（动物学专业论文）川金丝猴（rhinopithecus+roxellanae）种群遗传结构和分子系统地理学初步研究.pdf

独创性声明 y6 2 3 9 2 0 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 内容以外，本论文不包含其他人已发表或撰写的研究成果，也不包含 为获得酉j 匕太堂或其他教育机构的学位和证书而使用过的材料。与 我一起工作过的同志对本研究所做的贡献已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名：复凄! 熬留 签名日期：纽年月么日 两北大学硕十论文 中文摘要 川金丝猴为我国所特有的灵长类动物，它隶属于灵长目( p r i m a t e s ) 猴科 ( c e r c o p i t h e c i d a e ) 仰鼻猴属( r h i n o p i t h e c u s ) 。作为一种树栖动物，其栖息地与森林植 被有密切的关系。但由于人类对森林的砍伐和过度开发以及其他原因，川金丝猴过 去连成大片的分布格局被分割缩小，形成现在这种不连续的岛状分布格局，整个川 金丝猴的个体数量也急剧下降。为了采取有效的保护措施，有必要从遗传学的角度 来探讨它的种群结构，遗传多样性以及种群的演变历史和影响因素。但是目前关于 川金丝猴的保护生物学研究主要集中在对其生态环境的研究方面，相关的保护遗传 学方面的研究还很少。因此我们利用分子生物学技术探讨了川金丝猴的种群遗传结 构及其分布格局形成的历史。 本研究以变异速率比较快的线粒体控制区作为遗传标记，比较了来自四川、甘 肃、陕西和湖北神农架等地6 0 个个体的序列差异，发现1 2 种单倍型，其变异位点 占整个碱基数的1 4 2 。整个群体的核苷酸多样性为o 0 3 3 ，比大熊猫的核苷酸多样 性( 0 0 6 ) 还低。这种贫乏的遗传多样性说明川金丝猴可能在历史上经历过严重的 瓶颈效应。通过不同方法构建的系统发育树也证明了这一点。最小跨度树直观的显 示出现生的川金丝猴有可能是由经历瓶颈效应后幸存于岷山山系的群体扩散而来， 但这还需要进一步的验证。单倍型的地理分布特点和a m o v a 分析结果表明川金丝 猴的不同地理种群之间存在极其显著的分化，这可能是由于长期地理隔离阻碍了基 因交流所致。 在川金丝猴的保护生物学方面，本研究依据单倍型的地理分布和地理种群之间 的分化水平提出湖北地理种群、陕西地理种群以及四川和甘肃地理种群都应当作为 独立的管理单元分别加以保护。 关键词：川金丝猴，种群遗传结构，分子系统地理学，线粒体控制区，核苷酸多态性，单倍 型。 两北大学硕十沧文 p r i m e r g e n e t i cs t r u c t u r ea n dm o l e c u l a r p h y l o g e o g r a p h y o fs i c h u a n s n u b - n o s e d m o n k e y ( r h i n o p i t h e c u sr o x e l l a n a e ) a b s t r a c t s i c h u a ns n u b n o s e dm o n k e y ( r h i n o p i t h e c u sr o x e l 缸n a e ) i se n d e m i ct oc h i n a a sa r e s u l to fs p e n d i n gm o s to ft h e i rt i m e s0 1 1t r e e s ，t h e i rh a b i t a ti sc l o s e l yb o u n du pw i t h f o r e s t b u tt h eh u m a n sa c t i o ns u c ha s d e f o r e s t i n ga n dc a p t u r ee t cs p l i tt h e i rh a b i t a t g r e a t l y s n u b - n o s e dg o l d e nm o n k e yc u r r e n t l yt h r e a t e n e db yh a b i t a tl o s s ，f r a g m e n t a t i o n a n dh u m a np e r s e c u t i o n i no r d e rt od e v i s e e f f i c i e n c y c o n s e r v a t i o na n dm a n a g e m e n t s t r a t e 百e sf o rt h i se n d a n g e r e ds p e c i e s ，i ti sn e c e s s a r yt ou n d e m t a n d t h eg e n e t i cs t r u c t u r e a n dm o l e c u l a r p h y l o g e o g r a p h y i nt h i s i n v e s t i g a t i o n m i t o c h o n d r i ad n ac o n t r o l r e g i o ns e q u e n c e s w e r eu s e dt o e s t i m a t e p h y l o g e o g r a p h yp a t t e r n s ( h i s t o r i c a lp a t t e r n su n d e r l y i n g c o n t e m p o r a r y d i s t r i b u t i o n ) a n d t h e g e n e t i cs t r u c t u r e s i x t y a n i m a l sf r o md i f f e r e n t r e g i o n s w e r e s e q u e n c e do v e r3 7 9 b p o fm t d n a ，r e s u l t i n g1 2h a p l o t y p e s a c c o r d i n gt ot h en u c l e o t i d e d i v e r g e n c e ( o 0 3 3 ) w h i c h i sl o w e rt h a nt h a to fp a n d a ( 0 0 6 ) a n dt h e t o p o l o g y o f p h y l o g e n e t i ct r e e s ，w ec a l ld r a wac o n c l u s i o nt h a ts n u b - n o s e dg o l d e nm o n k e y m u s th a v e s u f f e r e dab o t t l en e c k ，w h i c hi sc o r r e s p o n dt ot h er e s u l to fp r o t e i ne l e c t r o p h o r e s i sm a d e b yl ih a i p e n ge t a 1 t h em i n i m u ms p a n n i n gt r e ei n d i c a t e sa tl e a s ti np a r tt h a tt h e c o m m o na n c e s t o ro fs n u b n o s e dg o l d e nm o n k e yl i v i n gt o d a ym i g h tl i v ei nt h em i n s h a n m o u n t a i nd u r i n gt h eb o t t l e n e c k a m o v as h o w st h e r ea r es i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a t i o n a m o n gr e g i o n sr e s u l t e df r o mt h ec l e a rg e n e t i cb r e a k ，t h a ti sw h y w es h o u l dc o n s i d e rt h e t h r e eg e o g r a p h i cu n i t sa st h r e es e p a r a t em a n a g e m e n tu n i t s k e yw o r d ss i c h u a ns n u b n o s e dm o n k e y ( r h i n o p i t h e c u sr o x e l 肠n a e ) ，g e n e t i cs t r u c t u r e m o l e c u l a rp h y l o g e o g r a p h y ，m i t o c h o n d r i ad n a c o n t r o lr e g i o n ，n u c l e o t i d ed i v e r g e n c e 2 明北大学坝十沦文 1 研究背景 生物多样性的存在维持了生物群落及生态系统的稳定性，也是人类获得新知识 的源泉( 潘文石等，2 0 0 1 ) 。但由于人类经济活动的加剧，盲目利用自然资源，大 面积砍伐森林、延伸农业耕地，严重的毁坏了自然资源和生态系统的平衡，导致许 多野生动物受到不同程度的胁迫。以大熊猫似i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) 川金丝猴 ( r h i n o p i t h e c u sr o x e l l a n a e ) 等为代表的多种珍稀濒危野生动物生活在岛状生境内， 由于种群隔离、基因交流中断以及严重的近亲繁殖等原因，物种处于严重的濒危境 地( 李明等，2 0 0 0 ) 。因此最大限度的保护环境，保护野生动物是我们人类所面临 的共同任务。保护生物学也因此应运而生。它的研究目的有两个：第一是研究人类 对生物多样性的影响；其次是研究防止物种灭绝的有效途径( s o u l e ， 1 9 8 5 ，1 9 8 6 ；w i l s o n ，1 9 9 2 ) 。随着保护生物学和分子遗传学的不断发展、渗透，最终 形成了保护遗传学，至2 0 世纪8 0 年代后期保护遗传学已经成为具有很强理论框架 的一个重要的新兴学科( 李明等，2 0 0 0 ) 并成为保护生物学研究的一个核心部分 ( s m i t ha n dw a y n e ，1 9 9 6 ) 。其主要研究目标是遗传多样性的保护和保持进化潜力 ( a v i s e ，1 9 9 4 ) 。 由于种种原因，我国所特有的物种川金丝猴在近四百年来种群数量和分布区域 大大减少，并产生群体问的隔离( 何业恒和张伟然，1 9 9 2 ；l i a n dp a n ，2 0 0 2 ) 。因此川 金丝猴的保护受到我国政府的高度重视，并且取得一定的成绩。但是由于对川金丝 猴的生物学研究集中在生理、生态和分类学方面( 胡锦矗等，1 9 8 0 ；彭燕章等，1 9 8 3 ； 叶智彰等，1 9 8 7 ；陈服官等，1 9 8 9 a ；刘诗峰，1 9 8 9 ：罗时有等，1 9 8 9 ；彭燕章，1 9 9 4 ； 戚汉君等，1 9 9 5 ；王应祥和蒋学龙，1 9 9 5 ) 。而在对保护工作起重要指导作用的保护 遗传学方面，人们的认识还很不够，还需要进行更深入的研究。 1 1 川金丝猴( r h i n o p i t h e c u sr o x e h a n a e ) 研究概述 1 _ 1 1 川金丝猴简介 川金丝猴，隶属于灵长目( p r i m a t e s ) 猴科( c e r c o 鲫h e c i d a e ) 疣猴亚科( c o l o b i n a e ) 仰鼻猴属( r h i n o p i t h e c u s l ( 叶智彰等，1 9 8 7 ：陈服官等，1 9 8 9 b ； 彭燕章等，1 9 8 9 ； 两北凡学硕十论文 张亚平和r y d e r ，1 9 9 5 ；w a n g ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。其鉴别特征为吻部膨大而突出，鼻孔 上仰，脸部天蓝色，成年猴体背及肩有金黄色长毛，尤以雄猴最为显著( 刘诗峰， 1 9 8 9 ) 。与滇金丝猴和黔金丝猴相比，川金丝猴食性很杂，除采食植物的叶芽、枝皮 和果实外，偶尔还捕食幼鸟、鸟卵或昆虫，并且食物种类具有季节的性变化( 胡锦 矗等，1 9 8 0 ；李贵辉和史东仇，1 9 8 9 ；史东仇等，1 9 8 9 ) 。 图1 1 仰鼻猴属分布图 f i 9 1 1d i s t r i b u t i o no fr h i n o p i t h e c u s 川金丝猴主要在树上活动，几乎很少下地( 胡锦矗等，1 9 8 0 ) 。由于人类对森林 的砍伐和过度开发以及其他原因，川金丝猴过去连成大片的栖息地发生严重的破碎 化，目前仅分布于几个相互隔离的地区( 图1 1 ) 。作为一种珍稀的野生动物，川金 丝猴已被列为国家1 级保护动物；在濒危野生动植物国际贸易公约( c i t e s ) 中列 为附录1 ，严格禁止买卖。 1 1 2 川金丝猴的数量分布和保护遗传学研究现状 关7 ：) 1 1 金丝猴的研究j ：作除野外调查外，还涉及川金丝猴的形态解剖学、生理 学、遗传学、分类学和生态学等各个方面。这些研究对川金丝猴的保护工作起到了 很好的指导作用。以下将简单介绍川金丝猴目前的地理分布与种群数量以及保护遗 传学自面的形f 究现状。 叫北夫学顾十：论文 1 川金丝猴地理分布与种群数量 了解金丝猴的种群与数量分布是对其进行生物保护的基础，因而广泛受到重视。 对川金丝猴的野外调查始于5 0 年代末和8 0 年代初至今。通过这些工作，查清了川i 金丝猴的地理分布范围和大致的种群数量，并在行为生态学研究方面取得了大量的 第一手基本资料( 彭燕章，1 9 9 4 ) 。 从调查结果来看，川金丝猴分布在四川的邛崃山和岷山，并延伸到甘肃南部， 也分布在陕西秦岭山脉及湖北神农架等地。目前的数量估计为2 5 0 0 0 只左右( 李晓 鸿，1 9 9 5 ；刘诗峰和高云芳等，1 9 9 5 ；张荣祖等，2 0 0 2 ；全国强，2 0 0 2 ) 。其具体分 布如下： ( 1 ) 四川和甘肃：据估计在四川和甘肃的川金丝猴总数约有2 0 0 0 0 只，分 布区包括了四w i n 甘肃的3 0 多个县，具体分布如下： 四川省：都江堰、彭州、崇州、绵竹、平武、北川、安县、青川、马边、 美姑、芦山、天全、宝兴、九寨沟、汶川、黑水、松潘、茂县、巫山、泸定、洪雅、 雷波、南坪、康定、汉原、什邡、理县、大邑、红原、得荣等。 甘肃省：文县、康县、武都等。 ( 2 ) 陕西：统计有4 0 群约4 2 0 0 只左右，分布在周至、宁陕、宁强、洋县、 太白和佛坪五县 ( 3 ) 湖北：有5 群约1 0 0 0 只，分布在房县、兴山和巴东等三个县的林区。 根据历史文献推断：川金丝猴的分布在历史上曾连续成片，地理种群之间产生 隔离的历史不早于清代后期，这种变化产生的原因是激增的人口对山区的开发，使 金丝猴丧失了必要的栖息环境( 何业恒和张伟然，1 9 9 2 ；l i a n dp a n ，2 0 0 2 ) 2 种内分化和保护遗传学研究 在仰鼻猴属中，川金丝猴是分布最广泛的一个种，而且大部分种群之间已经呈 现出相互隔离状态。然而关于川金丝猴种内差异的研究却并不多。w a n g 等( 1 9 9 8 ) 等通过分析来自四川i 、甘肃、陕西和湖北的川金丝猴标本，发现在川金丝猴种群 中存在着不同的地理差异，因而认为在川金丝猴中存在三个亚种即分布于四川和 肃的指名亚种厅r o x e l l a n a er o x e l l a n a e 、分布于神农架的湖北旺种片 ，即，a 月a ph u b p i e n s i s 和分布于陕西秦岭的秦岭亚种斤，1 0 x c a n a e 5 两北大学坝十论文 q i n i n g e n s i s 。在现代分类学中，鉴别分类单元的个主要标准是依据系统进化 关系( c r o n i n ，1 9 9 3 ) 。但是形态特征可能并不反应系统进化关系，而且环境因子 可能会对形态特征有较大的影响( s t m h s a k e ra n dl e l a n d ，1 9 8 7 ；k i r k p a t r i c k 1 9 9 5 ) 。 l i 等( 2 0 0 1 ) 通过比较细胞色素b 序列的差异，从d n a 序列水平上来分析川金丝 猴种内是否存在亚种分化问题。结果发现四川种群细胞色素b 的序列与甘肃种群 的完全一致；但四川甘肃种群与陕西种群和神农架种群间的细胞色素b 序列差异 仅为o 0 0 2 ( 1 4 0 2b p ) ，远远低于金丝猴的种问差异水平0 0 2 4 ( 6 2 5 3b p ) ，同时也 远远低于滇金丝猴的种内差异水平和o 0 3 ( 1 2 4 0 2 ) 。因此从d n a 序列水平的分析 结果来看，川金丝猴种内还未产生达到亚种的分化，即认为川金丝猴仍为一单型 种( l i ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 川金丝猴保护遗传学的研究目前并不多见。l i ( 2 0 0 3 ) ： l j 用同功酶电泳技术分析 了来自四川、甘肃、陕西秦岭和湖北神农架的3 2 只个体4 4 个遗传位点的遗传多样 性。出乎意料的发现在这3 2 只个体的4 4 个遗传座位中，没有发现一个多态位点， 其平均杂合度( h ) 为0 ，多态座位所占的比例( p ) 为0 。川金丝猴的平均杂合度 甚至比大熊猫的平均杂合度( h = o 0 0 8 ) j 丕f 氐。通过多种非人灵长类平均杂合度的比较 发现，川金丝猴是其中遗传多样性程度最低的( 李海鹏等，1 9 9 8 ；l i ，e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。李 明从d n a 水平研究了神农架地区的川金丝猴遗传多样性。通过r a p d 数据的分析 发现神农架的川金丝猴种群遗传多样性水平极低( 全国强，2 0 0 2 ) 。 从研究的现状来看关于川金丝猴遗传多样性的研究还很不够，李海鹏( 李海鹏 等，1 9 9 8 ；l i ，e ta 1 ，2 0 0 3 ) 和李明( 全国强，2 0 0 2 ) 的研究证明川金丝猴的遗传多 样性程度很低，但利用同功酶电泳进行的研究未能比较三个不同地理种群之间和内 部遗传多样性的相对高低和分化。因此还需从d n a 序列的水平进行遗传多样性的 研究。关于川金丝猴目前分布形成的原因和过程主要是依据化石和文献记录( p a n a n dj a b l o n s k i ，1 9 8 7 ；何业恒和张伟然，1 9 9 2 ；潘悦容，1 9 9 5 ；j a b l o n s k i ，1 9 9 8 ；l ia n d p a n ，2 0 0 2 ) 进行推断，还需要从其他的角度进行补充和验证。 1 2 遗传多样性 1 2 1 遗传多样性简介 6 两北大学硕 。沦文 遗传多样性是生物多样性地重要组成部分( 施立明等1 9 9 3 ) 。世界资源研究所 ( w r i ) 等( 1 9 9 2 ) 在全球生物多样性策略中明确定义“遗传多样性是指种内 基因的变化，包括同种显著不同的群体问或同一群体内的遗传变异”( 葛颂，1 9 9 7 ) 。 遗传多样性的根本来源在于遗传物质的改变，比如核苷酸的替代、插入、缺失、 基因转换和等位基因间的重组等( n e i ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。遗传多样性起因于d n a 分子 水平，但遗传多样性不仅表现在d n a 分子水平，而且可以在细胞、器官、生理代 谢以及形态学水平上表现出来( m u r r a y a n dc l a r k e ，1 9 6 8 ；m o u s s e a na n dr o i f , 1 9 8 7 ) 。 人们对遗传多样性的检测最初是从形态学上开始的。定量估计遗传变异则是在 2 0 世纪6 0 年代当蛋白质电泳被引入群体遗传学研究后才成为可能。进入8 0 年代， 限制酶内切技术和d n a 直接测序引发了对d n a 多态性的研究( 葛颂，1 9 9 7 ；n e i ，e t a 1 ，2 0 0 0 ) 。 目前分子水平上检测遗传多样性的方法很多，包括等位酶( a l l o z y m e ) 分析、 限制性片段长度多态性( r f l p ) 分析、随机扩增多态d n a ( r a p d ) 分析、微卫星 位点分析、d n a 序列分析和s n p 位点分析等( g i s e l ，1 9 9 7 ；胡志昂和张亚平，1 9 9 7 ； r o m a n o va n dw e i g e n d ，2 0 0 1 ；r i c h a r d ，e ta 1 ，2 0 0 2 ；p h i l l i p ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。等位酶分析 所检测的位点都是编码酶蛋白的结构基因位点，r f l p 和r a p d 分别检测限制性酶 切片段位点和随机引物的结合位点。序列分析是检测d n a 序列变异最根本及最准 确的方法，但目前在群体遗传和进化生物学的研究中，基本上是针对基因组中某些 片段进行的，如生物核基因组中的核糖体d n a ( r d n a ) 片断、动物线粒体d n a ( m t d n a ) 和植物叶绿体d n a ( c p d n a ) 中的特定片段等( r i c h a r d ，e t a 1 ，2 0 0 2 ) 。 就目前技术而言，除对一些模式生物外，进行d n a 全序列分析还有困难，尤其在 对大量个体( 样本) 的遗传多样性检测方面，全序列分析在可预见的将来都是不现 实的( 葛颂，1 9 9 7 ) 。 d n a 多态性的范围可以用多种不同的方法来度量，但最常用的还是每个核苷酸 序列的分离位点数目和核苷酸多样性( 或核苷酸水平的杂合度) ( n e i ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 在组序列中，任何有两种或更多种核苷酸的位点被称为分离位点。每个核苷酸座 位的分离位点数目( p s ) 为p s = s n ，s 表示组数据中所有分离位点数目，n 为所研 究的所有核符酸数目。s 和p s 与样本的大小有关，当m 增人时，它们也增大。而 两北大学硕十沦文 个不依赖样本大小的d n a 多态性的测度是核苷酸多样性( 玎) 。其定义式为 这里，q 是等位基因( 不同的等位基因序列) 的总数，x 。是第z 个等位基因的 群体频率，口口是第z 个和第，个等位基因之间平均每个核苷酸位点的差异数或替 代数( k i m u r a ，1 9 6 8 ) 。 在保护遗传学中，只有掌握物种多样性水平高低及其群体的遗传结构，才能制 定有效的保护策略和措施。例如对一个遗传变异主要存在于群体之内的物种( 如大 多数风媒异花受粉的裸子植物) 和一个遗传变异主要分布于群体之间的物种( 如许 多白花受粉的一年生草本植物) 应具有完全不同的取样和保护方针。在濒危物种， 特别是高度特化的单型种，血n j l l 金丝猴( l i ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 的研究和保护中，我们必 须充分重视物种的遗传多样性和群体遗传结构( 葛颂，1 9 9 7 ；m e f f ea n dc a r o l l ，1 9 9 7 ； r i c h a r d ，e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 非损伤性取样及在保护遗传学研究中地位 在野生动物的保护遗传学研究中，常用的取样方法有三种，即伤害性取样 ( d e s t u c t i v es a m p l i n g ) 、非伤害性取样( n o n d e s t r u c t i v es a m p l i n g ) 和非损伤性取样 ( n o n i n v a s i v es a m p l i n g ) ( t a b e r l e t ，e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。伤害性取样就是通过杀死动物而获得 新鲜的肌肉、肝脏和血液等组织样品。这种取样方法对珍稀濒危动物而言既不科学 也不现实。非伤害性取样是通过捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、尾或 趾等分析样品。虽然该方法不至于导致动物死亡，但对动物特别是珍稀濒危动物均 会或多或少地造成伤害( t a b e r l e t ，e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。所谓非损伤性取样法，就是在不触及 或伤害动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发、粪便、尿液、食物残渣( 含有口腔 脱落细胞) 、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的分析样品而进行遗传分析的一种取样方 法( m o r i na n dw o o d r u f f , 1 9 9 61 。其步骤包括：1 ) 收集实验材料； 2 ) 微量d n a 提 取；3 ) p c r ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) 扩增反应；4 ) d n a 多念性分析( 吴春花等， 1 9 9 7 ) 。d n a 非损伤性技术的建立使从濒危野生动物群体中获得夫量遗传学数据成 蹦 x 忒二。 = 万 两北大学硕士沦文 为可能，从而能更真实地反映各类物种的遗传背景，为保护策略的制定提供重要的 遗传学资料和依据，同时，也使科研同保护的观念相一致，即不再因研究需要而伤 害研究对象( 宿兵等，1 9 9 5 ) 。正因为该方法对动物无伤害，使其在保护遗传学研 究中具有极其广泛的应用( 李明等，2 0 0 1 ) 。 1 3 分子系统地理学简介 系统地理学( p h y l o g e o g r a p h y ) 是研究物种及物种内不同种群形成现有分布格 局的历史原因和演化过程的- f l 学科。作为生物地理学的个分支，系统地理学已 不局限于解释现有种群的分布状况，而且进一步探究其分布的起因，阐述其进化历 程，从而重建生物区系的历史( a r i s ea n dh a m r i c k ，1 9 9 6 ；a v i s e ，1 9 9 8 ) 。随着系统地 理学研究方法上的拓展和分子生物学实验技术的渗透，出现了新的交叉学科分 子系统地理学( m o l e c u l a rp h y l o g e o g r a p h y ) 分子系统地理学主要采用分子生物学技 术，在分子水平上探讨种内的系统地理格局的形成机制。它涉及分子遗传学、种群 遗传学、系统发育学、统计学、行为学、古地理学和历史生物地理学等学科内容。 分子系统地理学主要探讨种群分化的历史，研究这些种群现有分布格局形成 的原因，如是否是因为曾经经历过气候变化、地壳运动等历史事件的影响，逐渐经 过迁移和扩散、集群、甚至灭绝等过程而形成的。虽然历史生物地理学( h i s t o r i c a l b i o g e o g r a p h y l 的有关理论可以解释种群分布格局形成的历史因素( m o r r o n e ，j j ， 1 9 9 5 ) ，但是这仅局限于种或种上水平并没有在种内水平上探讨种群的发展历史而 分子系统地理学则从种内水平上描述种群的系统地理格局，进而追溯其形成原因 分子系统地理学在研究种间或种内不同等位基因的特定地理分布格局特点过程 中，同时考虑他们的系统发育关系( b e r m i n h a m ，e ta 1 ，1 9 7 2 ；n e w t o n ，1 9 9 9 ) 。分子 系统地理学分析对认识群体的分化、新种的形成、生态适应和过去的气候变化具有 重要意义( a f r i c a ，e ta 1 ，2 0 0 0 ；a v i s e ，2 0 0 0 ) 。随着现代生物学各分支学科的交叉， 分子系统地理学在保护生物学中也得到定的应用( b e r n a t c h e z a n dw i l s o n ，1 9 9 8 ；王 静等，2 0 0 1 ) 。比如，分子系统地理学通过研究物种遗传多样性的空间分布，估计 某区域特 i f 多样性水平，评价物种以及其所占有分布领域的保护学价值，从而为 保护“二物学提供了个有效的研究手段：此外，还可根据比较系统地理学 两北大学硕十论文 ( c o m p a r a t i v ep h y l o g e o g r a p h y ) 的原理对同域种种问系统地理模式加以比较，确定出 一一定的地理区域，在这些区域内，所有的群落都由于发生过替代( v i c a r i a n c e ) ，经历 了独立的进化历程( a v i s e ，1 9 9 2 ) ，这些独立进化的群落很有可能包含丰富的特征多样 性。比较系统地理学的研究还将在单个种内确定进化显著性单元( e s ue v o l u t i o n a r i l y s i g n f i c a n tu n i t s ) 拓展到在多个种内确定( m o r i t z ，1 9 9 4 ) ，还可根据遗传多样性的空间分 布估计物种生物多样性的水平，进而为制定合理的保护计划奠定基础。 1 4 嵌套式p c r ( n e s t e dp c r ) 简介 嵌套式p c r 是采用靶序列外引物( 远端) 和内引物( 近端) 先后进行二轮p c r 扩 增。首先在常规条件一f 用跨越目的d n a 片断的外引物扩增，接着对一部分反应物 一产物混合物进行第二轮p c r 扩增，所用的引物与第一对引物内侧的序列配对，在 这一轮扩增中，只有真正的产物被扩增( 迪芬巴赫和德维克斯勒，1 9 9 8 ) 。 嵌套式p c r 极端敏感，在1 0 6 基因组d n a 背景中可以检测到一个拷贝的病 毒基因( 迪芬巴赫和德维克斯勒，1 9 9 8 ) 。敏感性实验表明：嵌套式p c r 比单一p c r 敏感约5 0 0 倍( 金庆文和侯熙德，1 9 9 7 ) 。李昕权和杨爱德( 1 9 9 6 ) 认为由于第一轮 p c r 产物是较小片段的d n a ，较整个基因组d n a 更容易变性，使第二轮p c r 的 内引物更容易与之结合，因而具较高敏感性。在常规条件下，用一套引物进行扩增， 产物中会有一些错误的扩增产物，这些错误的扩增产物会与引物中的一条或两条配 对，但其内部却是无关序列。在嵌套式p c r 中，虽然第一轮扩增有可能产生这种错 误的扩增产物，但其内部却是无关序列，因而与内引物杂交的可能性极低，从而提 高了扩增特异性( 金庆文和侯熙德，1 9 9 7 ：吴乃虎，1 9 9 8 ) 。因而，嵌套式p c r 较常 规p c r 具有更高的敏感性和特异性( 易萍和李力，2 0 0 2 ) 。 1 5 本研究的目的意义及设想 综上所述，目前川金丝猴保护生物学研究中存在明显的不足。首先是对川金丝 猴的种群遗传结构了解的还不够深入，表现在对川金丝猴各地理种群之间及其内 部的遗传结构还不清楚；其次对其现在种群地理分布的形成原因和过程的推断主 要依靠化石记录和古代文献，还需要从其他的角度进行补充和验证，比如可以通 过分子系统地理学研究，从遗传学角度结合古地质和化石记录探讨种群分布格局 “j 两北大学硕l 论文 形成的原因和过程。这些研究对川金丝猴的保护具有重要的指导意义，因为只有 掌握种群的遗传结构，才。能制定有效的保护策略和措施( 葛颂，1 9 9 7 ) 。所以本研究 以d n a 序列作为遗传标记，进行了川金丝猴的种群遗传结构和分子系统地理学的 初步研究。 本研究属于保护遗传学性质的研究，该类研究主要是利用各种分子遗传标记 的比较分析，了解种群遗传结构、遗传变异、基因流、种群的分化等等内容，从 而对制定有效的保护措施起到一定的指导作用( 李明等，2 0 0 0 ) 。据此，本研究利用 来自不同地理种群个体线粒体控制区部分序列的比较达到以下目标： 1 初步了解川金丝猴在d n a 序列水平的种群遗传结构。 2 通过系统地理学分析，初步研究川金丝猴地理分布格局形成的主要原因和过 程。 3 根据川金丝猴种群遗传多样性和系统地理学研究，初步评估不同地理种群适 应环境变化( 或进化) 潜力的大小，确定e s u 或管理单元，并提出保护或提高其 遗传多样性的措施。 l “l 北大学顾十沦文 2 材料与方法 2 1 样品的采集和保存 由于本研究所涉及的川金丝猴为国家一类保护动物，因此我们不仅要保证取样 的科学性，还要考虑所研究的对象为珍稀濒危物种的特点。我们遵循以下原则：( 1 ) 尽量多的从野外自然种群中取样；( 2 ) 以非损伤性取样( n o n i n v a s i v es a m p l i n g ) 为 主，避免破坏性取样( d e s t r u c t i v es a m p l i n g ) ( t a b e r l e te t a l1 9 9 7 ) ：( 3 ) 样品应具有代 表性，每个地理种群均应取到，并尽量的覆盖整个分布区域。 为减少粪便样品中d n a 的降解，应采集新鲜的粪便样品并采用无水乙醇浸泡的 保存方法。本研究共收集到川金丝猴9 0 个个体的样品，包括川金丝猴粪便和毛皮以 及死亡金丝猴尸体的肌肉。这些样品的采集地包括了有川金丝猴分布的所有主要山 系：邛崃山山系( 卧龙保护区) 、岷山山系( 松潘、白水江保护区) 、秦岭( 太白县、 周至保护区) 和湖北神农架保护区。对其中的6 0 个个体的d n a 序列进行研究，这些 个体样品的具体分布、样品类型和数量如表2 1 和图1 1 所示。 表2 1 川金丝猴样品来源和数量 t a b l e21m a t e r i a l sa n dt h e i rs o u r c e $ o f 兄r o x e l l a n a e 四川和甘肃陕西湖北 ( s g ) ( s h )( h b ) 合计 自水江松潘 卧龙周至太白神农架 ! ! 型! ! 1 21 坠! 丝2 ! 1 21 i 盟2 毛皮244 i 0 粪便32加5 2 34 3 肌肉 3l3 7 合计8 461 182 3 6 0 注：括号内为地点的拼音缩写 2 2 主要试剂和仪器 2 2 1 主要试剂 t r i s h c l ( 1 0 m m o l lp h8 0 ) 、c a c l 2 ( 1 m m o l l ) 、e d t a ( o 5 m o l l p h 8 0 ) 、 1 1 f 缓冲液( p h8 0 ) 、1 0 s d s 、酚氯仿异戊醇f2 5 ：2 4 ：1 ) ( 上海生：i ：l 物啊l 晒北大学硕十论文 有限公司) 、饱和酚( l 海生工生物工程有限公司) 、氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 、n a a c ( 3 t o o l l ) 、无水乙醇、7 5 乙醇、b s a ( 毕g 似1 ) ( 七海华舜生物工程有限公司) 、蒸馏 水、粪便d n a 提取试剂盒( q i a g e n ) 、蛋白酶k ( 上海生工生物工程有限公司) 、 d n t p ( 上海生工生物工程有限公司) 、t a q d n a 聚合酶( 1 0 x b u f f e r 、m g c l 2 ) ( 上海 生工生物工程有限公司) 、d n a 分子量标记( m b i ) 2 2 2 主要仪器设备 实验所用仪器主要有以下几种： 水浴锅 低速离心机 高速冷冻离心机 t e 1 0 d 1 1 3 1 1 5 k t e c h n e s i g m a s i g m a 电泳系统power p a c 3 0 0b i o - r a d 灭菌锅 振荡器 p c r 仪 m l s 2 4 2 0 2 0 0 2 型 a b i 9 7 0 0 g i s 凝胶成像处理系统 g i s - - 2 0 0 8 三洋 常州国华电器 a b i 天能公司 超净工作台 s w - c j - 1 b u上海之信仪器 2 3 实验方法 2 3 1 基因组总d n a 的提取 毛皮和肌肉中d n a 的提取方法如下： 1 ) 剪取0 3 c m 2 ( 约o o l g ) 左右的皮张标本，用消毒的解剖刀去除皮张表面的 毛发及其它附着物。 2 ) 用消毒的剪刀将皮张或肌肉剪成l m m 3 以下的微粒，置于e p p e n d o r f 管中， 以去离子水高速振荡洗涤三次，高速离心，倾去上层清液。 3 ) 竹：每个e p p e n d o r f 管中按以f 配比加入消化液5 4 v 过夜( 1 2 h ) 。 两北大学硕十论文 l o m m o l lt r i s h c l 1 0 s d s 1 0 m m o l lc a a 2 1 0 m g m l 蛋白酶k d d h 2 0 t o t a l 5 u l 2 5 u 1 5 0 u j 1 0 u l 4 1 c 叫 5 0 0 u l 4 ) 消化结束时，加入2 0 a0 5 m o l 1e d t a ( p h 8 。 5 ) 高速( 1 0 ，0 0 0 r p m ) 离心1 0 m i n ，取上清。 6 ) 用等体积的饱和酚低速( 7 ，0 0 0 r p m ) 离心1 0m i n ，取上清。 7 ) 用等体积的酚，氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提样品，低速( 7 ，0 0 0 r p m ) 离心1 0 m i n ， 重复该步骤直至无蛋白质沉淀。 8 ) 再加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ；1 ) 低速离心1 0 r a i n 9 ) 在d n a 溶液中加入1 1 0 体积3 m o m 的n a a c ，和2 倍体积预冷的无水乙 醇，混匀，置于2 0 至少4 5 m i n 。 1 0 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ，弃去上清。 1 1 ) 加入l m l 预冷的7 5 乙醇，颠倒离心管数次，1 2 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 m i n ， 弃去上清。 1 2 ) 干燥，然后将干燥的沉淀物溶于4 0 6 0 p 1 的t e 缓冲液中。 粪便中d n a 的提取方法如下： 1 ) 将水浴锅温度升至7 0 。c ，高速冷冻离心机调到室温( 1 5 2 5 0 c ) 2 0 ，0 0 0 ) g ( 约 1 4 ，0 0 0 r p m ) 。 2 ) 将缓冲液a s l 和a l 中的沉淀溶解、混匀。 3 ) 取1 0 0 m g 干粪或2 5 0 m g 湿粪放入2 1 1 l l 离心管。 4 ) 离心管中加入1 6m la s l ，振荡混匀，室温下放置l h ( 湿粪) 或2 7 2h ( 干 粪) 并不时的进行震荡使其混匀。 5 ) 1 4 ，0 0 0 r p m 离心3r a i n 使粪便颗粒沉淀。 6 ) 吸取1 ，4 m l 的上清液，转移到个新的2 m l 离心管中，弃去沉淀。 1 4 西北大学硕士论文 7 ) 在每一个样品中加入一片i n h i b i t f x 并剧烈震荡指导药片溶解混匀。 室温f 放置约2 m i n 。 8 ) 1 4 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。 9 ) 将上清液转移到另一个2m l 离心管中。 1 0 ) 将带有粪便颗粒的离心管再次1 4 ，0 0 0 r p m 离心3 m i n 。 1 1 ) 将第二次离心所得到的上清液转移到第1 0 步中的离心管中( 为保证后边 步骤所需要的6 0 0 a 上清液，为此，步骤l l 和1 2 可以重复) 1 2 ) 将所得的上清液再次1 4 ，0 0 0 r p m 离心6 m i n 。 1 3 ) 吸取6 0 0 # 1 上清液( 要避免白色沉淀) ，转移到另一个2 m l 离心管中并 加入2 5 l 蛋白酶k ( 试剂盒中带有) 1 4 ) 加入6 0 0 p l 的a l 缓冲液，立即震荡约1 5 s e c 。 1 5 ) 7 0 。c 保温1 0 m i n 。 1 6 ) 向溶液中加入6 0 0 a l 无水乙醇，并振荡混匀。 1 7 ) 吸取6 0 0 p l 溶液转移到套放于2 m l 收集管的q i a a m p 离心柱中。 1 8 ) 1 4 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n ，然后将离心柱套放在另一个2 m l 收集管中，弃去 带有滤液的收集管。 1 9 ) 再次吸取6 0 0 , u l 溶液转移到q i a a m p 离心柱中，1 4 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n ， 然后将离心柱套放在另一个2m l 收集管中，弃去带有滤液的收集管。 2 0 ) 最后一次吸取溶液转移到q i a a m p 离心柱中，1 4 ，0 0 0 r p m 离- i i , 2 m i n ，然 后将离心柱套放在另一个2m l 收集管中，弃去带有滤液的收集管。 2 1 ) 向离心柱中加入5 0 0 # 1a w l 溶液，1 4 ，0 0 0 r p m 离心2 r a i n ，然后将离心柱 套放在另个2m l 收集管中，弃去带有滤液的收集管。 2 2 ) 向离一1 1 , 柱中加入5 0 0 i 缓冲液a w 2 ，1 4 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n ，然后将离 心柱套放在另一个2m l 收集管中，弃去带有滤液的收集管。 2 3 ) 将离心柱套放在另r 个新的2m l 收集管中，1 4 ，0 0 0 r p m 离心2 r a i n ，弃去 带有滤液的收集管。 2 4 ) 将离一t l , 柱套放在1 5m 1 离心管中，并加入2 0 0 l 缓冲液a e 。 2 5 ) 室温卜放置2 0 - 一3 0 r a i n ，然后1 4 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n ，所得溶液为d n a 两北大学硕十呛文 溶液，可立即使用