（卫生毒理学专业论文）氯化镧对神经元的毒性作用及可能机制研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文 前言”9 刚舌” 材料与方法1 0 结果15 讨论2 1 结论2 4 四、本研究创新性的自我评价2 5 五、参考文献。2 6 六、附录 综述2 9 致谢4 1 个人简介4 2 中文论著摘要 氯化镧对神经元的毒性作用及可能机制研究 刖菁 我国是世界上稀土储量和产量最多的国家，稀土已在各个领域得到广泛应用， 由此不可避免地通过各种途径进入动物和人体，因此研究稀土元素对动物和人体 生理功能的影响及其机制，探明稀土元素的安全摄入量，已成为研究者关注的课 题。 有研究表明稀土具有神经毒性，高级神经中枢对其毒性较其他器官更敏感。 赣南稀土矿区的流行病学调查显示，该地区儿童认知和感知运动行为能力以及学 习能力降低，提示长期摄入低剂量稀土影响大脑功能。动物实验资料表明，稀土 可通过血脑屏障并在脑组织蓄积，并通过影响神经细胞代谢活力；影响神经递质 释放和摄取：损伤海马区域结构促使细胞凋亡等途径影响学习记忆。 镧是轻稀土的代表，化学性质较活泼，其离子半径与c a 2 + 相似。研究发现， 低浓度镧不影响小鼠皮层细胞的代谢活力，但3 0 m m o l l 镧可直接升高钙荧光比 值，并加剧谷氨酸的兴奋性神经毒性损伤。本室既往研究也证实了1 0 氯化镧饮 水组大鼠子鼠海马神经细胞内钙离子浓度升高，海马神经元凋亡率显著增加，学 习记忆能力下降。本研究对体外培养的大脑皮层神经元进行氯化镧染毒处理，观 察不同剂量镧暴露对细胞内游离钙浓度、胞浆及线粒体细胞色素c 含量、c a s p a s e 3 表达水平和细胞凋亡的影响，探讨氯化镧对中枢神经系统的毒性作用机制。 实验分组 根据l a c l 3 浓度分为四组，分别为0 0 1 ，0 1 ，1 0 ，2 0 m m o l l ，用无血清d m e m 作为对照组，无血清d m e m 配制l a c l 3 。 研究方法 l 、神经元的鉴定n s e 免疫细胞化学法 2 、细胞形态学观察倒置显微镜 3 、细胞存活率测定m t t 法 4 、细胞凋亡检测流式细胞仪法 5 、细胞内游离钙离子浓度测定f u r a - 2 a m 荧光探针法 6 、胞浆和线粒体中细胞色素c 含量测定化学比色法 7 、c a s p a s e 3 活性测定 w e s t e r n b l o t 法 结果 l 、神经元的鉴定 n s e 免疫组化后，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张 爬片随机选取1 0 个视野，以其中阳性神经元的数目占总细胞的比例作为神经元纯 度，经鉴定神经元的纯度为9 0 以上。 2 、细胞存活率 氯化镧对神经元有一定的细胞毒性，各剂量组与对照组相比均有统计学差异 0 o 0 1 ) ，且随暴露浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，存在一定的剂量- 反应关 系，且在1 0 m m o l l 时细胞半数受抑。 3 、细胞凋亡检测 随氯化镧浓度的增大，细胞凋亡率逐渐增加，除o o l m m o l l 剂量组外，氯化 镧暴露组细胞凋亡率与对照组相比均显著升高( p 0 0 1 ) 。 4 、细胞内【c a 2 + 】i 的变化 镧暴露组神经元细胞内 c a l i 显著升高，与对照组差异明显( p o 0 5 或o 0 1 ) ， 并随镧暴露浓度的增大而升高，各剂量组间差异亦明显( p o 0 5 或o 0 1 ) 。 5 、线粒体和胞浆中细胞色素c 含量变化 镧暴露各组神经元线粒体中细胞色素c 含量降低，胞浆中细胞色素c 含量升 高，与对照组比较差异显著( p 0 0 5 ) ，并且随染毒浓度的增加而呈现剂量- 反应关 系。 6 、c a s p a s e 。3 蛋白表达变化 随着l a c l 3 浓度的增大，p r o c a s p a s e - 3 ( 3 2 k d ) 表达逐渐减少，说明活化的 e a s p a u s e 一3 蛋白逐渐增多，且0 1 和1 0 m m 剂量组与对照组差异明显( p 0 0 5 ) 。 2 3 t h er a r ee a r t h sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di na l lk i n d so ff i e l d s ，t h u si n v a d et h ea n i m a l a n dh u m a nb o d yt h r o u g hv a r i e t yo fa p p r o a c h e si n e v i t a b l y , t h e r e f o r e ，m a k es e a r c ho n t h e 矗l r ee a r t h se l e m e n t s i n f l u e n c ea n dt h em e c h a n i s mt ot h ep s y c h o l o g i c a lf u n c t i o no f a n i m a la n dh u m a nb o d y , a n de x p l o r et h er a r ee a r t h s s a f ei n t a k eh a sb e c o m et h es u b j e c t f o c u s e db yt h er e s e a r c h e r t h er e s e a r c hi n d i c a t e dt h e r ew a sn e u r o t o x i c i t yi nt h er a r ee a r t h s ，t h eh i g h g r a d en e r v o u sc e n t e rw a sm u c hs e n s i t i v et oi t st o x i c i t yc o m p a r e d 、忻mo t h e ro r g a n s t h ee p i d e m i o l o g yi n v e s t i g a t i o ni nt h er a r ee a r t h sd i g g i n g si nt h es o u t ho fj i a n g x i p r o v i n c es h o w e dt h a tt h ec o g n i t i v eb e h a v i o u ra b i l i t y , p e r c e i v i n gb e h a v i o u ra b i l i t ya n d l e a r n i n ga b i l i t yd e c r e a s e di nt h i sa r e a , w h i c hp o i n t e do u tt h a tt h el o n g - t e r ml o wd o s a g e r a r ee a t t h si n t a k ea f f e c t e dt h eb r a i nf u n c t i o n t h ea n i m a le x p e r i m e n t a lm a t e r i a l d e c l a r e dt h a tt h er a r ee a r t h sc o u l dg e tt h r o u g ht h eb l o o d b r a i no b s t a c l ea n da c c u m u l a t e i nt h eb r a i no r g a n i z a t i o n ，a n da f f e c tt h el e a r n i n gm e m o r yt h r o u g ht h ea p p r o a c h e so f a f f e c t i n gt h em e t a b o l i cv i g o ro fn e u r o nc e l l ，a f f e c t i n gt h en e u r o nt r a n s m i t t e rr e l e a s e a n di n t a k e ，a n dd a m a g i n gt h eh i p p o c a m p u sa r e as t r u c t u r et op r o m o t et h ec e l la p o p t o s i s ， e r e t h el a n t h a n u mi st h er e p r e s e n t a t i v e so ft h el i g h tr a r ee a r t h sw i t ha c t i v ec h e m i c a l q u a l i t y i t si o n i cr a d i u si ss i m i l a ra sc a 2 + t h er e s e a r c hd i s c o v e r e d , t h el a n t h a n u m w i t h l o wc o n c e n t r a t i o nw o u l dn o ta f f e c tt h em e t a b o l i cv i g o ro fc o r t i c a lc e l l so fm o u s e ，b u t t h e3 0 m m o l ll a n t h a n u mc o u l di n c r e a s et h ec a l c i u mp h o s p h a t er a t i od i r e c t l y , a n d i n t e n s i f i e dt h eg l u t a m i ca c i d se x c i t a b i l i t yn e u r o t o x i c i t yd a m a g e i tn o to n l ym a d e r e s e a r c hb u ta l s oa p p r o v e dt h a ti ft h ec a l c i u mi r o ni nt h en e r v ee e u so ft h er a t s ，m i c e a n dh i p p o c a m p u si nt h eg r o u po f1 o l a n t h a n u mc h l o r i d ed r i n k i n gi n c r e a s e d t h e 4 a p o p t o s i sr a t eo ft h eh i p p o c a m p u sn e u r o n so b v i o u s l yi n c r e a s e d ，a n dt h el e a r n i n ga n d m e m o r ya b i l 时d e c r e a s e d t 1 1 er e s e a r c hd e a l tw i t ht h ec h e m i c a lc o n t a m i n a t i o no f t h e l a n t h a n u mc h l o r i d et ot h ec o r t i c a ln e u r o n si nv i t r oc u l t u r e ，o b s e r v e dt h ea f f e c t i o no ft h e l a n t h a n u me x p o s u r ei nd i f f e r e n td o s e st ot h ef le ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n , e n d o c h y l e m a , t h em i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m ecc o n t e n t ，c a s p a s e - 3e x p r e s s i o nl e v e la n da p o p t o s i s ，a n d d i s c u s s e dt h el a n t h a n u mc h l o x i d e st o x i ca c t i o nm e c h a n i s mt ot h ec e n t r a ln e r v o u s s y s t e m _ 1 一 - - j 一 - e x p e r i m e n t a lg r o u p i n g n l el a c l 3i sc o n f e c t e dw i t ht h ed m e mw i t h o mb l o o ds e r u m ，t h ef i n a l c o n c e n t r a t i o ni so o1 ，0 1 ，1 o ，2 o m m o l ls e p a r a t e l y , t h ed m e mw i t l l o mb l o o ds e r u n l i sa p p l i e di nt h ec o m p a r a t i v eg r o u p r e s e a r c hm e t h o d s 1 n e r v ec e l li d e n t i f i c a t i o n , n s ei m l n u n o c y t ec h e m i c a lm e t h o d 2 c e l l sm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n , i n v e r t e dm i c r o s c o p e 3 c e l lv i a b i l i t yt e s t ，m t tm e t h o d 4 a p o p t o s i st e s t ，f l o wc y t o m e t r y 5 c e i l sf l e ec a l c i u mi o nc o n c e n t r a t i o nt e s t , f u r a - 2 a mf l u o r e s c e n c ep r o b em e t h o d 6 e n d o c h y l e m aa n dt h em i t o c h o n d r i a lc y t o c l l r o r n e cc o n t e n tt e s t ，c h e m i s t r y c o l o r i m e t r y 7 c a s p a s e 一3a c t i v a t i o nt e s t ，w e s t e r n b l o tm e t h o d r e s u l t s 1 n e r v ec e l li d e n t i f i c a t i o n i tc o u l ds e et h a tm o s to ft h ep l a s m aw a sd y e di n t op a l my e l l o wu n d e rt h e m i c m s c o p e s e l e c t e d10v i s u a lf i e l d si ne v e r yg l a s sp i e c ea n dc a l c u l a t e dt h ep o s i t i v e c e i l sp r o p o r t i o n ，t h ei m m u n ep o s i t i v ec e l l sc o u l dr e a c ho v e r9 0 ，t h e r e f o r e ，t h ec e l l si n c u l t u r ec o u l db em a d ea st h en e u r o n a lv i t r om o d e 2 c e l lv i a b i l i t y t h e r ew a sac e r t a i nt o x i c i t yt ot h en e u r o n sf o rt h el a n t h a n u mc h l o r i d e t h e r ew a s s t a t i s t i cd i f f e r e n c ea m o n gt h ed o s eg r o u pa n dc o m p a r a t i v eg r o u p ( p 0 01 ) w i t ht h e 5 i n c r e a s eo ft h ee x p o s u r ed o s e ，t h ec e l lv i a b i l i t yg r a d u a l l yd e c r e a s e d ac e r t a i nd o s ea n d r e f l e c t i o nr e l a t i o n s h i pe x i s t e d ，a n dh a l fq u a n t i t yo fc e l l sw e r ed e p r e s s e di n1 0 m m o l l 3 a p o p t o s i st e s t w i t ht h ei n c r e a s eo ft h el a n t h a n u mc h l o r i d ed o s a g e ，t h ea p o p t o s i sr a t et r e n d e dt o i n c r e a s e b e s i d e st h eo o1m m o l ld o s eg r o u p t h el a n t h a n u mc h l o r i d ee x p o s u r e dt h e a p o p t o s i sr a t ei n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h t h ec o m p a r a t i v eg r o u p ( p o o1 ) 4 【c 神ic h a n g e t h ec e l l s 【c a 2 + o ft h en e u r o n si n t h el a n t h a n u me x p o s u r eg r o u pi n c r e a s e d o b v i o u s l y , t h ed i f f e r e n c ef r o mt h ec o m p a r a t i v eg r o u pw a so b v i o u s l y ( p 0 0 5 0 r0 01 ) ， a n di n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h el a n t h a n u m se x p o s u r ed o s e t h ed i f f e r e n c e a m o n g a l lt h ed o s eg r o u p sw a sa l s oo b v i o u s ( p o 0 5 0 r0 01 ) 5 c h a n g eo f t h ec o n t e n to fm i t o c h o n d r i a la n dp l a s m ac y t o c h r o m ec t h ec o n t e n to fm i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m eo fn e u r o n si na l ll a n t h a n u me x p o s u r e g r o u p sd e c r e a s e d ，t h ecc o n t e n to fp l a s m ac y t o c h r o m ei n c r e a s e d ，t h ed i f f e r e n c ew a s o b v i o u s c o m p a r e d 、析t l l t h e c o m p a r a t i v eg r o u p( p o 0 5 ) ， a n ds h o w e dt h e d o s e - r e f l e c t i o nr e l a t i o n s h i pw i t ht h ei n c r e a s eo fc h e m i c a lc o n t a m i n a t e dd o s e 6 p r o t e i ne x p r e s s i o nc h a n g eo fc a s p a s e 一3 w i t ht h ei n c r e a s eo ft h ed o s el a c l 3 ，t h ep r o c a s p a s e 一3 ( 3 2 k d ) e x p r e s s i o nd e c r e a s e d g r a d u a l l y , w h i c hi n d i c a t e dt h ea c t i v a t e dc a s p a s e - 3p r o t e i ni n c r e a s e dg r a d u a l l y , a n dt h e d i f f e r e n c ea m o n gt h eo 1 1 0 mmd o s eg r o u pa n dc o m p a r a t i v eg r o u pw a so b v i o u s ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n i t h el a n _ i b a n 啪c l l l o r i d ec a nm a k et h ec o r t i c a ln e u r o n sc a 2 + i nv i t r oc u l t u r e i n c r e a s ea n dc a u s et h ec e l l sc a l c i u md y s h o m e o s t a s i s 2 t h el a n t h a n u mc h l o r i d ec a nm a k et h ec o n t e n to ft h ec o r t i c a ln e u r o n s m i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m eci nv i t r oc u l t u r ed e c r e a s e ，c o n e n to ft h ep l a s m ac y t o c h r o m e ci n c r e a s e ，t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fp r o c a s p a s e 一3d e c r e a s e ，p o i n to u tt h ec y t o c h r o m ec b e 堍r e l e a s e di n t ot h ep l a s m ab yt h em i t o c h o n d r i a , a n da c t i v a t et h ec a p a s e 一3 3 t h el a n t h a n u mc h l o r i d ec a nd e c r e a s et h ec o r t i c a ln e u r o n sv i a b i l i t yi nv i t r o c u l t u r ea n de l i c i tt h ea p o p t o s i s 6 k e y w o r d n e u r o n s ，l a n t h a n u mc h l o r i d e ，c a l c i u m ，c y t o c h r o m ec ，c a s p a s e - 3 ，a p o rt o s i s 7 英文缩略语 英文缩写英文全称中文全称 8 论文 氯化镧对神经元的毒性作用及可能机制研究 刚吾 我国是世界上稀土储量和产量最多的国家，随着稀土元素在农业、畜牧业、 工业以及现代生物医学上的广泛使用，稀土元素不可避免地通过各种途径进入动 物和人体。因此，研究稀土元素对动物和人体生理功能的影响及其机制，探明稀 土元素的安全摄入量，已成为研究者关注的课题【l 】。 研究表明稀土具有神经毒性【2 ，3 1 ，高级神经中枢对其毒性较其他器官更敏感。 稀土矿区的流行病学调查发现，该地区儿童智商、记忆力、注意力和推理能力等 方面均明显下降【4 ，5 】，提示长期摄入稀土影响大脑功能。动物实验资料表明，稀土 可通过血脑屏障并在脑组织蓄积【6 】。镧是轻稀土元素的代表，其在脑中的蓄积性 较大，主要蓄积在大脑皮质、海马和小脑阴，并可通过影响神经细胞代谢活力8 1 ， 扰乱脑内微量元素和神经递质系统内环境稳态【9 j ，损伤海马区域结构促使细胞凋 g ：t l o l 等途径影响学习记忆。 已知细胞生命是一个复杂的生物学过程，增殖和凋亡除受控于有关基因外， 很重要的是依赖传递生死信息的细胞内信号转导系统，启动与增殖和凋亡相关的 蛋白质的表达与修饰。钙离子作为第二信使在细胞凋亡信号转导中起着重要作用 【1 1 1 。相对高浓度的c a 2 + 可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶 1 2 】，又可以作用于线粒 体影响其通透性并导致膜电位的下降【1 3 】，使得一些促凋亡物质，如细胞色素 e ( c y t o c h r o m ec ，c y tc ) 等从线粒体释放入胞浆，释放到胞浆的c y tc 在a t p d a t p 存在的条件下与凋亡相关因子1 ( a p o p t o s i si n d u c e df a c t o r - 1 ，a p a f - 1 ) 及p r o c a s p a s e - 9 结合形成凋亡小体，令c a s p a s e 9 被激活，活化的c a s p a s e 9 能进一步激活c a s p a s e 3 等其它c a s p a s e ，从而诱导细胞凋亡【1 4 】。 稀土离子与钙离子在化学性质和结构等方面都很相似，不仅可以占据钙的位 置，而且可以取代己结合的钙直接或间接地影响细胞生命过程【1 5 1 。王瑜【8 】等研究 发现，高浓度镧( 3 0 m m o l l ) 可直接升高小鼠皮层细胞的钙荧光比值，并加剧谷 9 氨酸的兴奋性神经毒性损伤。本室既往研究也证实，1 o 氯化镧饮水组大鼠子鼠 海马神经细胞内钙离子浓度升高f 1 6 1 ，海马神经元凋亡率显著增加【l o 】，学习记忆能 力下降；体外研究发现，镧可使星形胶质细胞内游离钙浓度升高，并促使c y tc 由线粒体释放入胞浆，使细胞凋亡率增加【1 7 1 。 目前镧的神经毒性机制尚不清楚，本研究对体外培养的大鼠皮层神经元进行 氯化镧染毒处理2 4 h ，观察不同剂量镧暴露对神经元存活率、细胞内游离钙离子 浓度、胞浆及线粒体细胞色素c 含量、c a s p a s e 3 蛋白表达和神经元凋亡的影响， 进而探讨镧对中枢神经系统的毒性作用机制。 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 实验动物 原代培养大脑皮层神经元，实验动物选择生后2 4 h p 勺的w i s t a r 大鼠( 清洁级) ， 由中国医科大学实验动物部提供( 动物批号：s c x k ( 辽) 2 0 0 3 - 0 0 0 9 ) ( 二) 主要设备仪器与药品试剂 l 、主要设备 光学显微镜( 1 3 3 9 5 h 2 x ) 倒置显微镜( i m f - 4 1 3 ) 摄影生物显微镜( i x 7 1 + 1 2 f l p h ) 解剖显微镜( s m z 1 6 8 1 冰箱( b c d 2 4 5 ) 双人超净工作台( b c m 一10 0 0 ) c 0 2 培养箱( h f 9 0 ) 酶标光度计( 5 5 0 ) 流式细胞仪( f a c s a r i a 2 ) 荧光双波长分光光度计( f - 4 5 0 0 ) 电子天平( c 3 2 0 0 ) 低温高速离心机( c f l5 d ) 1 0 l c i c a o l y m p u s o l y m p u s m o t i c 西门子 苏州净化 h e a lf o r c e b i o r a d b d 日立 c h o y o h i t a c h i 快速恒温数显水浴箱( h h 一4 2 ) 超声波清洁器( c x 2 5 0 ) 高压灭菌器( y x q - l s l 5 s o i i ) 2 、主要试剂 d m e m 培养基 马血清 胰蛋白酶 多聚赖氨酸( p o l y l l y s i n e ) 阿糖胞苷 肼 d m s o ( 二甲基亚砜) 兔抗大鼠n s e 抗体 即用型s a b c 免疫组化试剂盒 氯化镧( 9 9 9 9 9 ) t r i t o nx 10 0 f u r a - 2 a m a n n e x i nv f i t c + p i 凋亡检测试剂盒 w e s t e r n 细胞裂解液 b c a 蛋白浓度测定试剂盒 c y t c 标准品 c a s p a s e - 3 抗体 9 - a 池抗体 山羊抗兔二抗 连二亚硫酸钠 c a c l 2 ( 分析纯) n a h c 0 3 ( 分析纯) n a h 2 p 0 4 ( 分析纯) k 2 h p 0 4 ( 分析纯) 常州国华 北京医用设备 上海博讯 h y c l o n e g i b c o s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a 武汉博士德 武汉博士德 s i g m a 华美 日本同仁 北京宝赛 碧云天生物 碧云天生物 s i g m a s a n t ac r u z s a n t ac r u z 北京中杉金桥 广东光华化学厂有限公司 沈阳试剂一厂 沈阳试剂一厂 沈阳试剂一厂 沈阳试剂一厂 遍，而后蒸馏水冲洗3 遍，晾干，1 2 0 。c 、2 0 m i n 高压蒸汽灭菌后取出，放置无菌 室备用。 ( 二) 实验分组 根据l a c l 3 浓度分为四组，分别为0 o l ，0 1 ，1 0 ，2 0 m m o l l ，用无血清d m e m 作为对照组，无血清d m e m 配制l a c l 3 。 ( 三) 神经元体外培养 参照邵延坤等【1 8 】的方法，并加以改进。取出生后2 4 h 内的w i s t a r 大鼠，7 5 酒 精中浸泡消毒数秒，超净工作台内取脑，置于装有1 0 马血清d m e m 的玻璃平皿 中，而后解剖显微镜下剥离脑膜和血管，取两侧大脑皮质，置于另一装有1 0 马 血清d m e m 的平皿中。吸弃培养液，将脑组织剪碎，加入0 1 2 5 胰酶转至离心管 中，3 7 1 2 水浴消化2 0 m i n ，加入等体积2 0 马血清d m e m 终止消化，1 0 0 0 r p m 离心 8 m i n ，弃上清，加入2 0 马血清d m e m ，吸管吹打数次，将细胞悬液经2 0 0 目筛网 过滤，细胞计数板计数细胞密度，调整至1 x 1 0 6 1 1 1 1 ，而后接种于b d 培养皿中，放 置3 7 ( 2 、5 c 0 2 培养箱中培养。培养4 8h 后加入阿糖胞苷( 终浓度为1 0 i _ t m o l l ) 以抑制非神经元的生长，作用2 4h 后全量换液1 0 马血清d m e m ，而后每2 d 换液一 次。培养至第7 d 加氯化镧，作用2 4 h 后进行指标测定。 ( 四) 神经元的纯度鉴定 将细胞接种于铺有盖玻片的6 孔板中，接种前3 h 每孔加入1 5 m l 多聚赖氨酸， 接种前吸弃。培养细胞长至8 0 融合，约第6 d 进行免疫组化实验。吸弃培养液， 1 2 0 0 1 m o l l p b s 洗2 次；4 c 预冷的4 多聚甲醛中固定3 0 m i n ，而后p b s 漂洗2 m i n x 3 次。o 3 甲醇过氧化氢溶液中作用3 0 m i 玛以消除内源性过氧化物酶的影响，而后 p b s 漂洗2 m i n x 3 次。滴加山羊血清封闭液，室温作用4 0 m i n ，以封闭抗体的非特异 性结合位点。吸弃封闭液，滴加1 ：5 0 0 兔抗大鼠n s e 多克隆抗体( 武汉博士德) ，4 c 过夜。次日取出，p b s 漂洗2 m i n x 3 次，加入二抗( 1 ：4 0 0 稀释) ，3 7 孵育1 h ，而 后p b s 漂洗2 m i n x 3 次。加入a b c 复合物，3 7 孵育l h ，p b s 漂洗2 m i n x 3 次。d a b 显色试剂盒3 7 显色。系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 免疫阳性细胞胞浆呈黄褐色，显微镜下每张盖玻片计数1 0 个视野，计数4 张玻 片，计算神经元阳性百分比。 ( 五) 指标检测 l 、神经元存活率检测 m t t 法：调整细胞悬液密度为l x l 0 5 个m l ，1 0 0 “l 每孔接种于9 6 孔板，培 养至第7d ，吸弃培养液，加入氯化镧，终浓度分别为0 ，0 0 1 ，o 1 ，1 0 ，2 0m m o l l ， 培养2 4h 。氯化镧作用结束前4 h ，每孔中加入5 m g m lm t t2 0 i t l ，继续培养4 h ， 吸弃培养液，每孔加入1 5 0 l t ld m s o ，室温条件下震荡培养板1 5 r a i n 。应用酶标仪 测定波长5 7 0 n m 处的光密度( o d ) 值，并通过与对照组o d 值的比较得到实验组的 细胞存活率。做3 次重复实验。 存活率( ) = ( o d 实验组o d 对照组) 1 0 0 2 、a n n e x i nv f i t c + p i 细胞凋亡坏死检测 氯化镧处理结束后，弃掉培养液，p b s 洗2 遍，0 2 5 胰酶消化收集细胞，加 入p b s 制成单细胞悬液，将细胞密度调整为l x l 0 6 个m l ，4 c 、1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ， 以预冷的p b s 洗涤细胞2 次，重悬于预冷的3 0 0 i t lb i n d i n gb u f f e r 中，避光加入1 0 i a l a n n e x i n v f i t c ，室温避光放置，1 0r a i n 后加入5 “lp i ( 碘化丙啶) ，室温5 m i n 后每管加入2 0 0 i - t lb i n d i n gb u f f e r 。流式细胞仪上样检测。 3 、细胞内游离钙的测定 细胞经氯化镧处理2 4 h 后，吸弃培养液，p b s 洗2 次，经胰酶消化终止后， 制成单细胞悬液，调整细胞密度为1 x 1 0 6 个m l 。1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清， d h a n k s 液将细胞定容至l m l ，经台盼蓝排斥实验检测细胞存活率达9 5 以上。 1 3 f u r a - 2 a m 负载( 5 9 l m l ，终浓度2 r t m o l l ) ，避光，3 7 c 振荡水浴4 5 m i n ，1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清，d h a n k s 液洗2 次后，定容细胞悬液至l m l ，室温放置2 0 m i n 。 日立f - 4 5 0 0 荧光光度计测定细胞内游离钙。 计算公式：t c a 2 7 i ( n m o l l ) = k d ( f f m i n ) ( f m a x - - f ) 式中， c a 2 + i 代表胞内游离钙离子浓度；尉是f u r a - 2 c a 2 + 的解离常数，为 2 2 4 n m o l l ：f 为f 3 4 0 f 3 8 0 的荧光比值；f m i n 为加入e d t a 后测得的荧光强度； f m a x 为加入t r i t o n x 1 0 0 后测得的荧光强度。 4 、胞浆和线粒体中细胞色素c 含量测定 氯化镧处理结束后，p b s 洗3 次，胰酶消化收集细胞，而后按细胞线粒体分 离提取试剂盒( 碧云天) 说明操作，分离提取线粒体和胞浆。b c a 蛋白定量试剂 盒( 碧云天) 测定蛋白浓度。 标准曲线测定：取l m lc y tc 标准品( 8 0 m g m 1 ) 用水稀释至2 5 m l ，取0 2 m l ， 0 4 m l ，0 6 m l ，o 8 m l ，1 0 m 1 分别加蒸馏水至4 m l ，每管加等量少许连二亚硫酸钠， 振摇后，于5 2 0 n m 处测吸光度( a ) 值，以双蒸水作为空白对照，绘制标准曲线。 样品测定：取0 5 m l 待测样品，用水稀释至4 m l ，加入少许连二亚硫酸钠，振 摇后，在5 2 0 n m 处测量吸光度值，由标准曲线计算其浓度。 5 、c a s p a s e 3 活性测定 ( 1 ) 蛋白的提取细胞经氯化镧处理2 4 h 后，预冷p b s 洗2 次，经胰酶消 化收集细胞，加入1 0 0 9 l 预冷的细胞裂解液，冰上裂解3 0 m i n ，超声破碎细胞，4 。c ， 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，上清即为总蛋白， ( 2 ) b c a 试剂盒测定蛋白浓度以最低浓度的样品为基础，把样品调成相 同浓度，分装，- - 2 0 保存。 ( 3 ) 电泳分别取约3 0 1 x g 蛋白样品，按4 ：1 加入l o a d i n gb u f f e r ，沸水煮 5 m i n 。 洗板，用蒸馏水冲干净，并将其固定在支架上； 配分离胶：8 分离胶( 2 0 m 1 ) ； 灌分离胶，切勿产生气泡，然后补水至板上沿； 配4 浓缩胶( 1 0 m 1 ) ，待分离胶凝后加浓缩胶； 1 4 加完浓缩胶后立即插梳子，切勿产生气泡； 胶凝后将胶板移入电泳槽，拔下梳子。内槽倒满电极液，外槽倒1 3 ； 在梳井内加样2 0 t l ； 电泳0 0 0 v ，4 0 r n a ) ； 待样品跑到胶的下沿时，停止电泳； 切胶。 ( 4 ) 转膜 取两张滤纸，一张做上层滤纸，一张做下层； 剪跟胶同样大小的硝酸纤维素薄膜，用t r a n s f e rb u f f e r 浸泡1 0 r a i n ； 做成三明治形状( 膜在正极，胶在负极) ； 转膜( 5 0 v ，2 h ) ； t b s 浸泡1 0 m i n ，封闭( 含5 脱脂奶粉的t b s ) l h 。t b s 洗5 m i n ，2 次； ( 5 ) 抗原抗体反应 加i 抗4 c 过夜( 1 ：1 0 0 ) ，t t b s 洗5 r n i n ，2 次； 加i i 抗2 h ( 1 ：1 0 0 0 ) ，t t b s 洗5 m i n ，2 次； t b s 洗5 m i n 。 ( 6 ) 化学发光，显影，定影 ( 7 ) 拍照，应用s c i o ni m a g e 图像软件分析条带的灰度值 ( 六) 统计学处理 采用s p s s l l 5 软件做统计分析，各项指标的变化均进行组间比较，各项检测 结果以x + s 表示。数据进行正态性检验，组间比较采用单因素方差分析( a n o v a ) ， p 0 0 5 为具有统计学意义。 结果 一、神经元形态及免疫组化纯度鉴定 倒置相差显微镜观察，培养7 d 时，神经元胞体饱满，周围有明亮光晕，突起 有1 个至多个，粗细长短不等，且相互接触交织成网状，形成神经网络( 见图1 ) 。 神经元的鉴定结果( 见图2 ) 。绝大部分细胞的胞浆被染成黄褐色，为神经元特 异性烯醇化酶( n s e ) 与抗体结合着色形成。显微镜下观察并计数n s e 阳性细胞，经 15 计算n s e 阳性率大于9 0 ，故而可以将此原代培养细胞作为大鼠皮层神经元的体 外模型。 图1 ，原代培养神经元形态( 2 0 0 x ) 二、神经元存活