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转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析中文摘要 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 中文摘要 目的利用模式生物果蝇表达p c l 重组蛋白复合物，检测、纯化所表达的p c l 蛋白， 为研究p c l 蛋白复合物的生物学活性及其在胚胎不同发育时期的作用提供依据。 方法p c l 基因经p c r 扩增后，重组至l j p c a s 8 3h h f _ p r e s c t 载体，构建p c a s 8 3p c l e 表达载体。经显微注射果蝇胚胎，该表达载体整合于果蝇生殖细胞的基因组上，并建 立p c l 转基因果蝇系。 我们利用转基因果蝇系表达p c l 蛋白，并进行多线染色体的免疫组化分析，检 测p c l 蛋白的表达。应用免疫沉淀法对p c l 蛋白进行纯化，并分析其生物学功能。 结果建立了表达重组p c l 蛋白复合物的转基因果蝇系。尽管不同转基因果蝇系的 p c l 蛋白表达水平并不相同，但所表达的重组p c l 蛋白与内源性蛋白具有相似的分 布特征，并能部分代偿缺陷型p c l 蛋白的功能。因为p c l 重组蛋白复合物的c 末端 带有h a - s x h i s f l a g 标记，所以可以利用抗f l a g 抗体纯化转基因果蝇系不同发育 时期的p c l 复合物。 结论成功建立了转基因果蝇系并表达了重组p c l 蛋白，为进一步纯化p c l 蛋白复 合物及其功能的研究奠定了基础。 关键词：转基因果蝇，p o l y c o m b 蛋白复合物，p o l y c o m b l i k e 蛋白，蛋白复合物，纯 化 作者：田海燕 导师：魏文祥教授 杨吉成教授 西固意一教授 广濑造教授 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 英文摘要 e s t a b l i s h m e n to ft r a n s g e n i cf l yt h a te x p r e s s e s r e c o m b i n a n tp r o t e i np c li nd r o s o p h i l a ：f o ra n a l y s i so f b i o c h e m i c a lf u n c t i o n so ft h ep r o t e i nc o m p l e x a b s t r a c t o b j e c t i v e t oa n a l y z eb i o c h e m i c a lf u n c t i o n so fp c l p r o t e i ni nd i f f e r e n te m b r y o g e n e t i c d e v e l o p m e n t , w ee x p r e s sp c l r e c o m b i n a t i o np r o t e i nc o m p l e xi nd r o s o p h i l a ，t h e nd e t e c t a n dp u n f yt h ep r o t e i nc o m p l e x e sf r o mi nv i v om a t e r i a l s m e t h o d sp c lg e n ew a sa m p l i f i e db yp c ra n dd i r e c t l yi n s e r t e di n t o p c a s 8 3 h h f p r e s c tv e c t o ra tn o t i s t u i s i t e s t h ee x p r e s s i o nv e c t o ro fp c a s 8 3p c l ew a s i n j e c t e di n t od r o s o p h i l ae m b r y o st oe s t a b l i s ht r a n s g e n i cf l i e se x p r e s s i n ge p i t o p e t a g g e d r e c o m b i n a n tp c lp r o t e i n j u d g i n gf r o mg e n e t i ca n di m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s e s ， i m m l m o - a f f i n i t yp u r i f i c a t i o no ft h ep r o t e i nc o m p l e xb ya i do fa n t i f l a ga n t i b o d y r e v e a l e dt h a to u rm e t h o d sw o u l db ea p p l i c a b l et os o m eb i o c h e m i c a la n a l y s e s r e s u l t sw ee s t a b l i s h e dt h et r a n s g e n i cf l yt h a te x p r e s s e sr e c o m b i n a n tp r o t e i ni n d r o s o p h i l a d i f f e r e n tt r a n s g e n e i cf l yl i n eh a sd i f f e r e n tp c lp r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l ，b u t e x p r e s s e dr e c o m b i n a n tp c lp r o t e i nc o m p l e xa p p a r e n t l yb e h a v e da se n d o g e n o u sp c l p r o t e i n s ，f u r t h e rm o r e ，i tc o u l dp a r t i a l l yc o m p e n s a t e d t h ef u n c t i o no fd e t e c t e dp c l p r o t e i n f o rr e c o m b i n a t i o np c lp r o t e i nh a sc t e r m i n a l8 x h i s h a - f l a ge p i t o p e s , w ec a nu s e a n t i - f l a ga n t i b o d yt op u r i f yp c lc o m p l e xf r o me r n b r y o g e n e t i cd e v e l o p m e n t c o n c l u s i o nw eh a v es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dt h et m u s g e n e i cn yl i n et o e x p r e s s r e c o m b i n a t i o np c l p r o t e i n , a n dw h i c h , w i t h o u tc o n s 仃a i n t ，p r o m p t e du st oa n a l y z ef u r t h e r d e t a i lo fb i o c h e m i c a lf u n c t i o n so fp r o t e i nc o m p l e xo fi n t e r e s t k e yw o r d s ：t r a n s g e n i cf l y , p o l y c o m bg r o u p ，p o l y c o m b l i k e ，p r o t e i nc o m p l e x ，p u r i f i c a t i o n w r i t t e nb yt i a nh a i y a n s u p e r v i s e db yw e iw e n x i a n g y a n gj i c h e n g k e n i c h in i s h i o k a s u s u r n uh i r o s e i i 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学 或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律 责任。 研究生签名：塑塑夔e l期：礁：主：翌 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 导师签名：日 期： 期： 砌，5 、知 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析序言 序言 胚胎发育是一个沿时空顺序坐标在形态上剧烈变化的复杂过程。人类及其它动植 物胚体的形成过程都起始于单个细胞的受精卵，经过一系列有序的变化之后，最终形 成了由多细胞构成的有机体。随着遗传学、发育生物学和分子生物学等学科的迅猛发 展，人们已逐渐认识到细胞的遗传物质、细胞间的信息传递和环境因素是胚体形成的 根本过程【。 认识胚胎发育的遗传控制的关键是认识调控基因。调控基因的功能是通过调节一 组目的基因表达来控制性状的表现。个体发育从受精卵开始就受发育调控串基因的有 序启动与关闭的控制。这些基因参与发育调控，通过转录调节，细胞间相互作用，表 达产物的不均一分布等等，使得控制方式多种多样【2 】。 基因表达的调节主要在转录水平上进行，并且转录控制子多是一类d n a 结合蛋 白，通过其与受控基因启动子或其它调控组件的结合来调节目标基因的表达。 i - i o x 基因对调控胚胎发育具有极其重要的作用 到目前为止，所发现的控制发育的基因家族主要是同源框基因( h o x 基因) ，s o x 基因家族，以及d m r t 基因家族【3 】。其中同源框基因家族的组成是迄今研究的比较清 楚的一个发育调控系统。在胚胎发育过程中，同源框基因编码的蛋白充当核内转录因 子1 4 。 通常所说的同源框基因主要是指h o x 类基因( h o m e o b o xg e n e ) ，该基因9 0 年前 首先在黑腹果蝇中发现，后来在包括人类在内的所有动物中均有发现。h o x 基因在 果蝇基因组中以一种惊人的方式排列：它们聚拢在一起并且其排列顺序与它们影响的 体节顺序相同。这种组织形式在大多数动物的基因组中都是保守的，即动物中h o x 基因排列的方式与果蝇基因组中相同。因此，h o x 基因在真核生物的个体发育及细 胞分化的调控中起到非常重要的作用【5 1 。 随着研究的深入，人们发现h o x 基因在胚胎发育过程中可以编码一系列转录因 子，它们对肢体的形成和分化发育有十分重要的意义，在胚胎发育过程中具有极其重 要的作用 6 1 。一旦某一基因表达异常( 超水平表达、或表达减少或丢失) ，胚胎就会 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析序言 出现各种各样的隐性或显形的畸形或者器官的功能性缺损，严重者可致死亡忉。 p c g f r r x g 类蛋白维持h o x 基因的时空表达模式 细胞的增殖、分化过程受h o x 基因表达模式的影响，而p e g 类蛋白及t r x g 类 蛋白则可以调控细胞各发育阶段的不同h o x 基因表达。 果蝇的胚胎发育研究表明：h o x 基因的“时空”表达模式最初是由隶属于g a p 及 p a i rr u l e 基因家族编码的蛋白决定的。这两类蛋白大都具有d n a 结合活性，且其分 布具有特定的区域性。其中g a p 类蛋白是h o x 基因的直接抑制子，而p a i r r u l e 蛋白 可以活化h o x 基因表达。两类蛋白的调控范围相互重迭且其作用相互拮抗，共同建 立了特定细胞内的h o x 基因表达模式。大约在果蝇胚胎生成4 h 后，上述两类蛋白 质基因表达关闭【引。 对于己建立起来的h o x 基因表达模式，则由p e g 及t r x g 蛋白来继续维持。其 中p c g ( p o l y e o m bg r o u p ) 蛋白主要维持细胞内己被g a p 蛋白关闭的h o x 基因表达 抑制，而t r x g ( t r i t h o r a xg r o u p ) 蛋白则确保己表达的h o x 基因继续活化【9 】。 研究认为p c g 蛋白可以通过与p r e s ( p o l y c o m br e s p o m ee l e m e n t s ) 结合来抑制 h o x 基因的转录，主要有以下几种途径： 乱以多蛋白复合体的形式与p r e s 结合，将受控d n a 所在的染色质包装成“异染 色质”结构，进而阻碍特定转录因子进入d n a 调控区； b 稳定核小体的排列从而防止复合体( 如s w l 阶源) 对核小体的重塑； c 通过与t a f i i 蛋白结合抑制转录因子介导的转录活性； d 改变组蛋白的乙酰化； e 干扰启动子与增强子之间的相互作用； 形成沉默启动子复合体。 p e g 蛋白家族的一大特点就是以多蛋白质复合体的形式发挥作用。在果蝇至少存 在两种不同的p e g 蛋白质复合物。一种被称为p r c i 复合物，主要包含有p c ( p o l y c o m b ) ，p h ( p o l y h o m e o t i e ) ，p s c ( p o s t e r i o rs e xc o m b s ) 和r i n g 四类p e g 蛋 白；另一种是p r c 2 复合物，包含有e s c ( e x t r as e xc o m b ) ，e ( z ) ( e n h a n c e ro f z e s t e ) 和s u ( z ) 1 2 ( s u p p r e s s o r o f z e s t e1 2 ) 三种p e g 蛋白。p e g 蛋白就是以这种多蛋白复合 体的形式对靶基因产生抑制效应的。 2 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析序言 另一类反式作用因子t r x g 则与p c g 蛋白的作用相反，具有“反抑制子 的功能。 它主要通过与t r x g 顺式应答组件结合，防止核小体与受控基因启动子区结合，以保 持h o x 基因周围的染色体处于一种“开放刀状态，从而促进h o x 基因转录。确切 地说，p c g 基因的突变将导致h o x 基因的异位表达，而t r x g 基因的突变则使h o x 基因表达下调【1 0 1 。 p c l ( p o l y c o m b l i k e ) 蛋白与靶基因的转录抑制相关 有研究表明，在胚胎发生早期，1 - m d a 大小的p r c 2 复合物中含有p c l 蛋白 ( p o l y c o m b l i k c ) 【1 1 】，该蛋白属于p c g 蛋白，可以结合在p r e s ，对h 3 k 2 7 产生高 水平的三甲基化作用，并与靶基因的转录抑制相关1 1 ，1 2 ，1 3 1 。目前，p c l 蛋白在p c g 蛋白复合物的调控转录中所起具体作用还不明确。 为了研究p c l 蛋白的生物学功能，我们可以建立转基因果蝇系，在果蝇体内持 续地表达p c l 重组蛋白。将表达的重组蛋白纯化后，我们就可以分析重组蛋白的成 份及其功能。 本文建立了转基因果蝇系表达带有多个表位标记的重组蛋白p c l ，并应用免疫沉 淀法对p c l 蛋白进行纯化，分析其具有与内源性p c l 蛋白相似的生物学功能。这些 研究结果有助于分析p c l 蛋白在p c g 蛋白复合物及胚胎发育中的生物学功能。 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 第一部分p c l 转基因果蝇系的建立 为了探索p c l 蛋白复合物的生物学活性及其在胚胎发生发育中的作用，我们应 用p c r 扩增的p c l 基因，重组到p c a s 8 3h h f p r e s c t 载体，构建了p c a s 8 3p c l e 表达载体，并建立表达重组p c l 蛋白的转基因果蝇系。 材料与方法 一、材料 1 酶及主要试剂 n o f l ，s t u i 及p r i m e s t a r 聚合酶，t 4p n k ，t 4d n a 连接酶，购自t a k a r a 公司， 测序由自己完成，引物由日本北海道夕天于厶廿彳工：久公司合成。 d n a c l e a n & c o n c e n t r a t o r - 5 t m 剂盒( z y m or e s e a r c h ) p c r p u r i f i c a t i o n 试剂盒( q i a g e n ) s i g m a m i n i p r e p 试剂盒( s i g m a ) c e n t r i - s e p 柱( p r i n c e t o ns e p a r a t i o n s ) q i a g e nm i d i 试剂盒( q i a g e n ) 2 菌种及质粒 p c a s 8 3h h f _ p r e s c t 载体，p 2 - 3 质粒，e e o l i 菌株d h 5 a 为n i g 个体遗传研究 室保存。 3 实验动物 黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) y w 株，y w ：c y o g l a 株 4 主要仪器 p c r 仪，核酸和蛋白电泳仪，凝胶成像与分析系统，a b ip r i s m31 3 0 x ld n a 测 序仪，h v - f i l t e r ( m i l l i p o r e ) ，f e m t o j e t5 2 4 7 压力注射器( e p p e n d o r 0 ，n e e d l ep u l l e r ( n a r i s h i g e ) 加热器，气浴、水浴摇床，各类离心机，电子天平，磁力搅拌机，显微镜，培养 箱，高压蒸气灭菌锅，冰箱和冰柜 4 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 二、方法 1 果蝇p c l 表达载体的构建 根据果蝇p c l基因序列合成引物，上游引物p 1 ： 5 c a c g c g g c c g c c a r g a t g a a c a a c c a r r ，】_ r c a c t t g c 3 ，下游引物p 2 ： 5 c c t c 邸丌c c a a g c 丸虹c c 凡盯c g c c g t t g t c g c 3 ，以n i g 个体遗传研究室 的d g cc l o n e ( s d 0 9 4 8 8 ) 为模阪，p a r 扩增p c l 基因。真核载体p c a s 8 3h h f p r e s c t 经 n o t i s t u i 双酶切后，用胶回收试齐i j 盒回收目的片段，再由t 4 d n a 连接酶连接过夜， 氯化钙法转化d h 5 a 感受态细胞，筛选p c a s 8 3p c l e 重组质粒的阳性克隆，测序鉴 定。 1 1p c a s 8 3h h fp r e s c t 质粒的抽提 摇d h 5 a - p c a s 8 3h f _ p c l 菌及d h 5 a - p c a s 8 3h h f _ p r e s c t 菌于3 7 c 16 0 r p m 过夜，第 二天抽提质粒。 ( 1 ) 在2 x y t 培养基中增殖过夜的菌液各取4 m l ，1 2 0 0 0 r p m 离，凸l m i n ，去上清； ( 2 ) 用0 2 0 m l 已加入r n a s e a 的s l 溶液充分悬浮细菌； ( 3 ) 加入0 2 0 m ls 2 溶液并温和上下翻转6 8 次，混合均匀至溶液透亮，此步骤小 于5 m i r a ( 4 ) 加入0 3 5 m l4 c 预冷的s 3 溶液温和上下翻转，混合均匀至有紧实的凝集块形 成，室温静置2 m i n 最高速离一l q0 m i m ( 5 ) 吸( 4 ) 中的上清并转移到d n a 制备管( 置于2 m l 离心管中) ，1 2 0 0 0 r p m 离 , 凸, l m i n ，弃滤液： ( 6 ) 将制备管置回离心管，加0 7 5 m lw 溶液1 2 0 0 0 r p m 离一心l m i n ，弃滤液； ( 7 ) 将制备管置回离心管，1 2 0 0 0 r p m 离，t ) , l m i n ； ( 8 ) 将制备管移入新的1 5 m l 离心管中，在d n a 制备膜正中央 j i l l 0 0 1 dt e 洗脱液， 室温静置l m i n 后1 2 0 0 0 r p m 离- 心2 m i n ，即得质粒。 1 2p c r 反应 提取抽提的p c a s 8 3h f p c l 质粒d n a 作为模板，以引物p 1 、p 2 进行p c r 扩增 反应体系 5 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 第一部分 p 1 p 2 d n a 模板 5 x p r i m e s t a rb u f f e r p r i m e s t a r 聚合酶 10 m m o l ld n t p d d h 2 0 。5 p l 5 m 1 m 2 0 m 1 山 1 0 山 5 8 m 总计：1 0 0 i _ t l 经离心机甩匀，置p c r 仪中进行扩增反应，条件如下： 预变性9 5 5 m i n 变性9 5 3 0 s 退火5 2 3 0 s 延伸7 2 3 m i n 2 0 个循环后7 2 延伸5 m i n 。 将所有p c r 产物和1 0 9 ld n am a r k e r 进行0 8 琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像与 分析系统观察并分析电泳结果。 1 3 目的片断的胶回收 ( 1 ) 在紫外灯下切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体， 并切碎，称凝胶重量； ( 2 ) 根据凝胶重量，按下表所提供的参数加q g 溶液； 凝胶浓度q g 溶液体积 s 1 0 s 1 5 叟0 3 个凝胶体积 4 个凝胶体积 6 个凝胶体积 ( 3 ) 混匀后于5 0 加热，间断混合1 0r a i n ( 直到凝胶完全熔化) ； ( 4 ) 凝胶完全熔化后，确定混合溶液是否为黄色( p h 值主7 5 ) ； ( 5 ) 加1 个q g 体积的异丙醇，混合均匀，当分离的d n a 片段大小在5 0 0 b p 和 4 k b 之间时，异丙醇对产率没有影响； 6 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 ( 6 ) 吸取( 5 ) 中的混合液，转移到d n a 制备管中( 置于2 m l 离心管中) ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n 。制备管中若有液体残留，可再离心l m i n ，并弃滤液； ( 7 ) 将制备管置回离心管，加0 7 5 m lw 溶液，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤液； ( 8 ) 将制备管置回离心管，最高速率离心1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ； ( 9 ) 将制备管置于一干净的1 5 m l 离心管中，在d n a 制备管中央加5 0 m lt e 洗 脱液；室温静置l m i n ( 时间稍长更佳) ，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，洗脱d n a 。 1 4p c r 产物的修饰 ( 1 ) n o t l 单酶切 反应体系 p c r 产物1 0 x h5 0 m b u f f e r 9 m 0 i b s a 9 山 n o t i 1 5 d d dh 2 0 2 0 5 肛l 总计：9 1 3 l 山 酶切条件：3 7 ( 2 ，过夜。 ( 2 ) 磷酸化酶切末端 反应体系 酶切后的p c r 产物 t 4p n k 1 md t t 5 0 0 m m 册 d d w r a t e r 9 0 m 1 山 1 m 1 m 7 肛l 总计：l o o 肛1 反应条件：3 7 c ，l h ，利用d n ac l e a n & c o n c e n t r a t o r - 5 r m 试剂盒提纯反应产物， 以8 i x l t e 溶液洗脱。 1 p c a s 8 3h h f p r e s c t 的双酶切反应 反应体系 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 第一部分 质粒 d f i 锄i 1 0 x hb u f f e r 0 1 b s a 0 1 腽t o n x 1 0 0 d d h 2 0 9m 1 5 山 1 5 i _ t l 6 l l 6 m 6 m 4 2 m 总计：6 0 i t t l 酶切条件：3 7 c ，过夜。以p c r p u r i f i c a t i o n 试剂盒纯化酶切后的载体。 1 6 连接产物的转化及筛选 表达载体：p c a s 8 3h h f p r e s c t ( 5 n g # d ) 1 山 插入片断：p c l ( o d ) p c r 产物2 r a 5 5 ，5 m i r a 室温，5 m i n ； 加入t 4d n a 连接酶3 p 1 ； 1 6 ，8 h ： 连接产物按下表所列进行转化： 上 o * c ，3 0 m i n 上 4 2 c ，9 0s 口m2 - 8 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 加3 7 ( 2 预热的2 x y t8 0 0 p 1 ，3 7 c ，4 5 m i n 摇动震荡培养 上 转化液分为2 0 0 t l ( 1 4 ) ，6 0 0 p t l ( 3 4 ) 5 0 0 0r p m ，5m i n ，弃上清，留10 0 “1 混悬液分别涂布氨苄平板 i 3 7 ( 2 置隔水式恒温培养箱过夜 土 隔日挑取实验组克隆于4 m l2 x y t 培养基中，3 7 * ( 2 振摇培养 1 7 连接产物的测序 在2 x y t 培养基中增殖过夜的菌液各取4 m l ，1 2 0 0 0 r m i n 离, 心2 r n i n ，去上清；利用 s i g m a m i n i p r e p 试剂盒提纯重组质粒。 纯化后的重组质粒进行双酶切反应，并用0 8 琼脂糖凝胶电泳，观察并分析电泳 结果。 挑选一个阳性结果的p c a s 8 3p c l _ e 重组质粒进行d n a 测序。 p 1 ： p i c i ? 5 0 7 5 c a c g c g g c c g c c a r g a t g a a c a a c c a r i y i t c a c t t g c - 3 卫d f5 c c g g aa t t c c c a c c a g t t g c c g c t c c c t c g - 3 瑚0 4 5 c c t c t f 钢叮t c c a a g c a a t c c a a r c g c c g t t g t c g c 3 f l a g i 也5 g a t c c c t t g t c a t c g t c g t c c t t g l a g t c c a t g g l a 3 9 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 p c r 反应体系 p 2 d n a 模板 5 x b i gd y e b u f f e r b i g d y e d d w a t e r 2 1 x l 1 m 2 m l l x l 4 斗l 总计：1 0 m 经离心机甩匀，置p c r 仪中进行扩增反应，条件如下： 预变性96lmin 变性9 6 1 0 s 退火5 0 5 s 延伸604min 2 5 个循环4 避光冷藏。 p c r 后，用c e n t d s e p 柱纯化测序产物； 将纯化后的产物5 5 避光干燥； 在每个样品中加入1 5 山冷的h i - d if o r m a m i d ，混匀； 9 5 加热2 m i r a 置于冰上5 m i r a 将样品转入9 6 孔板中，在a b ip r i s m3 1 3 0 x ld n a 测序仪上测序。 2 果蝇胚胎的d n a 显微注射 2 1d n a 混合注射液的准备 d n a 结构，p c a s 8 3p c l e ，由q i a g e nm i d i 试剂盒纯化。然后溶入2 0 0 9 l 的5 m m l 0 0 4 p h6 8 】， 5 m mk c i 溶液。反复用乙醇沉淀后，再溶入1 注射缓冲液( 配方 见附录1 3 ) 。最后与p a 2 3 质粒混合，终浓度分别为2 0 0 n g g l 和1 0 0 n g g l 。注射之 前，将d n a 混合液重新离心，并且用h v - f i l t e r ( 0 2 2 9 m ) 过滤上清。在显微注射的过 程中，混合液需保存于4 。c 。 2 2 注射针的准备 用n e e d l ep u l l e r 将孔径l m m 的玻璃毛细管制作成注射用针。从每根针的后部注 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 第一部分 入0 8 p ld n a 混合液，置于空气中几分钟去除气泡，然后固定在显微操作器的支架上。 2 3 果蝇的扩增 2 5 c 培养y w 果蝇株，用来收集显微注射所用的卵。通常在显微注射前2 3 天， 准备3 个塑料敞口瓶，每瓶大概有1 0 0 0 只左右营养充足的果蝇( 孵化后2 3 天) ，瓶 中果蝇的密度大约3 4 只果蝇c m 3 。 2 4 果蝇卵的收集 在含有苹果汁和葡萄糖的琼脂板上涂布少量酵母浆，倒置于塑料敞口瓶上。2 5 0 c ， 1 0 分钟内收集果蝇卵。然后用毛刷在1 0 分钟内尽可能多的将果蝇卵在盖玻片上并列 对齐排成一列( 约5 0 7 0 个) ，且所有卵的首尾朝向一致。然后将盖玻片4 5 。倾斜后置 于显微镜下。 2 5 显微注射 用f e m t o j e t 维持一个稳定持续的注射压力，约10 0 0 h p a 。注射前将乙醇滴在盖玻 片上以防止果蝇卵萎缩。在显微镜下观察到果蝇卵时，将毛细管注射针头从果蝇卵的 后部刺入，d n a 混合液在持续的压力下从针头注入果蝇卵体内。一次注射在2 秒内 完成，一张盖玻片的卵在5 分钟内完成。注射完成后，将所有呈灰色的果蝇卵刺穿。 通常注射一个d n a 结构需要准备5 - 6 张含果蝇卵的盖玻片。每次注射结束后， 将盖玻片插入指管的培养基中，然后置于2 5 0 c 保湿器中直到果蝇卵成为成体。 结果 1 p c l 蛋白表达载体的构建 以携带n o t i 或s t u i 内切酶位点的引物，通过p c r 扩增p c l 基因。酶切后的 d n a 片段直接克隆接入p c a s 8 3h h f p r e s c 载体的n o t i s t u i 酶切位点。构建了 p c a s 8 3p c le 表达载体，含有可以编码c 末端8 x h i s h a f l a g 表位标记的e d n a ( 图1 ) 图1 ，下部显示了插入d n a 后的果蝇基因组结构。 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 第一部分 f i g u r e 1 c o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o rc a r r y i n gc d n ae n c o d i n gd r o s o p h i l ap c l p r o t e i n t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c a s 8 3h h f p r e s c t ( 1 e f tu p p e rp a n e l ) w a sc o n s t r u c t e du s i n g p - e l e m e n tv e c t o rp c a s p e r - h s p 8 3 1 4 ，1 5 1 m u l t i c l o n i n gs i t e ( m c s ) f r o mp u a s t , a n d i n d i c a t e dt a g - s e q u e n c e st h ep c ra m p l i f i e dd r o s o p h i l ap c lc d n a ( r i g h tu p p e rp a n e l ) w a si n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o ra tn o t i s t u is i t e s e x p e c t e di n s e r t i o np a t t e r ni n t o d r o s o p h i l ag e n o m ei ss h o w n i nt h el o w e rp a n e l 0 8 琼脂糖凝胶电泳纯化后的p c a s 8 3p c l e 重组质粒，在31 4 1 b p 左右可见目 的条带。说明该重组体p c a s 8 3p c l e 构建正确，如图2 所示。 蠹季 3 1 4 1 b p + 一- 蝴_ _ _ f i g u r e2 s c r e e n i n gp o s i t i v ec l o n e o f r e c o m b i n a n t p l a s m i dp c a s 8 3p c l e _ 1 ，2 ，3 ，4l a n e ：p o s i t i v ec l o n e h ， 5l a n e ：m a k e r 6l a n e ：c o n t r o l ( p l a s m i dp c a s 8 3h f p c l ) 1 2 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 p c a s 8 3p c l e 质粒经d n a 序列分析，结果与f l y b a s e 报道的p c l 序列完全相同， 结果见图3 ，全长数据未给出。 缀翮爨缫缀缀缀纛戮黼瀛戮蒺纛滋稳缫缀麓缀巍鬻鎏蓥荔蒸荔熏鬻娶愁翱啊翰曝灞霸嘲崤薯h 1 i 鞭黪霹黝魏黪鬻薷镢灏确鞠蕊蠛鞲麴躞黪鬻蓐萄 ；蠹壅隧囊瓣黝i 藕辅蔫薹羹整_ l j 糍鬻豁翻醚斟酬鬻黼繁瑷i 巍i 嚣裁蹙鬻露凝臻 氇裳彰絮漕阜蕊i 麓謦 氍羲鞔# $ ? 聋蕊熹： 冀谗慧蒋i 巍蝇女巍a ，嚣甍壤凌觏醛婚释t 薷謦篝 濑缀赫瀛。麓锄缀磁赫妊赫赫磊嬷赫藤蕊蕊缀 簟。? i 謦骥鼍寰g 耄i 冀。7 曩尊篆。一*。毪碧；ji i _ | i ，嚣絮芝警；茹；翳* i i 鬻萋 f i g u r e3 s e q u e n c i n go fp c a s 8 3p c l e n o t ia n ds t u is i t e ( f u l ll e n g t hd a t an o ts h o w n ) 2 p c l 转基因果蝇系的建立 将约3 0 0 只果蝇胚胎经过显微注射后装入管形瓶中，2 5 孵育1 0 天。大约有 1 2 的胚胎成活并发育为成年果蝇，即有3 8 只g o 子代。该成活率相对较低，因为 通常3 0 - 6 0 注射胚胎能够得以成活，作为g o 子代。 将成活的每只g 0 果蝇与4 5 只带有第二染色体平衡器的y w ：c y o g l a 果蝇交配。 2 周后，从3 8 株g o 果蝇系获得了8 株呈现红眼特征子代果蝇系，证明为阳性的种系 转染( 该子代为g 1 ) 。然后在8 株g 1 果蝇系中，从每株中挑选一只雄果蝇再与 y w ：c y o g t a 果蝇交配得到f 1 果蝇系。根据f 1 果蝇系表型判断a 因子插入的位置， 如图4 所示。我们选择了4 株p 因子插入第二染色体的杂合f 1 果蝇系，各自相互交 配后得到纯合子。最后获得了2 株尸因子插入第二染色体的纯合果蝇系。 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第一部分 韵狰删嘲w 弹峪 8 铷苏，修白锄鑫，譬 8 脚跏们m 嘲秘i 删 g 1 州蚋鑫妒修c d 锄孕 扩、 f 1 籼d 弦蝴q 糟钟铀 帮键l e a s t 钟i - a t s r e d 妒w i t h 白伦l i n d 铀 8 ， 2 一a h r m n o m m 舱 n o 埔抽 l 1 n0 勃w n o 拳o 玎 艟协麓蛾 a n 盯舶括f o t m d l 一霉h 阳哪弼噶o 嘲赡 f i g u r e4 s t r a t e g yf o ri s o l a t i o na n de s t a b l i s h m e n to f t r a n s g e n i cf l y g o ，a d u l t sd i r e c t l yr a i s e df r o mi n j e c t e de m b r y o s g 1 ，g e r ml i n e t r a n s m i t t e dp r o g e n i e sf r o m g o f 1 ，p r o g e n i e sf r o mc r o s s i n gb e t w e e ng 1a n dy w ：c y o g l a f l i e sc a r r y i n gp - e l e m e n ti n o t h e rt h a n2 n dc l l r o m o s o m e ( f o l l o w e dt ob l a c ka r r o w s ) c a l lb ep r o c e s s e dt on e x tc r o s s e s w i t ht h e f l yc a r r y i n g e i t h e rt h e1s to rt h e3 r db a l a n c e rc m o m o s o m e st o g e n e r a t e 1 4 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析第二部分 第二部分p c l 蛋白复合体的表达和分析 已知在胚胎形成过程中，p c l 蛋白复合物呈现动态变化。为了研究p c l 蛋白与 p c g 蛋白在基因表达调控中的相互关系，我们利用已经构建成功的果蝇表达系，进行 染色体免疫组化分析，检测p c l 蛋白的表达表达水平。应用免疫沉淀法对p c l 蛋白 进行纯化，并分析其相应的生物学功能。 材料和方法 一、材料： 1 主要试剂： 甲醛，乙酸，p b s ，t b s ，1 0 t r i t o n - 1 0 0 ， 鼠抗f l a g 单克隆抗体( s i g m a ) ，p o l y c o m b 羊多抗( s a n t ac r u z ) ，p c l 兔多抗 由n i g 个体遗传研究室表达后送公司制备。 混合蛋白酶抑制剂( s i g m a ) ，抗f l a gm 2 琼脂( 聚) 糖小球( s i g m a ) ，s u p e rs i g n a l w e s tp i c o 化学发光素( p i e r c e ) 2 实验动物： 黑腹果蝇三龄幼虫由n i g 个体遗传研究室培养 突变株p c l l l s m 5 来自果蝇遗传中心( d g r c ) 黑腹果蝇冷冻胚胎 3 主要仪器 双筒解剖镜，光学显微镜，荧光显微镜( o l y m p u s ) 超速冷冻离心机( e p p e n d o r f ) j 2 h c 离心机( b e c k m a n ) ，超速离心机( b e c k m a n ) l a s - 4 0 0 0 成像仪( f u j if i l m ) 二、方法 1 免疫组化 1 1 唾腺染色体制片 转基因果蝇系的建立及其重组蛋白p c l 的表达和分析 第二部分 ( 1 ) 检查幼虫培养瓶，取一适龄幼虫，置于载玻片上，并加上一滴生理盐水( 如 幼虫带有饲料可先用生理盐水洗净) ，置双筒解剖镜下检查。熟悉幼虫结构，幼虫具 一钝尾和带黑色口器的尖头端。 ( 2 ) 在解剖镜下用两支尖头镊子，一支夹住幼虫头部，夹点尽可能靠头部口器 处。 ( 3 ) 幼虫头部固定之后，再用另一尖头镊子夹住尾端，平稳快速一拉，使口器 部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺也随之而出。唾腺是一对透明的香蕉 状腺体，仔细观察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。 ( 4 ) 分离的腺体可能伴有消化道和脂肪体。在载玻片上再加一滴