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现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究 专业：动物学 博士生：车静指导老师：赵尔宓院士 摘要 蛙科动物是世界上物种最丰富的两栖类群之一，目前包括约7 0 0 多个物种。 蛙科动物中存在大量的同型性现象，这种形态上的保守给传统的分类学带来了 很大困难。除了南美洲南部以及澳洲的大部分地区，蛙科动物几乎是全世界分 布的，这种广布性使蛙科动物易成为研究生物地理的良好的模式生物。 本论文以核基因和线粒体基因片段为分子标记，从不同的分类阶元，对现 生蛙科动物部分物种的系统发育关系进行了研究，对现有的分类系统提出了一 些修订意见，同时探讨了相关的生物地理学问题。 本研究的内容主要包括以下三个方面： 1 运用两段核基因和线粒体数据探讨了中国蛙科动物的系统发育关系。现 有核基因的数据结果支持目前中国蛙科物种两个亚科的划分，即蛙亚科 和叉舌蛙亚科。费等( 1 9 9 0 ) 建议的浮蛙亚科应该作为一个属放入叉 舌蛙亚科；同时杨等( 1 9 8 9 ) 0 3 建议的湍蛙亚科也应该以一个属放入蛙 亚科。通过我们得到的分子系统发育关系与前人工作的比较研究表明， 对中国蛙科物种种上水平的划分需要在增加其它基因片段的同时，增加 样本数量，以期得到一个让人信服的分类系统。 2 以本研究所得到的蛙亚科物种序列为基础，结合来自g e n b a n k 上已经发 表的其它蛙亚科物种序列，运用两段核基因和两段线粒体数据对蛙亚科 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 物种的系统发育关系进行了研究。研究表明目前的联合数据集( m t + n u ) 支持蛙亚科的单系( d u b o i s ，2 0 0 5 ) 。1 ，由两个族t r i b e s 组成 ( s t a u r o i n i 和r a n i n i ) 。同时我们的结果不排斥蛙亚科内三个属的 划分( s t a u r o i s ，蛙属r a n a ，和湍蛙属a m o l o p s ) 。拟湍蛙属 p s e u d o a m o l o p s 的分类地位不被支持。值得注意的是目前的湍蛙属物 种a m o j o p ss e n s ul a t o ( d u b o i s ，1 9 9 2 ) “1 恢复成并系，由两个大的亚 枝组成。尽管支持率较低，蛙属的单系性仍然能够得到支持。建立在 目前的系统发育关系上，我们建议了一些新的分类改变。由于蛙亚科 物种的广泛分布，最后我们仅仅在r a n i n i 族里建议了十一个支系。我 们认为一个合理的分类系统必须等待更多的物种样本被研究以后才能 最终确定。另外，我们的研究表明蝌蚪腹吸盘的出现在蛙亚科不同的 支系中是多次独立进化的事件，是受到相似的选择压力作用的结果， 因此物种的适应性器官在作为分类的重要指标时要特别的小心谨慎。 最后，本研究利用不依赖于分子钟假设的分子分歧年代测定方法，计 算了蛙亚科物种部分支系的进化时间，结合我们构建的系统发育树的 拓扑结构支持亚洲蛙亚科物种可能受印度次大陆与欧强大陆撞击的影 响发生了快速辐射事件。一个可能的从东、南亚开始扩散到欧亚大陆， 两次独立进入美洲的扩散被支持。 3 以本研究所得到的两段线粒体数据为基础，结合已经发表的东亚的林蛙 群物种( 多数为日本的林蛙物种) 序列，探讨了东亚林蛙群的系统发育 关系以及相关的生物地理问题。数据结果支持包括梭德氏蛙在内的所谓 林蛙群的单系性，但支持率不高。另外东亚核型2 n = 2 4 的林蛙群是一个 单系，由秦岭群体和东北亚群体组成。建立在目前的系统发育基础上， 我们建议将东北地区的原“中国林蛙”群体划分为东北林蛙。秦岭群体 需要在更多的样本居群的基础上做进一步的研究。 关键词蛙科动物线粒体核基因系统发育学生物地理 现生蛀科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 m o l e c u l a rp h y l o g e n i e so fs o m el i v i n gr a n i d s p e c i e s w a j o r ：z o o l o g y n a 巾e ：j i n gc h e s u p e r v is o r s ：p r o f e r m iz h a o a b s t r a c t a so n eo ft h em o s td i v e r s ea m p h i b i a ng r o u p s ，r a n i di n c l u d eo v e r7 0 0 s p e c i e s ，w h i c hd i s t r i b u t ea l lo f t h ew o r l d ，e x c e p ts o u t h e r ns o u t ha m e r i c a a n dm o s to fa u s t r a li a h i g hm o r p h o l o g i c a lh o m o p l a s ya m o n gr a n i dm a k e s t r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o nd i f f i c u l t a n d m a n y t a x o n o m i cr e v i s i o n s t r e a c h e r o u sw i t h o u tar e a s o n a b l ep h y l o g e n y d u et ot h ew i d ed i s t r i b u t i o n ， r a n i d a eh a sg r e a tp o t e n t i a lt ot r a c et h eg e n e r a le v o l u t i o n a r yh i s t o r y t h ep a t t e r no fb i o g e o g r a p h ya n dd i v e r s i f i c a t i o no fa s i a nr a n i ds p e c i e s c a nb eu n d e r s t o o db yr e c o n s t r u c t i n gt h e i rp h y l o g e n i e s i np r e s e n ts t u d y ， w eu s e dt w on u c l e a rg e n e s ( 叫) a n dt w om i t o c h o n d r i a lg e n e s ( r o t ) t o i n v e s t i g a t et h ep h y l o g e n i e s o fs o m e1i v i n gr a n i d s p e c i e s ， a n d t e n t a t i v e l ya d d r e s st h eq u e s t i o n sr e l a t e dt os y s t e m a t i c sa n d b i o g e o g r a p h y t h em a i nr e s u l t sa r ea sf 0 1l o w e d ： 1 p h y l o g e n ya b o u tr e p r e s e n t a t i r e s p e c i e so fc h i n e s er a n i dw a s r e e o n s t r u e t e d u s i n g t w on u c l e a r d a t a ( t y r o s i n a s eg e n ea n d r h o d o p s i ng e n e ) a n dt w om i t o c h o n d r i a lg e n ep a r t i t i o n s ( 1 2 sa n d 1 6 s r r n a ) p r e s e n t l y ，w es u g g e s t e dt w os u b f a m i l i e s ( r a n i n a ea n d d i c r o g l o s s i n a e ) f o rc h i n e s er a n i ds p e c i e s ，a n dt h eg e n u sa m o o p s s h o u l db er e t a i n e di ns u b f a m il yr a n i n a er a t h e rt h a ne l e v a t i n ga s 现生蛙科动物部分物种韵分子系统发育研究四川大学博士学位论文 o n ed i s t i n c t s u b f a m i l ya m o l o p i n a e ：a tt h es a m et i m e ，g e n u s o c c i d o z y g as h o u l da l s ob ei n c l u d e di ns u b f a m i l yd i c r o g l o s s i n a e r a t h e rt h a na sad i s t i n c ts u b f a m i l yo c c i d o z y g i n a e w ep r o p o s e d s o m et a x o n o m i c a lr e v i s i o nb a s e do no u rm o l e c u l a rp h y l o g e n i e s t h e c o m p a r i s o nb e t w e e np r e v i o u ss t u d i e sa n do u rd a t ai n d i c a t e dt h a t s o m eg e n e r ap r o p o s e db yf e ie ta 1 ( 1 9 9 0 ) s h o u l db ee x p l o r e db a s e d o ni n c r e a s e dt a x aa n dm o r eo t h e r g e n em a r k e r s 2 m a i n l yb a s e do no u rn e w l ym o l e c u l a rd a t a ，w ep e r f o r m e do n e c o m p r e h e n s i v ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i so ns u b f a m i l yr a n i n a eb a s e d o nt h es e q u e n c e so fa p p r o x i m a t e l y2k i l o b a s e ( k b ) f r o mt w o m i t o c h o n d r i a l ( 1 2 sr r n aa n d1 6 sr r n a ) a n dt w on u c l e a r ( t y r o s i n a s e g e n ea n dr b o d o p s i ng e n e ) d n af r a g m e n t s ，i nc o m b i n a t i o no f p r e v i o u sp u b l i s h e ds e q u e n c e sf r o mg e n b a n k o u rc o m b i n e dd a t a ( m t + n u ) w e l ls u p p o r tam o n o p h y l e t i cs u b f a m i l yr a n i n a ec o n s i s t i n g o ft r i b es t a u r o i n ia n dr a n i n ia sp r o p o s e db yd u b o i s ( 2 0 0 5 ) a 1 t h r e eg e n e r as t a u r o i & r a n a ，a n d a m o i o p s w i t h i ns u b f a m i l yr a n i n a e c o u l dn o tb er e j e c t e d g e n u sp s e u d o a m o l o p si si n v a l i d t h eg e n u s , 锄o l o p s ( s e n s ul a t o ：d u b o i s ，1 9 9 2 ) ”w a sp a r a p h y l e t i ca n dw a st h e s i s t e rt a x o nt ot h eg e n u sr a n a , w h i c hr e c o v e r e dt ob em o n o p h y l e t i c w i t hl o wn o d a ls u p p o r t b a s e do nr e s u l t sh e r e ，e l e v e nd i s t i n c t 1 i n e a g e s ( i n c l u d i n gt w od i s t i n c tc l a d e sf r o mn o r t ha m e r i c a ) w i t h i nt r i b er a n i n ia r er e c o g n i z e dt or e f l e c tt h ep h y l o g e n t i c h i s t o r ya n ds o m et a x o n o m i cc h a n g e sa r ep r o p o s e d o u rr e s u l t s s u g g e s tt h a tt h ea b d o m i n a ls u c k e ra so n ea d a p t a t i o nt ot o r r e n t s c a r r i e db yd i f f e r e n tt a d p o l e so fs p e c i e sh a so c c u r r e dm u l t i p l e t i m e si n d e p e n d e n t l yd u r i n gt h ee v o l u t i o n a r yh i s t o r yo fr a n i n a e b yu s i n gam o l e c u l a rc l o c k i n d e p e n d e n ta p p r o a c hf o ri n f e r r i n g d a t i n gi n f o r m a t i o nf r o mm o l e c u l a rp h y l o g e n y ，w ep r e s e n th e r et h e m o l e c u l a rt i m e s c a l ef o rr a n i n a ee v o l u t i o n l a c ko fr e s o l u t i o na n d s h o r tb r a n c hl e n g t hb a s a lw i t h i nr a n i n a ei n d i c a t eo n ep o s s i b l e i v 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究 j i i 大学博士学位论文 r a p i dr a d i a t i o na f t e rt h ec o l l i s i o nb e t w e e ni n d i aa n de u r a s i a t w od i s t i n c td i s p e r s a le v e n t s f r o me u r a s i at ot h en e ww o r l da r e s u p p o r t e d 3 b a s e do np a r t i a ls e q u e n c e so f1 2 sa n d1 6 sr i b o s o m a lr n ag e n e s ， w ee s t i m a t e dp h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p sa m o n gt h es o c a l l e d b r o w nf r o g so fe a s ta s i a t h ep h y l o g e n e t i ct r e e ss h o w e dm o n o p h y l y o ft h eb r o w nf r o g s ( r a n as a u t e r ii n c l u d e d ) ，b u tw it hl o wr e s o l v i n g a b i l i t y a 1 1s p e c i e so f e a s ta s i a nb r o w nf r o g sw i t h2 4 一c h r o m o s o m e c o n s t i t u t ef lm o n o p h y l y ( i n c l u d i n gq i n l i n gg r o u pa n dn o r t h e a s t e r n a s i ag r o u p ) 。r e l a ti v et or a n aa r v a l i sf r o me u r o p e ( 2 n = 2 4 ) “r a n a c h e n s i n e n s i s ”b e l o n g i n gt on o r t h e a s t e r na s i ag r o u ps h o u l db e c o n s i d e r e da sa n o t h e rs i n g l es p e c i e sr a n ad y b o w s k i i q i n l i n g g r o u pn e e df u r t h e rs t u d y ，i n c l u d i n gr a n ah u a n r e f l e n s i s ( l i a o n i n g ， c h i n a ) 、 k e y w o r d s ：r a n i d ， m i t o c h o n d r i a l g e n e ， n u c l e a r g e n e ，p h y l o g e n y b i o g e o g r a p h y v 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下 取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 雩参j 芬l 殆： i 蟹够 私安 现生蛀科动物部分物种的分子系统发育研究四川l 大学博士学位论文 第1 章绪论 1 蛙科动物研究概况 1 1世界范围内蛙科r a n i d a e 分类的研究历史简介 蛙科r a n i d a e 在分类系统上属于无尾n a n u r a ，新蛙亚且n e o b a t r a c h i a ，蛙 超科r a n o i d e a 。目前蛙科r a n i d a e 是两栖动物中种类数量较多的一个科，约占现 存蛙类物种的1 4 ( 7 0 0 多物种“1 ) ，除少数地方外，全球均有分布( 图1 - 1 ) 。同 时，因其在分类系统上盼相对复杂，蛙科r a n i d a e 是相关研究中常常被忽视的一 个类群( 近十多年来，蛙科的研究逐渐增多，特别是对于亚洲蛙类的研究) 。在 上个世纪早期，蛙科中包括更多的分类群，在后来的研究中很多类群被相继分 离出去组成新的科，例如，非洲树蛙科h y p e r o l i i d a e ，树蛙科r h a c o p h o r i d a e 作 为独立的科己被广泛接受，但是其它一些类群是否应该提升到科的水平还有待 于进一步验证，因为很多研究表明蛙超科中主要支系的系统发育关系仍然是模 糊不清的”1 “。 。 关于蛙科r a n i d a e 最早的分类系统主要建立在n o b l e ( 1 9 3 1 ) “”的基础上， 到目前已经经历了一些变化。这个分类系统在f r o s t ( 1 9 8 5 ) “世界两栖类物种” 中被引述”“。至此，蛙科被广泛的接受，即我们今天所谓的传统观念的蛙科 r a n i d a es e n s ul a t o 。在f r o s t ( 1 9 8 5 ) 的分类系统中，蛙科被划分为三个亚科 r a n i n a e 、m a n t e l l i n a e 以及p e t r o p e d e t i n a e ，但是随后r a n i n a e ， p e t r o p e d e t i n a e 两个亚科的单系性就受到了置疑”“。 在对蛙科的分类研究中，最弓l 入注目的是d u b o i s ( 1 9 8 7 ，1 9 9 2 ) 针对世界 范围内的蛙科物种建立了一个新的分类系统。d u b o i s ( 1 9 9 2 ) 将蛙科划分 为七个亚科：d i c r o g l o s s i n a e ，p t y c h a d e n i n a e ，p y x i c e p h a l i n a e ，r a n i n a e ， r a n i x a l i n a e ，r h a c o p h o r i n a e ，t o m o p t e r n i n a e 。f r o s t ( t 9 8 5 ) 1 ”的 m a n t e l l i n i n e s 和p e t r o p e d e t i n e s 两亚科则被d u b o i s ( 1 9 9 2 ) “1 从蛙科中划分 出去，提升为独立的科。这一分类系统以及树蛙科r h a c o p h o r i d a e 广泛的被认 可，使蛙科形成了一个并系“2 l - l ”。如果承认d i c r o g l o s s i n a e 和r a n i n a e 两个 亚科，那麽其它的一些分类单元就成为并系“。”1 。因此对于蛙科新建的很多亚 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 科来说，其有效性没有得到很好的验证。 到目前为止，蛙科物种的分类仍处在一个极其混乱的状态，一方面是由于 蛙类的高级分类阶元( r a n o i df a m i l i e s ) 不稳定，另一方面是由于r a n i d a e 内部各亚科之间的各种各样的合并使亚科的划分也不稳定。除此以外，更为混 乱的是d u b o i s ( 1 9 8 7 ，1 9 9 2 ) 的蛙科分类系统建议了许多新属和新的亚属。i n g e r ( 1 9 9 6 ) 指出d u b o i s ( 1 9 8 7 ，1 9 9 2 ) 分类系统存在四个较大的缺陷：其分类 系统大部分建立在表型的比较上大部分关于物种的信息是建立在已有的文 献描述上，而不是建立在对标本的检验上许多种的判定仅仅参考文献的记 录没有性状的分析。 对d u b o i s ( 1 9 8 7 ，1 9 9 2 ) 的分类系统的争议，主要原因是缺乏一个系统发育 分析基础。在近来的一些分子系统发育研究基础上，d u b o i s ( 2 0 0 3 ，2 0 0 5 ) 相 继对其旧的分类系统( d u b o i s ，1 9 9 2 ) 作了较大的改动。12 “，例如d u b o i s ( 2 0 0 5 ) 对蛙科的分类系统做了新的修订，将m a n t e l t i n i n ef r o g s 重新移入蛙科，共建 立了1 4 个亚科；此外对一些属进行了合并和移动，如属8 a t r a c h y l o d e s ( d u b o i s ， 1 9 9 2 ) 被移入c e r a t o b a t r a c h i n a e 亚科；属m i c r i x a l u s ( d u b o i s ，1 9 9 2 ) 被提 升为m i c r i x a l i n a e 亚科等。显然，d u b o i s ( 2 0 0 5 ) 对旧的分类系统做了很大的 改动和改进，但是这种行为本身就说明了其建立的整个蛙科的分类系统存在很 多问题。 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 图1 - 1 蛙科动物在世界上的分布范围( 阴影部分显示) “ 1 2 中国蛙科物种的分类研究简介 对中国蛙科物种的研究始于刘承钊与胡淑琴( 1 9 6 1 ) z 2 o 建立在形态解剖 学基础上，他们将我国的蛙科物种分为7 个属，包括蛙属r a n a ，倭蛙属n a n o r a n a ， 高山蛙属a i t i r a n a ( 目前已经合并入倭蛙属n a n o r a n a ) ，浮蛙属o c c i d o z y g a ， 湍蛙属s t a u r o i s ( 后来属名改为a m o l o p s ，原属名只限用于加里曼丹和菲律宾 的3 种蛙) ，逊蹼湍蛙属c o r n u f e r ( 目前中国无此属的物种) ，小岩蛙属 m i c r i x a l u s 。同时他们将中国的蛙属船门a 种类( 当时3 4 种) 划分为趾末端没有 横沟的真蛙类( r a n a ) 和有横沟的水蛙类( h y l o r a n a ) 。真蛙类包括真蛙群 ( t y p i c a e ) ，虎纹蛙群( t i g r i n a e ) ，大头蛙群( k u l i n a e ) ，林蛙群( t e m p o r a r a e ) 与棘蛙群( s p i n o s a e ) ；水蛙类则包括臭蛙群( l u c t u o s a e ) ，沼蛙群( g r a c i l e s ) 与纤蛙群( e r y t h r a c e a e ) 等。另外刘承钊与胡淑琴( 1 9 6 1 ) 还绘出了当时已知3 4 种蛙及其亚种的系统示意图( 图1 - 2 ) ，但是由于当时对属内各种的系统演化关系 尚不清楚，他们没有把蛙属进一步划分为属与亚属。随着世界范围内对蛙科物 种的重新划分，在前人研究基础上，费等( 1 9 9 0 ) 对中国的蛙科的分类系统 也作了较大改动：从大的分类阶元来讲，主要是将中国蛙科物种归为三个亚科， 蛙亚科r a n i n a e ，湍蛙亚科a m o l o p i n a ey a n g ，l9 8 9 以及新建浮蛙亚科 o c c i d o z y g i n a ef e i ，y ee th u a n g ，1 9 9 0 ；同时对中国的原“蛙属”种类进行了重 墨圭些型垫塑塑坌塑登塑坌三墨竺垄童翌塞婴型查兰堡主兰堡堡苎 新划分，将f r o s t ( 1 9 8 5 ) “”以及d u b o i s ( 1 9 8 7 ) “6 1 建立的亚属分别上升为陆蛙 属( e u p h i y ct i s ，后改为f e r j e r v a y a ) 、水蛙属( h y l a r a n a ) 与棘蛙属( p a a ) ，将 虎纹蛙群上升为虎纹蛙属( t i g r i n a ，后被纠正为h o p o b a c h a c h u s ) ，恢复使用 侧褶蛙属( 忍j o p h y a x ) ，新建腺蛙属( g a n d i r a n a ) 、臭蛙属( o d o r r a n a ) 、趾沟 蛙属( p s e u e o r a n a ) 与粗皮蛙属( r u g o s a ) ，并将蛙属的名称( r a n a ) 局限于原有 的林蛙群，其中文名改称林蛙属，再加上恢复了的大头蛙属( l y m n o n e c t e s ) ，就 将中国的蛙属划分为1 1 个属级阶元，连同扁手蛙属以及倭蛙属、高山蛙属和小 岩蛙属，共1 5 个属同归隶于蛙亚科r a n i n a e 。然而对于中国的这一分类系统，特 别是对于蛙属的再划分，并没有得到广泛的承认。d u b o i s ( 1 9 9 2 ) 除同意蛙属 r a n a ，大头蛙属l i m n o n e c t e s 二属外；也将p a al - 升为属，并将其中一部分种类 建立沙巴蛙屑c h a p a r a n a 。对于费等( 1 9 9 0 ) 新建的一些属，如水蛙属( h y l a r a n a ) ， 侧褶蛙属( p e l o p h y l a x ) ，腺蛙属( 6 1 a n d i r a n a ) ，臭蛙属( o d o r r a n a ) ，趾沟蛙属 ( p s e u d o r a n a ) ，粗皮蛙属( r u g o s a ) ，林蛙属( r a n a ) 仅作为亚属建议仍放置在 蛙属r a n a 中。赵( 1 9 9 6 ) ”1 介绍了当时代表世界范围内的蛙类的分类系统“两 栖动物的进化”一书( m a t s u i ，1 9 9 6 ) ，并据此将我国的蛙科物种进行了归类， 分隶于两亚科，叉舌蛙亚科d i c r o g j o s s i n a e ( 虎纹蛙属h o p l o b a c h a c h u s ，英蛙 属l n g e r a n a ，泽蛙属l i m n o n e c t e s ，浮蛙属o c c i d o z i g a 以及蟾舌蛙属 助r 脚o g l o s s u s ) 和蛙亚科r a n i n a e ( 蛙属r a n a ，高山蛙属a 1 t i r a n a ，湍蛙属 a m o o p s ，沙巴蛙属c h a p a r a n a ，倭蛙属n a n o r a n a 以及棘蛙属p a a ) 。费等( 2 0 0 0 ， 2 0 0 5 ) 2 4 “1 根据蝌蚪的形态将梭德氏蛙复合体从传统的林蛙群( f r o s t ，1 9 8 5 ) 中独立出来，另立拟湍蛙属p s e u d o n m o l o p s 放入湍蛙亚科。江和周( 2 0 0 1 a ) ”， j i a n g 和z h o u ( 2 0 0 5 ) 1 在线粒体研究基础上的分析结果表明费等( 1 9 9 0 ) 建立 的蛙亚科不是一个单系类群，从而认为我国的蛙科物种应归入d u b o i s ( 1 9 9 2 ) 建 议的两个亚科( r a n i n a e 和d i c r o g l o s s i n a e ) ，另外否定了湍蛙亚科的亚科地 位，赞成d u b o i s ( 1 9 9 2 ) 的观点仅将湍蛙类作为属归入蛙亚科r a n i n a e 。费等 ( 2 0 0 5 ) o ”将中国的蛙科物种重新划分为四个亚科：蛙亚科r a n i n a e ，叉舌蛙亚 科d i c r o g l o s s i n a e ，浮蛙亚科o c c i d o z y g i n a ef e i ，y ee th u a n g ，湍蛙亚科a m o l o p i n a e y a n g , 1 9 8 9 ，其中原隶属于蛙亚科的物种，如p a a ，n a n o r a n a 都被移入叉舌蛙亚 科。 4 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究 四川大学博士学位论文 豆盘比矗钢懈 置叫h 圮 b 珥口 盈4 日目蟹j 灯 置c 目两 f n p n d ， l tc 雨 i z 口e n 五f 兄，印a 叫z r p b 。哪i 且挂纽们霸靠盔目吐啦 r p k m t 幽l 且糟姆h h 届盘垃 豆习以 d m 冠如吐曩，叫 足月4 c _ l 碗 且，姊! 妇， 矗脚 且a _ d 叠 尼月耻婚似 置丑融轴翻埔髓凼 见衄删彘瞄盘 置量m 挫 兄事口铡 且a d a ，$ 删 丑，= j j m 口m 请e 一 豆刀托 譬盘删豳 j 兄丑刊皿旺 皿曩坤豳t d 虚 4 置日妇m 哇蚴 置j 目吐删 置口d 田t q p 西啊，曩 冠如瞳曩e 矗蠡 丑趣咄m 灯 冠 口，i 丘翻固n 响日耐， j t 月h a 吐哟l 真蛙类 r a n a 水蛙类 h y l o r a n a 图卜2 中国蛙属物种( 3 4 种) 及其亚种的系统示意图乜2 “1 1 3 蛙科物种为生物地理研究提供了非常好的材料 t h eb i o l o g i c a lw o r l di sr i c h l yd i v e r s ei np h y l o g e o g r a p h i cp a t t e r n s a n ds p e c i a t i o n a lm o d e s j o h nc a v i s e 系统地理学p h y l o g e o g r a p h y 是一门新兴的学科，由j o h nc a v i s e 倡导提 出。通过建立某些物种及群体的系统发育关系，同时结合地理分布状况，能够 允许我们从生物的分歧演化中理解其地理分布模式的形成。生物系统地理学的 堡竺壁型垫塑塑坌塑苎箜坌三墨竺垄宣堡塞婴型查兰苎主兰垒丝塞 观点之一就是生物的进化与地质演化是同步的，因此建立在生物物种的系统发 育以及群体遗传的基础上，运用生物系统地理学方法可以让我们对地质变迁有 很好的了解，对地质假说进行验证，以及提出新的地质演化假说。众所周知， 两栖类的移动能力相对于其他的陆生脊椎动物较差，越海扩散几乎是不可能的， 而地壳的运动，还有海平面的变化都可能改变现生蛙类的分布；岛屿，高山， 沙漠，水域以及海峡都能有效的形成屏障，造成其分布的间断化，这样同一祖 先的不同群体，由于这种地理因素的影响，经过足够的时间后，彼此产生了生 殖隔离，逐渐就发展成新的物种。b o s s u y t 和m i l i n k o v i t c h ( 2 0 0 1 ) 嘲研究表明 现生欧亚大陆的蛙科动物大部分是从印度次大陆起源扩散到其他大陆去的，从 而提出蛙科动物“走出印度o u to f i n d i a ”假说，这一论点使蛙科动物成为继哺 乳动物以后，符合“走出印度o u t o f i n d i a ”假说的又一具有相似生物地理现象 的脊椎动物类群。 另外东亚地区是一个岛屿分布较广的区域，两栖动物在大陆和岛屿广泛分 布，一个典型的例子就是m a t s u i 等( 2 0 0 5 ) 汹7 对亚洲臭蛙群的研究。通过对臭蛙 群系统发育关系的建立，结合相关的地理信息讨论了亚洲大陆与附近岛屿特别 是与日本群岛之间的臭蛙群的多次迁徙的问题，从而侧面证明了大陆与周围岛 屿之间曾经经历过多次连接。 因此从推断的蛙类的系统发育关系并结合地理分布状况，我们可以很好的 推溯其起源，迁移，和分化，同时对地质假说进行印证和检验，甚至提出新的 地质演化学说。 2 分子系统发育研究简介 2 1线粒体和核基因在蛙类系统发育重建中的运用 线粒体基因组是一种双链环状d n a 分子，存在于生物细胞质的线粒体中。现 有数据显示所有高等脊椎动物的线粒体基因组拥有同样的3 7 个基因，它们在环 型d n a 分子上的排列改变仅仅是少数基因相对位置的改变。这种相对的保守暗 示线粒体的基因顺序特征能潜在作为高等脊椎动物阶元的系统发育标记。高等 动物线粒体基因组大小为1 6 k b 左右，一般包括1 3 个蛋白质编码区，即细胞色 素b ( c y t 6 ) ，细胞色素氧化酶的3 个亚基c o xi 、i i 、i i i ，a t p 酶的2 个亚 基( a t p a s e 6 ，a t p a s e 8 ) ，以及n a d h 脱氢酶的6 个亚基的编码序列n d l 6 ，以及 6 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 n d 4 l 。另外还有2 个r r n a 基因，包括1 2 s r r n a ，1 6 s r r n a 。还有2 2 个t r n a 基因 以及一段包括复制起点的控制区d - l o o p 。除个别基因外，这些基因都是按同一 个方向进行转录，而且t r n a 基因位于r r n a 基因和编码蛋白质的基因之间。线 粒体d n a ( m t d n a ) 具有间隔序列短，无内含子( 图1 - 3 ) ，非编码序列少等特点。 高等动物线粒体绝大部分是从母系继承下来的，如人的受精过程中，由于 卵细胞中含大量线粒体而精子中含量极少，因而个体细胞中的线粒体可认为仅 来自母系，由父系传递给后代的线粒体几乎没有，即使某些种类偶尔在很低的 水平发生父系传递，合子中也存在一种机制把父系线粒体降解掉，同时线粒体 dna 在遗传给下一代时并不发生变化，除非产生随机变异，变异发生的几率 相对稳定，因此线粒体dna 具有严格的母系遗传。动物线粒体d n a ( m t d n a ) 与核基因大部分情况下存在平行进化关系，同时具有严格的母系遗传，其存在 突变率高、突变固定后形成的d n a 多态位点可反映出群体遗传结构、种群分化 和种属关系等特点；另外，m t d n a 在动物个体内具有组织均一性、细胞内含量 丰富、易于抽提等特点，使其成为研究系统发育首选的遗传标记。目前在无尾 类分子系统发育研究中广泛被使用的线粒体基因包括1 2 s ，1 6 sr r n a ，t r n a 以 及细胞色素b ( c y t 功等基因。 尽管线粒体基因组有上述很多的优点，然而我们也应该认识到正在被广泛 使用的各线粒体基因片段不是相互独立的，而是来自于一个共同连锁的单位遗 传。因此近来在两栖类的研究中已经开始挖掘具有不同遗传特性的核基因。到 目前为止，核基因序列在两栖类的系统发育研究中的应用还远远不够，尽管线粒 体和核基因相互矛盾的例子很少，但是在其他动物中已经发现了二者不一致的 例子”。因此基于多个独立进化( 不连锁) 的基因组信息越来越引起重视，核基 因可能蕴藏的巨大潜能正在被关注。一般来讲，线粒体基因的核苷酸替换比核 基因快5 - 1 0 倍。因此核基因一般在解决较高的分类阶元中被广泛的应用。两 栖类核基因的应用目前主要集中在视网膜色素基因外显子1 ，4 ( e x o nl ，4o ft h e r h o d o p s i ng e n e ) ，酪氨酸酶基因外显子1 ( e x o n1o ft h et y r o s i n a s eg e n e ) ， 重排活化基因：r a g 一1 和r a g 一2 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 图卜2 黑斑蛙线粒体基因组的一般结构示意图娜1 2 2 系统发育学研究常用的构建基因树的方法 传统的系统发育构树方法主要分成两类，分别是基于具体性状特征( d i s c r e t e c h a r a c t e rm e t h o d ) 和基于遗传距离的构树方法( d i s t a n c em e t h o d ) 。前者包括最 大简约法( m p ) ，最大似然法( m l ) ，以及最近发展起来的贝叶斯分析方法 ( b a y e s i a nm e t h o d ) 。后者中以邻接法( n j ) 最为常用。 最大简约法( m a x i m u mp a r s i m o n y ) 源于形态学性状研究。他的原理即假设 由一祖先位点替换为另一位点时，发生的替换数目最少的事件为最可能发生的 事件。在应用中，m p 法只考虑信息位点，所得的进化树最短、变化最少。m p 法 不需要估计核苷酸替换时所用的各种数学模型。当每个核苷酸位点没有受到进 化杂音的影响，如回复突变或平行突变，且序列长度较大，或分类群之间的序 列分歧程度不高，该方法能够获得更为真实的系统树。但是实际上，核苷酸序 现生蛙科动物部分物种的分子系统发育研究四川大学博士学位论文 列通常受回复突变和平行突变的影响，当序列较短，或者序列间替代速率变化 较大的情况下，容易出现所谓的“长枝吸引”和“短枝吸引”效应，导致产生 错误的拓扑结构。m p 树的搜索策略有两种，严格搜索和启发式搜索。严格搜索 策略能够保证找到所有的m p 树，包括穷尽式( e x h a u s t i v e ) 和分支限界式 ( b r a n c h - a n d - b o u n d ) 搜索方法。但是当所分析的序列数较多的时候( 2 0 ) ， 通常我们将使用启发式搜索( h e u r i s t i c ) 以减少耗时，同时通过使用逐步加入算 法的程序首先建立一个临时树，然后对此临时树进行分支交换算法的检验来提 高获得m p 树的概率洲。m p 分析方法常常得到不只一棵最大简约树，这时，我 们就需要建立一个可以代表所有树的复合树，称为一致树，如严格一致树，通 常最常见的是5 0 多数一致树。 最大似然法( m a x i m u ml i k e l i h o o d ) 的原理是建立在一个特定的替代模型 基础上分析一组既定的序列数据，使获得的每一个拓扑结构的似然率均为最大， 挑出似然率值最大的拓扑结构作为最终