄罗斯等国家在纳 米材料的研究中居于领先地位。我国关于纳米材料的研究起步较晚，但是目前发展迅速， 其研究成果已经涉及了化学、物理、生物等多个领域。 1 2 用于荧光标记的纳米微粒 近几年，在纳米粒子的合成和性质改造上取得的显著成果使纳米粒子的荧光标记在 生物学上的应用也开始崭露头角。目前，有金属纳米粒子、复合型纳米粒子、磁性纳米 粒子及发光量子点等纳米粒子被用于生物荧光标记。 罄 1 2 1 有光学活性的金属纳米粒子 当光照射到金属纳米粒子表面时，光与金属之间会发生相互作用。当照射光的频率 与金属颗粒的固有振荡频率相同时，就会产生表面等离子共振现象，表现为金属纳米粒 子在紫外一可见光区有吸收带1 2 - 3 。处于某种介质中的单个金属纳米粒子的表面等离子 体共振与纳米粒子的半径、材料和周围介质的介电常数等因素有关。总能级一定时，纳 米粒子尺寸越小，颗粒内相邻能级之间的能级差越大，金属胶体颗粒的吸收峰位置也随 之蓝移；反之，吸收峰随颗粒尺寸的增大而红移。 金属纳米粒子标记物主要是指贵金属金( a u ) 、银( a g ) 等纳米粒子，其中使用最多、 研究最为广泛的对象当首推纳米金【4 5 】。由于它对光产生表面等离子体共振吸收和散射， 因而具有很好的光学特性，并可通过颗粒的尺寸、形状及其组合状态的改变而得到有效 调节。这种纳米颗粒的光学性质及其变化可以通过紫外一可见吸收光谱、共振瑞利散射 光谱和表面增强拉曼光谱等手段进行表征。因此，金纳米粒子标记探针作为标记物被广 泛用于蛋白质检测和免疫分析中【诵】。但在研究初期，可能是由于金属纳米粒子与核酸 分子链接困难或难以具有良好的稳定性等原因，用这种标记物检测核酸分子的研究在很 3 纳米材剃1 5 1 7 1 。它是在荧光染料中加入氨水和硅烷化试剂，后者在前者催化作用下水解 并聚合形成三维网状结构包覆在核材料的周围，从而形成纳米颗粒的壳层。t a n 等利用 二氧化硅为介质材料，制备了内含罗丹明、荧光素、r o x 染料等的纳米级二氧化硅颗 粒【1 8 1 9 1 。s a n t r a 等人用反相微乳液法合成了以荧光染料r u ( b p y ) 3 与二氧化硅复合的荧光 纳米颗粒并在其表面上共价结合了羊抗人l g g 抗体， 细胞。与异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记抗体的免疫 4 东北大学博士学位论文第1 章绪论 【冽。曲会英等【2 l 】通过控制荧光团修饰的硅烷前体在反相胶束体系中的水解缩合，合成 了新型的荧光团杂化纳米s i 0 2 微球( n f h s 微球) ，然后以n f h s 微球为标记探针，建 立了夹心式荧光免疫分析人甲胎蛋白( a f p ) 的方法，检测限为o 0 5n g m l 。在核酸测 定方面，z h a oxj 等人1 2 2 l 将c f s 纳米粒子用于d n a 杂交检测，信号得到了有效放大， 显著提高了检测的灵敏度，检测限可至f m o l 以下。何晓晓等【2 3 l 研究了核芯材料的分子 量、结构以及静电作用对合成过程和结果的影响，这一研究成果对如何选择合适的核芯 材料和壳材料具有很好的指导意义。 1 2 3 磁性纳米晶体 磁性材料概括起来可以分为有机磁性材料和无机磁性材料。有机磁性材料主要是指 金属有机络合型磁性高分子材料，它在记忆材料、微波通讯器件等方面体现出广泛的应 用前景；而无机磁性材料主要包括铁、钴、镍、锰及其合金、氧化物和稀土金属永磁材 料等。对于无机磁性材料来说，当磁性颗粒粒径在纳米级以内时，表现为超顺磁性，即 在外加磁场的作用下，有良好的磁响应性能，撤除磁场后剩磁为零。利用这一特性，在 ” 临床靶向治疗中既能使到达靶区的作用因子达到最大程度的浓集，又能在治疗结束后使 体内的磁性颗粒达到最有效的清除，从而减少体内慢性铁蓄积的毒性作用，达到高效无茎 毒的治疗效果1 2 4 , 2 5 】。 通过包裹不同的有机官能团，纳米量级的磁性颗粒可以应用在酶或蛋白质的固定、 基因、放射性药剂、磁共振对比剂、免疫测定、r n a 和d n a 纯化、靶向药物等领域 2 6 - 2 9 1 。 ： 临床研究证明，超顺磁性的f e 3 0 4 粒子性能稳定、毒副作用小，具有较好的生物安全性 3 0 - 3 2 1 。在静脉注射诊断中，粒径小于5n i n 的f e 3 0 4 粒子由于具有穿透血脑屏障、在血 液中分散性高、更容易被巨噬细胞吞噬而延长半衰期等特点，能够提高在诊断学中的准 确度。 1 2 4 发光量子点 量子点又称为半导体纳米晶体，是一种由i i v i 族或i i i v 族元素组成的纳米颗 粒，性质稳定，能够受激产生荧光，具有类似于体相晶体的规整原子排布，其主要类型 如表1 1 所示，目前研究较多的主要是c d x ( x = s 、s e 、t e ) 等几种。由于量子点粒径 很小，电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构。通过调控 量子点的大小可以严格控制其光吸收和发射特征。晶体颗粒尺