（分析化学专业论文）毛细管电泳安培检测酶及在单细胞中的应用.pdf

山东大学博士学位论文 中文摘要 第一章首先对毛细管电泳( c e ) 的基本原理进行了简单的介绍。然后对毛细管电 泳安培检测的理论，技术以及应用进行了简述，详细的综述了2 0 0 0 年之后毛细管电泳 安培检测的应用。随后介绍了毛细管电泳安培检测酶的现状。最后对毛细管电泳单细 胞分析( 包括单细胞采样方法，单细胞溶膜、单细胞衍生技术，单细胞分析检测方法 及安培检测单细胞的应用等) 进行了详细的综述。本章共引用文献2 2 8 篇。 第二章建立了柱外催化反应法毛细管电泳安培检测y m o l 碱性磷酸酶( a l p ) 的 方法。a l p 是通过毛细管电泳，柱端安培检测测定a l p 柱外催化磷酸苯二钠水解反应 的产物苯酚来检测的。我们用碳纤维簇微盘电极为工作电极，确定了检测a l p 的最 佳实验条件是：电泳缓冲液，1 0 x1 0 4m o l ln a 2 8 4 0 7 - n a o h ( p h9 8 ) ；底物，1 0 0 x1 0 。m o l l 的磷酸苯二钠；毛细管内径，1 0p m ；分离电压，2 0 0k v ；检测电势， 1 0 5v ( s c e ) ；进样电压，5k v 进样时间，1 0s 。为了进一步提高信噪比，我 们研究了不同电极、毛细管形状及对齐方式对a l p 检测限的影响。将毛细管电泳的 超微取样技术，单根碳纤维柱状微电极降低噪音的特性以及酶放大作用提高被检测物 浓度的方法结合起来，检测了y m o l 的a l p 。使用1 0g m 内径的毛细管，在2 5k v 下 电迁移进样2s ，可以得到低至5 6p l 的取样体积；在室温( 1 6 ( 2 ) 时，7 1 0 x1 0 4 1m o 帆 a l p 柱外催化反应1 0m i n ，可以得到1 0 x1 0 5 的放大倍数。当使用出口端为喇叭口 型的1 0p m 毛细管时，采用6p m 单根碳纤维柱状电极插入喇叭口的方法可以使a l p 的浓度检测限达到7 5 0 x1 0 - 1 3m o il ，相应的质量检测限达到4 2 x1 0 m o l 的a l p ， 相当于2 5 个a l p 分子。 第三章研究了柱上催化反应法毛细管电泳安培检测y m o la l p 方法。我们设计了 一种结构简单的恒温水浴装置用于提高舡卫在毛细管中的反应温度。并研究了不同 电极、毛细管形状及对齐方式对柱上催化法测定螂检测限的影响。a l p 是通过柱 端安培检测a l p 柱上催化磷酸苯二钠反应生成的产物苯酚来检测的。研究了柱上催 化反应的最佳条件：运行缓冲液是含1 0 0 x1 0 4m o l l 磷酸苯二钠的p h9 8 的1 0 1 0 。m o l l n a 2 8 4 0 7 溶液：a l p 在进行柱上催化反应前在毛细管中的运行时问是6 0s ： 恒温水浴温度是3 7 。c 。在此实验条件下，7 1 0 x1 0 1 1m o l la l p 柱上催化水解反应 1 5r a i n ，可以得到9 0 1 0 4 的放大倍数。当使用出口端为喇叭口型的1 0p m 毛细管时， l l l 东大学博士学位论文 采用6p m 单根碳纤维 ! _ l ：状i 乜极插入喇叭口的方法，柱上反应2h ，可以使a l p 的浓 度检测限达到7 1 0 1 0 。3m o l l ，相应的质量检测限达到4 0 1 0 2 3m o l 的a l p ，相 当于2 4 个a l p 分子。 第四章用柱外催化反应法c z e 柱端安培检测测定了b a l b c 大鼠胚胎肝细胞提 取波中的a l p 。在室温( 2 8 ) 下，柱外催化反应法测定a l p 的活性浓度线性范围 为30 0 1 0 - 41 0 0 1 0 u m l 线性回归系数0 9 9 9 7 。a l p 的活性浓度检测限( s n = 3 ) 为1 0 0 1 0 4u n i l ( 相当于2 4 0 1 0 。1 3m o l l ) 。相应的活性检测限为0 ，1 5n u ( 棚当于3 6 x 1 0 。t 0 0 1 ) 。对1 0 0 l f f 2u m l 的a l p 进行6 次平行检测，“与l 的 相对标准偏差为o 1 8 和2 5 。b a l b e 大鼠胚胎肝细胞提取液中的a l p 的平均活 性浓度为6 ，1 7 l o - 3u m l 。平均每个胚胎肝细胞a l p 的活度为4 4 x1 0 9u 。得到a l p 的回收率为9 6 1 0 8 。 第五章中我们建立了迄今为止未见报导的毛细管电泳安培检测测定单个细胞中 a l p 同功酶的方法。室温( 2 8 ) 下，将单个细胞迸样到毛细管中溶膜，在高压的 作| | ：| ：将a l p 同功酶分离开后，a l p 同功酶在毛细管中与底物磷酸苯二钠反应，柱 端安培检测测定催化产物苯酚。运行缓冲液是含1 0 0 1 0 0m o l l 的磷酸苯二钠p h9 8 的50 1 0 2m o 忱n a z b q 0 7 3 0 1 0 0m 0 1 ln a o h 的溶液。柱上催化反应法检测得到 a l p 的活性浓度线性范围为3 o o x1 0 3 - 9 0 0 x 1 0 u m l ，根据迸样体积计算出的活度线 性范围为4 5 0 x 1 0 0 - 1 3 5 x 1 0 4u ，线性回归系数为0 9 9 9 2 ，活性浓度检测限及活性检 测限为1 0 0 x 1 0 3u m l 及1 5n u ( 对应的浓度检测限为2 4 x1 0 1 2m o l l ，相应的质量 检测限为3 6 x1 0 “t o o l ，s n = 3 ) 。对3 0 0 x 1 0 0u m l ( 4 5 0 x1 0 8u ) 的a l p 进行 6 次平行检测，k 与i p 的相对标准偏差为1 1 和4 5 。测得b a l b c 大鼠单个骨髓 成纤维细胞中两利，a l p 同功酶活性含量为2 1 - 4 5 1 0 7 u 和1 0 3 9 x 1 0 u 。 第六章中我们利用葡萄糖一6 磷酸脱氢酶( g 6 p d h ) 催化葡萄糖6 磷酸和n a d + 反应的产物n a d h 具有电化学活性的特性来检测g 6 p d h ，首次实现了c z e 柱端安 培检测人类最小的血红细胞中的g 6 p d h 。为了检测g 6 p d h ，我们首先确定了c z e 安培检测测定产物n a d h 的检测条件是：p h7 , 8 的3 0 0 1 0 一m o l l i r i s h c i 运行缓 冲液，2 0k v 的分离电压，5k v 的进样电压，1 0s 的进样时间，1 0 5v 的检测电势( w s c e ) 。并用柱外催化反应法确定了g 6 p d h 催化反应的最佳条件；3 0 0 1 0 4m o l l 山东大学博士学位论文 ( p h7 。8 ) 的t r i s h c l 缓冲液。1 0 0 1 0 0m 0 1 l 的g i c 6 p ，1 0 0 1 0 刁m o l 几的n a d + 和1 0 0 1 0 。3m o l l 的激活剂m 9 2 + 。在这些条件下，得到柱上催化反应法检测g 6 p d h 的活性浓度检测范围为24 7 1 0 。2 。4 7 x1 0 u m l ，根据进样体积0 1 ln l 计算出活 度线性范围为2 7 2 l o - x o 2 7 2 x1 0 一u ，活性浓度检测限及活性检测限分别为6 2 1 0 4u m l ( 相当于1 2 x1 0 。11 1 1 0 i l ，s n = 3 ) 及6 8 叫( 相当于1 3 1 0 “t 0 0 1 ) 。用 柱上催化反应法测定人单个血红细胞中的g 6 p d h 时，使用的毛细管检测端蚀刻成喇 叭口状用以提赢信噪比。单个细胞进样到毛细管中需先溶膜后，在柱上3 7 cr 1 , j 细胞 中的g 6 p d h 与底物葡萄糖6 一磷酸和n a d + 催化反应3 0r a i n ，c z e 柱端安培检测产 物n a d h 。测得人7 个单个血红细胞中g 6 p d h 的活性含量为1 2 x1 0 1 0 _ 6 2 x1 0 1 0u ， 对应的质量含量为2 3 1 0 - 2 11 2 x1 0 。2 0t o o ! 。测定结果与文献值基本一致。 关键词：毛细管电泳，酶分析，单细胞分析，安培检测。 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t i nc h a p t e roneo f t h i st h e s i s ，f i r s to f a l l ，t h ep r i n c i p l eo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) w a si n t r o d u c e db r i e f l y t h e nt h et h e o r y , t h em e t h o d so f d e t e c t i o na n dt h ea p p l i c a t i o no f c e w i t ha m p e r m e t r i cd e t e c t i o na f t e rt h ey e a ro f2 0 0 0w e r er e v i e w e di nd e t f i l t h es t a t u si n q u oo fe n z y m em i c r o a n a l y s i sb yc ew a si n t r o d u c e ds u b s e q u e n t l y t h e nt h ea n a l y s i so f s i n g l ec e l l sb yc ei n c l u d i n gt h es i n g l ec e l ls a m p l i n g ，m e t h o d so fl y s i n gc e l l ，d e r i v a t i z a t i o n m e t h o d sa n dd e t e c t i o nm e t h o d sw e r er e v i e w e d f i n a l l y , t h ew o r kf o rs i n g l e c e l la n a l y s i sb y c ew i t ha m p e r m e t r i cd e t e c t i o nw a ss u m m a r i z e d 2 2 8r e f e r e n c e sw e r er e f e r r e d i nc h a p t e rt w o ，am e t h o df o ri n d i r e c t l yd e t e c t i n gy o c t o m o l e ( 1 0 - 2 c 1 0 2 4m 0 1 ) a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( a l p ) w a sd e v e l o p e db yc ew i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( e d ) ，i nt h i s m e t h o d ，d i s o d i u mp h e n y lp h o s p h a t ew a su s e da st h ee n z y m es u b s t r a t ea n dt h ep r o d u c t p h e n o lo fi t sh y d r o l y s i sr e a c t i o nc a t a l y z e db ya l pw a sd e t e c t e da tt h ec a r b o nf i b e r e l e c t r o d e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f d e t e c t i o n w e r e1 0 x 1 0 m o l l n a 2 8 4 0 7 - n a o h ( p h 9 8 ) f o rt h er u n n i n gb u f f e r ；1 0 0 x1 0 。m o l ld i s o d i u mp h e n y lp h o s p h a t ef o rt h ee n z y m e s u b s t r a t e ；1 0p mi df o rt h ec a p i l l a r y ；2 0 0k vf o rt h es e p a r a t i o nv o l t a g e ；5k va n d1 0sf o r t h ei n j e c t i o nv o l t a g ea n di n j e c t i o nt i m e ；1 0 5v 吼t h es a t u r a t e dc a l o m e le l e c t r o d e ( s c e l f o rt h ed e t e c t i o np o t e n t i a l ，r e s p e c t i v e l y i no r d e rt oe n h a n c et h er a t i oo fs i g n a lt on o i s e ，t h e s h a p ea n ds i z eo f t h ew o r k i n ge l e c t r o d e , t h es h a p eo f d e t e c t i o ne n do f t h ec a p i l l a r y , a n dt h e c a p i l l a r y e l e c t r o d ea l i g n m e n tm e t h o dw e r es t u d i e di nd e t a i l as a m p l ev o l u m eo f5 6p l w a so b t a i n e dw h e nt h ec a p i l l a r yo f1 0g mi dw a su s e du n d e rt h ec o n d i t i o n so f2 5k vf o r t h ei n j e c t i o nv o l t a g ea n d2sf o rt h ei n j e c t i o nt i m e aa m p l i f i c a t i o nm u l t i p l eo f1 0 1 0 5 w a so b t a i n e da f t e ra l pr e a c t e dw i t ht h es u b s t r a t ef o r1 0m i na tr o o mt e m p e r a t u r e ( 16 c ) w h e nas i n g l ec a r b o nf i b e rm i c r o c y l i n d e re l e c t r o d eo f 6g m ，ac a p i l l a r yo f1 0l x mi dw i t h t h ee t c h e dd e t e c t i o ne n d a n dt h ei n - c a p i l l a r ya l i g n m e n tw e r eu s e d ，am a s sl i m i to f d e t e c t i o n o f 4 2 x1 0 。m o l ( c o r r e s p o n d st o2 5m o l e c u l e ) w a sa c h i e v e da f t e rt h es o l u t i o nc o n t a i n i n g a l p , d i s o d i u mp h e n y lp h o s p h a t ea n dt h er u n n i n gb u f f e rw a si n c u b a t e df o r1 0m i n i nc h a p t e rt h r e e ，am e t h o df o rd e t e c t i n gy m o la l p b yc e e dw a sd e v e l o p e di nw h i c h t h ec a t a l y z er e a c t i o nc c u r r e do n c a p i l l a r y as i m p l eh e a t i n gd e v i c eu s e dt oi n c r e a s et h e r e a c t i o nt e m p e r a t u r eo nc a p i l l a r yw a sd e s i g n e d t h ed i f i e r e n ts h a p ea n ds i z eo ft h e w o r k i n ge l e c t r o d e ，t h es h a p eo fd e t e c t i o ne n do ft h ec a p i l l a r y , a n dt h ec a p i l l a r y e l e c t r o d e a l i g n m e n tm e t h o dw e r eu s e dt oi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y ap a r to ft h eo p t i m u m 山东大学博士学位论文 c o n d i t i o n so f r e a c t i o na n dd e t e c t i o nw e r et h es a m ea st h o s ei nc h a p t e rt w oa n dt h ec a t a l y z e r e a c t i o no c c u r r e do n c a p i l l a r yi nt h er u n n i n gb u f f e ro f1 0 1 0 m o l ln a 2 8 4 0 7 一n a o h r p i t9 8 ) c o n t a i n i n g1 o o x1 0 。m o l ld i s o d i u mp h e n y lp h o s p h a t ea st h ee n z y m es u b s t r a t e aa m p l i f i c a t i o nm u l t i p l eo f9 0 x1 0 4w a so b t a i n e da f t e ra l pr e a c t e dw i t ht h es u b s t r a t e o n c a p i l l a r yf o r1 5m i na t3 7 。c w h e nas i n g l ec a r b o nf i b e rm i c r o c y l i n d e re l e c t r o d eo f6 p m ，ac a p i l l a r yo f1 0g r ni dw i t ht h ee t c h e dd e t e c t i o ne n d a n dt h ei n c a p i l l a r ya l i g n m e n t w e r eu s e d ，am a s sl i m i to fd e t e c t i o no f4 0x 1 0 “m o l ( c o r r e s p o n d st o2 4m o l e c u l c ) w a s a c h i e v e df o r t h ei n c u b a t i o nt i m eo f1 5m i n i nc h a p t e rf o u r , a l pi nb a l b om o u s ep e r i t o n e a lm a s tc e l l sw a sd e t e r m i n e db y c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sw i t he l e c t r o c h e m i c a le n d c o l u m na m p e r o m e t r i cd e t e c t i o na t ac a r b o nf i b e rm i c r o d i s kb u n d l ee l e c t r o d e t h ea l p c a t a l y t i cr e a c t i o no c c u r r e di na l l1m l e p p e n d o f fp l a s t i cv e s s e l ，a n dt h ed i s o d i u mp h e n y lp h o s p h a t ew a su s e da st h ee n z y m e s u b s t r a t ea n dt h ep r o d u c tp h e n o lw a sd e t e c t e d t h ea c t i v i t yc o n c e n t r a t i o nl i m i to fd e t e c t i o n w a s1 0 0 x 1 0 4u m l ( 2 4 0 x 1 0 1 3m o l l ，s n = 3 ) a n dt h el i n e a rr a n g ew a s3 0 0 x1 0 。4 1 0 0 10 一u m lf o rt h ei n j e c t i o nv o l t a g eo f5k va n dt h ei n j e c t i o nt i m eo f1 0s t h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so ft h em e t h o dw a s0 9 9 9 7 t h ec o r r e s p o n d i n ga c t i v i t yl i m i to f d e t e c t i o nw a s0 1 5n u ( 3 6 x1 0 。2t 0 0 1 ) t h er e s p o n s e sf o ras e d e so f s i xi n j e c t i o n so f1 0 0 x1 0 。u m la l pi nar e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw e r e0 1 8 f o rt h em i g r a t i o nt i m e a n d 2 5 f o rt h ee l e c t r o p h o r e t i cp e a kc u r r e n tr e s p e c t i v e l y t h em e t h o dh a db e e na p p l i e dt o d e t e r m i n i n ga l pi nt h ee x t r a c to fb a l b cm o u s ep e r i t o n e a lm a s tc e l lt h ea v e r a g e a c t i v i t ya m o u n to fa l pi n a ni n d i v i d u a lp e r i t o n e a lm a s te e l lw a s4 4 1 0 一u t h e r e c o v e r yo f t h em e t h o df o ra l pw a sb e t w e e n9 6 a n d1 0 8 i nc h a p t e rf i v e , an o v e lm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fa l pi s o f o r m si ni n d i v i d u a l b a l b cm o u s eb o n em a r r o wf i b r o b l a s tc e l l sh a sb e e nd e v e l o p e db a s e do nc e e dw i t h o n c a p i l l a r yc a t a l y t i cr e a c t i o n a f t e ro n c a p i l l a r yi n c u b a t i o n , t h er e a c t i o np r o d u c tp h e n o l g e n e r a t e db ya l pi s o f o r m si nas i n g l ec e l lw a sd e t e r m i n e db yc e e di no r d e rt oq u a n t i f y t h e 蝴a c t i v i t yi nt h es i n g l ec e l l s ，t h el i n e a rr a n g eo f a l pd e t e c t i o nw a ss t u d i e df i r s t t h e l i n e a rr a n g eo fa c t i v i t yc o n c e n t r a t i o n ，l i m i to fd e t e c t i o n ( s n = s ) a n dc o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t so f t h em e t h o dw e r e3 ，0 0 x l o 3 9 0 0 1 0 u m l 。1 o o x l 0 3u m lf 2 4 1 0 。1 2 m o l l ) a n d0 9 9 9 2 ，r e s p e c t i v e l yf o rt h ei n e c t i o nv o l t a g eo f5k va n dt h ei n j e c t i o nt i m eo f 10s t h ec o r r e s p o n d i n ga c t i v i t yl i n e a rr a n g ea n dt h el i m i to fd e t e c t i o nw e r e 山东大学博士学位论文 4 5 0 1 0 - 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