（分析化学专业论文）化学计量学算法在中药指纹图谱研究中的应用.pdf

摘要 随着现代分析技术的不断进步，中药的现代化研究也得到不断的 ， 发展和深入，其中中药质量控制是中药现代化、产业化以及国际化的 核心。尽管中药内含物质群是个很复杂的问题，但联用仪器及相关化 学计量学方法的快速发展为中药体系的分析与质量控制提供了强有 力的手段和广阔的前景。本文以实际中药体系为研究目标，利用化学 计量学的方法实现对中药指纹图谱的分析及中药质量控制的研究。 l 一一】 论文的第一章论述了近年来中药质量控制模式的发展状况，以及 中药指纹图谱、现代分析技术和化学计量学方法在中药质量控制中的 应用。 第二章基于相同的化学物质具有相同的光谱，在单组分光谱相关 色谱的基础上，提出了多组分光谱相关色谱的新方法。利用联用色谱 的光谱与色谱信息，借助化学计量学中的主成分分析和正交投影法实 现同种中药在不同实验条件下或不同种中药在相同实验条件下的色 谱指纹图谱中相关组分色谱峰簇的判断，为客观表征和评价中药指纹 图谱提供了实用、方便、可靠、有力的手段。 第三章系统地阐述了中药材灯盏花的色谱指纹图谱实验研究。内 容包括提取溶剂的选择，色谱条件的优化及方法学考察等，使建立的 色谱指纹图谱具备系统性、特征性和稳定性。这不仅为深入研究药材 的化学成分及质量评价提供理论依据，而且在实践中还能指导中药材 的g a p 种植与采收。 第四章针对中药色谱指纹图谱中存在的仪器误差和样本误差，采 用数据预处理、局部最小二乘与主成分投影等方法对不同来源药材的 色谱指纹图谱进行模式识别，进而鉴别中药材质量的真伪。 关键词化学计量学，中药指纹图谱，多组分光谱相关色谱，灯盏花， 化学模式识别 i i a b s t r a c t w i t ht h e d e v e l o p m e n t o f a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s a n dd e s i r a b l e p r o g r e s so f r e l e v a n tr e s e a r c h e sa b o u tt r a d i t i o n a lh e r b a lm e d i c i n e s ，b o t h t h e c o m p i l a t i o n s o fp h a r m a c e u t i c a la t t r i b u t e sa n dt h e c o m p a r i s o n o f c o m p o n e n t i a ld i s t r i b u t i o n so fh e r b a ls a m p l e sh a v eb e e nb e c o m i n gm o r e a n dm o r ei m p o r t a n tf o rt h em e d i c i n a l m o d e r n i z a t i o n ，i n d u s t r i a l i z a t i o n ， i n t e r n a t i o n a l i z a t i o n ，i np a r t i c u l a rq u a l i t ya s s e s s m e n t ，t os u p p o r tt h e i ru s e s w i t ht h e h e l p o fm o d e r n h y p h e n a t e d i n s t r u m e n t sa n dr e l a t e d c h e m o m e t r i c m e t h o d s ，i t i sp o s s i b l et od e a lw i t ht h e c o m p l i c a t e ds y s t e m s t h i sr e s e a r c ha i m sa tt h e a p p l i c a t i o n o fc h e m o m e t r i cm e t h o d st ot h e a n a l y s i sf o rg r o u ps u b s t a n c e si nr e a lh e r b a lm e d i c i n e si no r d e rt oq u a l i t y c o n t r 0 1 i nt h ef i r s tc h a p t e ro ft h i st h e s i s ，t h ed e v e l o p m e n tf o r q u a l i t yc o n t r o l o fh e r b a lm e d i c i n e sw a ss u m m a r i z e d t h e a p p l i c a t i o n o f c h r o m a t o g r a p h i c f i n g e r p r i n t s ，m o d e r na n a l y t i c a lt e c h n i q u e s ，a n dc h e m o m e t r i cm e t h o d sa r e v e r yu s e f u lt ot h eq u a l i t yc o n t r o lo f h e r b a lm e d i c i n e s i nc h a p t e r2 ，m u l t i c o m p o n e n ts p e c t r a lc o r r e l a t i v e c h r o m a t o g r a p h y w a sp r o p o s e da san e wm e t h o db a s e do no r t h o g o n a l p r o j e c t i o n a n d c o r r e l a t i v e c h r o m a t o g r a m i n o r d e rt oe l i m i n a t et h ei n f l u e n c ef r o m h e t e r o s c e d a s t i c n o i s e ，t h e c o s i n ev a l u eb e t w e e n t a r g e tc o m p o n e n t s p e c t r u m a n di t s p r o j e c t e d r e s i d u ew a s a p p l i e d t od e t e c t s p e c t r a l c o r r e l a t i v ec o m p o n e n tc h r o m a t o g r a p h i cc l u s t e r so f d i f f e r e n tf i n g e r p r i n t s o f h e r b a lm e d i c i n e s i tc o u l d p r a c t i c a l l yf a c i l i t a t eq u a l i t a t i v ee v a l u a t i o no f h e r b a lm e d i c i n e s i n c h a p t e r3 ，t h ec h r o m a t o g r a p h i c f i n g e r p r i n t o f e r g e r o n b r e v i s c a p u sh e r b a ls a m p l ew a si n v e s t i g a t e da n de s t a b l i s h e db yu s i n g m a n y e x t r a c tm e t h o d sa n d o p t i m i z i n ge x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h er e s u l t w a si m p o r t a n tf o rt h ef u r t h e rs t u d yt ot h ec h e m i c a la n a l y s i sa n d q u a l i t y c o n t r o lo f e r i g e r o n b r e v i s c a p u s i n c h a p t e r4 ，d a t ap r e t r e a t m e n t ，l o c a ll e a s ts q u a r e sa n dp r i n c i p l e c o m p o n e n ta n a l y s i sw e r ea p p l i e d t oc h e m i c a lp a t t e m r e c o g n i t i o n f o r q u a l i t a t i v e l ya n a l y z i n g t h ec h r o m a t o g r a p h i c f i n g e r p r i n t so f v a r i o u sh e r b a l s a m p l e so f e r i g e r o nb r e v i s c a p u s t h ec l a s s i f i c a t i o no f t h e md e m o n s t r a t e d t h a tm o s to ft h et e s t e ds a m p l e sh a v eg o o ds i m i l a r i t i e sw i t ht h ec o m m o n p a t t e r nf i n g e r p r i n to f t h er e g u l a rs a m p l e sa n ds o m ew e r ei n f e r i o ro re v e n s p u r i o u s ，a p p e a r i n ga p a r tf r o mt h er e g u l a rs a m p l e sa tt h ep r o j e c tp o s i t i o n i np r i n c i p l ec o m p o n e n t a n a l y s i s t h i sp a t t e mr e c o g n i t i o nw a s a l s oa g o o d w a yt ot h ei d e n t i f i c a t i o na n de v a l u a t i o no fe r i g e r o nb r e v i s c a p u sa n d m i g h tb eo fp r a c t i c a lv a l u ef o rc o n t r o l l i n gt h eq u a l i t yo ft r a d i t i o n a lh e r b a l m e d i c i n e s k e yw o r d s c h e m o m e t r i c s ，f i n g e r p r i n t s o fh e r b a l m e d i c i n e s ， m u l t i c o m p o n e n ts p e c t r a l c o r r e l a t i v e c h r o m a t o g r a p h y ,e r i g e r o n b r e v i s c a p u s ，c h e m i c a lp a t t e r nr e c o g n i t i o n v 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南 大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本 研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 日期：年一月一日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅：学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根 据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名： 导师签名日期：年一月一日 硕士学位论文第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 在人类健康的宝库中，维系华夏民族五千年健康的中医药一枝独秀，是中华 文化的奇葩。中医药在几千年的医疗实践中逐渐形成了自己独特的理论体系，其 卓越的临床疗效众口皆碑，并远传东南亚乃至全世界。随着2 1 世纪生命科学的 蓬勃发展与人们崇尚回归自然的热潮，及我国加入世界贸易组织进程的不断推 进，为中药走向世界提供了前所未有的机遇和挑战n 咖。我国作为天然药物的故 乡，有方剂九万余首、中成药五千余种、中药剂型三十五大类四十三种、药材一 万两千八百零七种，并有雄厚的中医用药理论和丰富的临床用药经验，但我们的 中药在国际天然药物市场中仅占3 5 的份额，且绝大多数还是原料初级品，而 复方药，中成药要获得国际医药权威组织认可更是难上加难。中药现状的落后， 很大程度是因为我国的中药产业基础较差，现代化水平较低，中药材质量不稳定， 部分中药材的重金属和农药残留量超标，最重要的原因是我国中药的质量标准体 系不够完善，控制方法和检测手段比较落后。中药现代化是使中药走向世界的基 础和关键，而中药现代化必须立足于中药的质量控制，高质量、稳定可靠的中药 材或中成药是以保证中药现代化为核心的系统工程的重要组成部分。只有对中药 材进行现代意义下的科学的质量控制，才能更好地保证中药饮片和中成药的质 量，实现中药的安全、有效、稳定、可控，为中药走向世界奠定良好的基础【7 - 9 。 1 2 中药质量控制与中药指纹图谱 1 2 1 中药质量控制模式的发展状况 自晋代葛洪在肘后备急要方首次提出“成药”概念以来，中成药已经有 一千七百年历史。中医将每一味药材视为一个单一的不可分割的“个体”，将其 药理作用按照“性”“味”归结为寒、热、温、凉，升、降、浮、沉以及酸、甘、 苦、辛、咸。复方方剂是几个“个体”组合的“群体”，归结为“君、臣、佐、 使”的关系，使之各司其职，发挥不可分割的整体作用。虽然经过历代的发展和 演绎，中医药形成了一个有着浓厚古典自然哲学思想与民族文化背景的理论体 硕士学位论文第一章绪论 系，但是受到人的认识能力、生产水平与科学技术条件的限制，中成药在内在质 量的控制方面一直缺乏有效的检验方法与手段。过去，对于药材的真伪优劣只能 通过感官对整味药材分辨其形态气味，对制剂制备的质量控制，由于没有科学的 检测手段，则认为“丸散膏丹，神仙难辨”。中成药的功效，主要依靠原料药材 的道地性和药工制作的经验性予以保证。 直到二十世纪六十年代徐国均先生提出显微鉴别方法后，药材的质量控制才 有了一定的标准。随着现代分析技术的不断进步，中药材与中成药内在化学成分 的研究手段与分析方法越来越多，越来越好。但现行的中药质量控制模式基本上 是沿着天然药物化学的发展引发分析工作者建立以测定中药某一有效成分为目 标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控 制方法，借鉴化学药品质量控制的模式，借助于文献报道选定某一中药的“有效 成分”、“活性成分”或“指标成分”，建立相应的理化鉴别，再发展到以光谱、 色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。2 0 世纪7 0 年代咀后紫外( u v ) 、红外 ( i r ) 等光谱技术，薄层色谱( t l c ) 、气相色谱( g c ) 、高效液相色谱( m ，l c ) 等色谱技术逐渐广泛渗透到中药原料、制剂及大生产商品的质量研究和控制的应 用中，随着中国药典1 9 8 5 、1 9 9 0 、1 9 9 5 以及2 0 0 0 年版的不断制订、修订、增订 以及新药审批办法的实施，这种模式的中药分析方法和质量标准被大面积普 及推广，并逐步提高和改进。半个世纪以来，这种模式的质量标准在中药材及中 成药生产、研究和市场商品的监督管理、优化生产工艺、控制药品质量、评价商 品真伪、整顿中药市场等方面，至今起着不可替代的重要作用。 但是这种以单一化学成分分析的观点，导致人们力求把中药( 天然药物) 这 一综合的复杂的“整体”分解成便于观察和研究的简单的“单元”或“分子”， 以便于清楚明确的研究。但对于中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，检测 任何一种活性成分均不能反映它所体现的整体疗效。中医辨证施治用的是药味而 非某个化学成分。麻黄素与麻黄、甘草酸与甘草、人参皂甙与人参等在中医看来 是两回事。中药的“补气”、“活血”、“温里”、“发表”、“滋阴”、“健脾”等功效， 是药材饮片或成药方剂内含物质群的整体作用结果。所以要控制中药的功效，不 能只针对某几种化学成分，必须对方剂的物质群整体予以控制【l “。在尚不清楚 中药全体化学成分的情况下，用现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得的 指纹图谱，实现对物质群整体的控制的思想应运而生。 硕士学位论文第一章绪论 1 2 2 中药质量控制与中药指纹图谱 经过多年来的植物化学和中药药理药效研究，其中特别是近几十年来对中 药药效的深入研究l l ”，人们已经认识到任何单一的活性成分或指标成分都难以 评价中药的真伪和优劣。利用现代先进的分析技术来分析中药药材和中药复方 的整体性，以更准确鉴别不同中药及识别中药本身的真伪和优劣，就形成了中 药指纹图谱分析的原动力。目前，以指纹图谱作为中成药、草药提取物这类含 有混合物质群的质量控制方法，已经成为目前国际共识1 1 0 , 1 4 - 2 2 1 。美国f d a 在植 物药制品指导原则中( 征求意见用草案) 中允许申报者提供产品的色谱指纹图 谱资料。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会1 2 “、德国药 用植物学会1 2 2 l 也都把指纹图谱作为质控标准的内容之一。中药指纹图谱不仅是 一种质量控制模式和技术，更是一种进行中药理论研究和新药开发的模式和方 法。 准确的说，中药指纹图谱是不同于我们常规意义的“指纹”含义，实因常规 意义下的指纹强调的是绝对的“个体特异性”，据此可对任何犯罪嫌疑人指证和 控罪。恰恰相反，中药指纹图谱赖以鉴别中药的药材真伪和质量优劣所要强调的 却是作为药用植物物种的“共有特征性”。更值得指出的是，常规意义的“指纹” 分析的依据主要是来源于先天的遗传，而中药药用化学成分的指纹图谱分析依据 却主要是来源于该植物物种后天的代谢产物，且大多为植物的次生代谢物，它对 后天生长环境的依赖性很强，远比纯先天性遗传的“指纹”脆弱得多，故有中药 “道地性”和“最佳采集时间”之说。然而，植物的代谢过程仍受其物种先天遗 传的影响，所以，利用中药药用化学成分的指纹图谱是完全可以对不同药材种属 进行鉴别，对同种药材质量优劣进行评价的。 中药指纹图谱借用d n a 指纹图谱发展而来，最先发展起来的是中药色谱指 纹图谱谢培山先生对中药色谱指纹图谱给出了以下定义田】：中药色谱指纹图谱 是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。借以鉴别真伪、评价原料药材，半成品 和成品质量均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。这一定义 说明中药色谱指纹图谱是一种综合的、整体的鉴定手段，其功用范围在于鉴别真 伪、评价药材的质量均一性和稳定性。从其综合和整体性能看，它可准确且又可 量化地对药材进行真伪鉴别和质量评价，而从细节上看，中药色谱指纹图谱又是 很模糊的，尤其是对生药因为有“道地性”和“采集时间因素”的实际情况，使 人很难给出一个对所有药品都适用的共有峰和非共有峰的比例，更不能像西药那 样来要求一一对应。 硕士学位论文 第一章绪论 每一味中药材的特性和有效成分千差万别，通过提取这些特性，结合现代分 析技术手段，将中药材的特性和有效成分表征出来( 即指纹图谱) ，此过程是用 指纹图谱评价药材质量的基础和关键，研究思想可以通过以下方法学框来实现 ( 图1 - 1 ) 。 颈处理 巨1 一 二 一巨三田 图卜1 指纹图谱评价中药材质量的方法学 此过程包含上述框图中样品预处理和数据处理步骤。以经生药学鉴定的中药 材为研究对象，进行系统的化学成分和药理学研究。在中医理论指导下，选择能 反映中药材药效的药理实验，可以获取药理数据；在此基础上，用现代分析技术 硕士学位论文 第一章绪论 如：t l c 、t l c s 、h p l c 、h p l c m s 、g c 、g c m s 、h p c e 等对样品进行分析， 获取化学数据：将两部分数据用数学、化学计量学、计算机技术进行处理，最终 可以对上述选定的中药材质量作出客观评价，得出产地固定、品种明确( 必要时 固定采收季节和炮制方法等) 的优质中药材。在制定中药色谱指纹图谱时，必须 对样品进行恰当的预处理，对色谱实验条件进行优化等，同时还要进行严格的方 法学考察，这样才能使建立的中药指纹图谱满足系统性、特征性和稳定性的基本 要求。 将可知化学成分的中药指纹图谱与药理药效研究结果相对应起来，采用各种 现代基础和临床药理药效的研究方法，直接观察和解析进入各类医学和药学模型 后的血液、体液等中的色谱指纹图谱中各种化合物的浓度消长和代谢产物的变 化，得到中草药中单味药和复方制荆的多种化学组分与药效之间定量关系的基础 数据，继而将色谱中药指纹图谱中化学成分的变化和中药药效和药理结果从数量 上联系起来，才有可能开创出具有现代科学意义的基于中药色谱指纹图谱的中药 药效学，基于中药色谱指纹图谱的中药药代动力学，建立起具有坚实化学和药学 基础的现代中药学。所以，基于中药整体性化学表征的色谱指纹图谱的定性定量 的快速剖析，实际上就成为了中药理论科学化和中药产业技术标准化的核心技 术，其相互关系可由下述示意图简要表出 中草苟和中药复方削荆g a p 呻a n da l p 指纹l ! ! t - m - 中药懵藏掌 中药葑基与蓟代动力学中药作用机理 图1 2 中药色谱指纹图谱在中药产业技术标准化和中药理论科学化的核心地位示意图 由于中药色谱指纹图谱可较为全面地反映出中药材这样复杂混合体系中各 种不同化学成分浓度分布的整体状况，将它引入作为中药质控手段，将对生药培 育基地的建设( 中药材质量管理规范，g o o d a g r i c u l t u r ep r a c t i c e ，g a p ) ，对中药 生产工艺的改进和规范( 药品生产质量管理规范，g o o dm a n u f a c t u r ep r a c t i c e ， g m p ) 和中药成品的质量控制( 药物非临床实验管理规范，g o o dl a b o r a t o r y p r a c t i c e ，g l p ) 产生深远影响。只有对中药色谱指纹图谱的化学成分建立起快速 硕士学位论文 第一章绪论 定性和相对定量分析的新方法，较为全面的探明中药色谱指纹图谱的化学基础， 才能解决中药长期处于“丸散膏丹，神仙难辨”，难于得到国际药学界认同的被 动局面。正如任德权先生指出的那料。0 1 ，中药指纹图谱质控技术具有“四两拨千 斤”的功效，我们迎来的不仅是中药指纹图谱质控技术的应用，而且也是整个中 药事业、中药产业的现代化。中医药事业现代化和中药产业现代化的本质就在于 将中医药理论和实践牢植于现代科学所发现的物质基础之上。而中药色谱指纹图 谱质控技术的引入，则正是迈出坚实的第一步。 1 2 3 现代分析技术在中药质薰控制中的应用 中药质量的优劣，归根结底在于其形态、所含化学成分在种类和含量上的差 异，这种差异可以通过图像、色谱和光谱反映出来，因此现代分析技术的发展为 实现指纹图谱对中药内含物质群的总体质量控制提供了基础 2 4 。 紫外光谱( u v ) 是电子跃迁所产生的吸收光谱，它的谱形简单，吸收峰宽 为带状。由于分子中存在不饱和共轭基团，在紫外区就可产生不同的吸收，因此 可以利用中药所含组分的不饱和程度及含量的差异，引起其紫外吸收曲线的峰 位、峰强度的差别来鉴别中药。袁久荣先生仁5 】曾对不同药材的不同提取液的紫外 可见光谱进行过系统研究，发现它们确实可用于鉴别不同药材。红外光谱( i r ) 则反映的是中药材所含组分官能团的振动，可以根据官能团差异对中药材进行鉴 别1 2 6 j 。然而，由光谱表征中药的指纹图谱虽可用于鉴别不同药材，却很难像色谱 指纹图谱那样，可表达出中药材这样复杂混合体系中各种不同化学成分浓度分布 的整体状况，如在像中药这样复杂混合体系中某些组分浓度会发生变化或消长 口“，由于灵敏度和选择性的限制，将难以在光谱上明显而又准确地显示出来，故 在将其用于评价药材和各种药品( 如注射液) 的质量均一性和稳定性时会带来一 定困难，因此，国家药品监督管理局在技术要求中推荐使用色谱中药指纹图谱1 2 。 色谱技术一直以来都作为中药质量检测的常规分析技术，它可以很好地反映 化学组成及含量情况，其特点是分析能力强、速度快，能定性、定量地反映不同 中药间的差异。在我国2 0 0 0 年版的药典中收录了中药材和中药成方剂工9 9 2 种， 其中有3 8 8 种中药给出了量化指标的分析方法，在所给方法中，色谱占了绝大多 数，因而色谱法已成为中药质量控制的最主要的方法。薄层色谱法( t l c ) 一开 始以简单快速的鉴别为起点，2 0 世纪6 0 年代以后很快取代了纸色谱技术，至今 仍然在中药鉴别中应用频率最高 2 9 , 3 0 1 ，用固定波长对薄层的各个斑点作扫描的图 谱比目测的层析图谱更为客观准确，具有更好的指纹的鉴别意义。气相色谱法 硕士学位论文第一章绪论 ( g c ) 所得的轮廓色谱，其重现性、分辨率相对较好，提供的信息量大，操作 简便，样品只需简单化学处理，而且由于是封闭系统色谱，外界影响因素较少， 稳定性较好，检测设备可选性较大，此外，还能与项空进样和固相微萃取技术联 用，因而特别适合于挥发性药材及制剂的鉴别和含量测定 3 1 - 3 3 l 。高效液相色谱法 ( h p l c ) 具有很高的分离度，适合于非挥发性物质的分析 3 4 - 3 7 】，其优点在于： 使用的检测器种类多，紫外检测灵敏度高；组分收集容易；联用技术较成 熟；熟练技术人员多：定量精密度较高( r s d 1 ) 等。 毛细管电泳( c e ) 是较新的方法，是以高压电场为驱动力，以毛细管为分 离管道，依据样品中各组分之间电泳速度或分配行为的差异而实现分离的液相分 离技术。毛细管电泳用于检测中药指纹图谱【3 s 】，其优点在于：柱效高( 1 0 s 理 论板数) ；分析速度快，进样体积小( 纳升级) ；适于直接分析水溶液，可直 接分析“脏”样品；大小分子可同时分析，毛细管极易清洗；开发新方法较 快，仪器维护简单等。 高速逆流色谱技术( h i g h - s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a l o g r a p h y ，简称 h s c c c ) 是当前国际上较新型的液液分配技术。该技术应用动态液液分配原理， 利用相对移动的互不混溶的两相溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配 比的样品组分离。它不使用固相载体作固定相，克服了固相载体带来的样品吸附、 损失、污染、峰型拖尾等缺点【3 9 1 。国内外已报道将高速逆流色谱技术应用于天然 产物的分离和分析。如将高速逆流色谱和质谱( h s c c c m s ) 联用。分析鉴定生 物碱、木脂素及三菇类化合物等，均取得了满意的结果【4 0 】。 质谱法( m s ) 是气态分子受到高能电子流的轰击，产生各种质量不同的阳 离子，这些质量不同的阳离子在电场和磁场的作用下，按质量大小排列成谱带被 记录下来。不同类型的化合物其质谱的裂解方式不同，根据主要碎片峰的组成可 以推断分子的结构类型和部分结构。 x 射线衍射分析( x r d ) 应用于单一成分的鉴定历史较早，7 0 年代中期， 美国药典把x 衍射作为药物鉴定方法之一。8 0 年代末和9 0 年代中期，我国才开 始将x 衍射法用于中药鉴定，和中药材的分析计算研究，可望建立道地中药材 鉴定与质量评价的定量识别方法。其原理为：当某一物质进行衍射分析时，该物 质被x 射线照射而产生不同程度的衍射现象。物质的组成、晶型、分子内成键 方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果该物质是一混合物， 则所得衍射图是各组分衍射效应的叠加。只要这一混合物的物质组成是恒定的， 其衍射图就可以作为该混合物的特征图谱。x 衍射图指纹图谱具有快速、简单、 图谱指纹专属性强，信息量大，所需样品小等优点。 硕士学位论文第一章绪论 1 9 8 1 年日本学者奥山彻等首先提出用核磁共振氢谱对中药材进行分类并用 来鉴别中药材的真伪。由于不同种中药材所含化学成分的种类和数目不同，因此 氢质子的数目和种类不同，经核磁共振仪测定，就会得到波形各异的氢谱。 d n a 指纹图谱多运用聚合酶链反应( f r c ) 从不同生物样品中人工合成d n a 片段，这种d n a 片段的大小、数目因不同生物而异，因而称之为d n a 指纹图 谱。由于d n a 分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型，所以结果 可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响，因此为中药品种鉴别 中极为可靠的手段。 图像分析鉴别法是近2 0 年来国际上兴起的一门新技术，可将不同层次的二 维图像经过计算机处理后，得到三维定量图像数据。由于中药材品种数量日益增 多，有的品种还有亚种和变种的存在，因此一些珍贵的中药材出现大量对照品， 若用人工凭经验鉴别方法就较难识别，因此可以来用c c d 摄像机直接对标本进 行采样，对采样图像输入图像分析系统，用特定的图像分析程序进行分析测定， 可以分别得到系列参数，如最大直径、最大横截面、周长、体积等。使用计算机 图文管理系统，对生药原植物图、生药标本图、药用部位图等图像标准化，建立 图文数据库，则可便于检索与鉴别。此方法的特点是准确、操作简便，消除了人 为观察或描述生药形态的误差，结果更为真实可靠、解决了生药鉴定中一般人工 方法难以解决的问题。 近年来联用色谱技术的发展，如高教液相色谱紫外二极管阵列联用仪 ( h p l c d a d ) 、气相色谱质谱( g c m s ) 、毛细管电泳紫外二极管阵列 ( c e d a d ) 、液相色谱质谱( l c m s ) 、液相色谱一核磁共振谱( l c - n m r ) 等 的出现，为复杂体系的色谱分析测定带来了重大的变革，由于这些联用仪器集分 离与分析技术于一身，可将一个很复杂的分析体系分解成为多个相对简单的子体 系，同时，由于光谱( 包括质谱、红外光谱、紫外可见光谱和核磁共振谱) 能提 供化学物质大量的定性信息，以及近年来发展的化学计量学多元分辨技术和容量 较大、方便查寻和使用的中药活性物质光谱波谱标准库的建立，因而为中药色谱 指纹图谱快速且可靠的定性定量定结构的剖析提供了新的机遇【4 l ”j 。 1 3 化学计量学在中药质量控制中的应用 化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) 作为一门新兴的化学分支学科，运用数学、统 计学、计算机科学以及其他相关学科的理论和方法，优化化学量测过程，并通过 解析化学量测数据以最大限度地获取化学及相关信息h 钔，它协助科学家阐明物质 硕士学位论文第一章绪论 的成分、结构与其性能之间的复杂关系。到目前为止，化学计量学已大致形成了 1 ) 分析信息与分析采样；2 ) 化学试验设计与优化；3 ) 分析检测理论与信号处理 方法；4 ) 多元校正与多元分辨；5 ) 化学模式识别；6 ) 计算机数字模拟法；7 ) 化 学构效关系的研究；8 ) 数据库检索；9 ) 人工智能；i o ) 统计学方法等十个研究 热点。化学计量学的最大特征是将多变量分析方法引入化学研究，这与中医思想 有相通之处，因而在中医药研究中发挥重要作用( 4 5 】。 1 3 1 多元校正、多元分辨技术与中药质量控制 中药本身所含化学成分复杂，即使是单昧药，也是一个很复杂的“黑色”或 “灰色”多组分分析体系1 4 6 j ，这就向分柝化学提出了一个难题，即需找到可快速 对未知复杂多组分进行同时定性定量分析的方法。联用色谱仪器将分离与分析技 术集于一体，是目前分析功能最强的一类新兴高维仪器，可作为进行中药单味药 和复方药分析的首选分析仪器。然而，对于上述联用分析仪器，往往一个样本就 能产生极大量的数据，这些数据的解析和化学信息的有效提取就成为分析化学面 临的一个难点。化学计量学多元校正与多元分辨的复杂多组分解析方法的出现， 为分析化学家提供了很多新机遇，如复杂色谱峰体系纯度检验、重叠色谱峰中组 分数的确定及纯色谱与纯光谱的获得成为可能，这将为黑色分析体系的定性定量 解析提供全新思路。 近年来在自模式分辨算法1 47 】的基础上，发展了大量化学计量学多元分辨技 术，按其求解思路，大致可以分为两类：第一类，首先确定一组较好的初始解， 通常称之为纯变量【4 ”，然后再基于叠代或变换优化，得到纯光谱和色谱。代表性 的例子有g a m p e r l i n e 和v a n t f ：百n s t e 的迭代目标转换因子分析法( i t e r a f i v et a r g e t t r a n s f o r m a t i o nf a c t o r a n a l y s i s ，i t t f a ) 1 4 9 ，”j ，w i n d i g 等的s i m p l i s m a ( s i m p l e - t o - u s ei n t e r a c t i v es e l f - m o d e l i n g m i x t u r e a n a l y s i s ) j ，m a s s a r t 等的o p a ( o r t h o g o n a lp r o j e c t i o na p p r o a c h ) 5 1 1 ，m a r i n e 等的g e n t l e 法【5 2 5 孔。第二类算法 是我们通常所称的渐进的方法，它有效地利用了色谱的强分离性能，在分辨中引 入了组分先入先出的假设。其代表方法有m a e d e r 渐进因子分析( e v o l v i n g f a c t o r a n a l y s i s ，e f a ) 法【5 4 ，5 ”，m a l i n o w s k i 的窗口因子分析( w i n d o wf a c t o ra n a l y s i s ， w f a ) 【5 6 1 ，梁逸曾和k v a l h e i m 的直观推导式演进特征投影法( h e u r i s t i ce v o l v i n g l a t e n t p r o j e c t i o n ，h e l p ) f 5 7 ，5 8 j 和m a n n e 的子窗口因子分析法( s u b w i n d o w f a c t o r a n a l y s i s ，s f a ) 1 5 9 6 0 l 。多元分辨与多元校正技术，已被广泛用于“灰色”和“黑 色”复杂体系的分析，尤其是在中药质量控制研究方面，主要包括中药的定性定 硕士学位论文 第一章绪论 量分析 6 1 - 6 6 、药材质量鉴别、中药制造过程参数检测与分析、中成药质量分析检 测、质量分析数据等方面。 1 ，3 ，2 模式识别与中药质量控制 中药内含物质群是个很复杂的问题，要把质量控制建立在研究清楚每个内含 成分的基础上，很不现实。这就要求，在尚不清楚全体化学成分的情况下，实现 对物质群的整体控制。因此，相似度比较法，聚类分析法、模式识别法、人工神 经网络等方法都逐渐成为了中药材质量控制中必不可少的分析手段。 在中药指纹图谱分析中，定性定量地描述指纹图谱间化学组成的差异性和波 动情况极为重要，因此提出了相似度( s i m i l a r i t y ) 的概念，并把其作为中药指纹 图谱标准中的一项重要评价指标。目前在进行中药色谱指纹图谱的相似性算前， 先要建立能表征中药产品化学组成特征的标准指纹图谱，才能通过计算待测样品 指纹图谱与标准指纹图谱间的相似度印- 7 0 l ，进而对产品质量波动情况作出整体分 析和评价。在相似性计算中，一般须先确定用于计算比较的测量参数，一种是直 接采用完整的指纹图谱，即色谱信号采样值来计算指纹图谱的相似性，这样做的 优点是可以直截了当地体现指纹图谱整体性的特征，缺点是所用数据点多与色谱 保留时间漂移的问题。另一种是只采用色谱峰高或峰面积，以局部代整体进行指 纹图谱相似性计算，因为在同一仪器的同保留时间流出的色谱峰应可代表相 同的物质；缺点是计算量大，且会丢失一些信尉”j 。 聚类分析法就是根据一定的规律和要求，对所研究的对象进行分类，提取反 映中药性状、显微、色谱、光谱等差异数量化特征，能够有效地消除噪声和干扰， 并用计算机进行分类决策。常用的聚类分析方法有距离聚类、相似性聚类、多指 标绘图聚类等。将一批样品变更，选取不同的模糊相似系数或长短距离计算公式， 对其进行数据分析，得到不同的动态聚类图，从图上即可分类、鉴定和评价质量。 所谓距离聚类分析，就是把反映不同中药样品间差异数量化矩阵理解成一个多维 空间。把每一个中药样本看成多维空间的一个点，把距离的远近作为样本分类的 依据。距离越近，表明样本间的差异就越小；距离越远，表明样本间的差异较大。 各种计算方法包括有马氏距离、欧氏距离法、切比雪夫距离法等【6 ”。目前在中药 鉴定中较为常用的是色谱、光谱等聚类分析法，其基本思路就是通过色谱和光谱 分析，将复杂的中药材中所含化学成分及含量上的差异反映出来，并将反映这种 差异的信息转化为计算机能够接受的数量化特征，用聚类分析的数学方法进行分 类决策，鉴别出中药的真伪i n o “。 硕士学位论文第一章绪论 模式识别中常用的一种方法就是将多维空问经过主成分变换“映射”n - 维 平面或三维空间，所有模式( 样本点) 都投影到该平面内，经过分析、判断、识 别各种模式的聚、分类情况，对模式的类别进行划分，确定优化区域和优化方向， 然后再线性( 如p c a 、p l s 法中，外推寻优求解样本原始空间坐标) 1 7 4 1 或非线 性“逆映射”到原始空间，得出实际信息，进而作出决策。中药指纹图谱分析中 模式识别较为常用的主成分分析法( p c a ) ，是在损失样品特征的数量( 参数量、 样本坐标数) 和压缩后的空间维数之差的数量矢量信息前提下，采用降维的模式 分类方法：p c a 法依据k l 变换( k a r h u n e n l o e v et r a n s f o r m a t i o n ) 原理，对数 据进行空间转换，找出能反映原来数据特征( 方差最大) 的主成分作为压缩后的 变量集合；该法具有变差最优性、熵达到极小值、相关最优性、回归最优性等特 点，结合组效知识的自变量筛选分类效果更佳，可作为分类或定量拟合，但属于 线性映照，难以描述非线性关系。非线性映照法( n l m ) 是在维持原有的数据 结构情况下，将多维空间数据点非线性映照在二维平面上的模式分类方法；n l m 的优点是可以直观地对不同类别的点分类，缺点为其投影图坐标没有明确的物理 意义和函数表达式，且难以看出每个特征对分类的贡献，及维数太高或样本数太 大，收敛困难，迭代容易失败，与p c a 、偏最小二乘法( p l s ) 法结合使用有助 于收敛。 人工神经网络是用工程技术手段模拟生物神经网络的结构特征和功能特征的 一类人工系统。它与传统的模式识别技术相比，具有自组织、自学习和自适应的 能力，处理信息量大的特点。因而近年来发展较快，在中药质量评价中也有一些 应用1 7 5 ，7 6 1 。 1 4 本文的研究内容 本论文主要从实际问题出发，将化学计量学的分辨理论及化学模式识别算法 用于实际中药体系色谱指纹图谱的研究。 ， 论文工作主要分为三部分，第一部分内容包括第一章，扼要介绍了我国中药 质量控制模式的发展状况，中药指纹图谱，以及化学计量学分辨技术和模式识别 技术在中药质量控制中的应用等内容。 第二部分内容包括第二章，主要是利用化学计量学中的正交投影和主成分分 析算法，提出了多组分光谱相关色谱的新方法。国家药品监督管理局于2 0 0 0 年 确定【2 引，将在2 0 0 4 年全面启动中药色谱指纹图谱来对我国中药注射液进行质量 控制，如何即准确而又尽可能少地丢失信息地表征和评价中药色谱指纹图谱，是 硕士学位论文第一章绪论 目前分析化学，特别是中药分析化学面临的一个新问题。而特异的中药色谱指纹 图谱( 一种依赖于不同提取方法所得的活性化学组分的相对浓度分布图) 则体现 了中药的整体化学特征( 整体性) 。但它受种植培育产地的气候与地理特征、采 集时期等因素的影响而使其化学组分的浓度变化具有不同程度波动性( 模糊性) ， 这就给中药色谱指纹图谱的识别与鉴定带来不便。多组分光谱相关色谱利用联用 色谱的光谱信息与色谱信息，在单组分光谱相关色谱 7 7 】的基础上，实现复杂中药 色谱指纹图谱中多组分的相关性判断，客观表征和评价不同实验条件下的中药色 谱指纹图谱，为中药色谱指纹图谱的整体模糊综合分析提供了实用、方便、可靠、 有力的手段。 灯盏花为菊科植物短亭飞蓬e r i g e r o nb r e v i s c a p u s ( v a n t ) h a n d m a z z 的全 草。味辛、微苦，性温。具有解表散寒、祛风除湿、舒筋活络、消积止痛的功效 7 8 1 。其制剂可用于治疗高血压、脑溢血、脑栓塞、多发性神经炎、慢性蛛网膜炎 等脑血管意外所致的瘫痪症【7 9 l 。第三部分内容包括第三章和第四章，系统地阐述 了中药材灯盏花的液相色谱指纹图谱建立的实验研究初探。本文针对灯盏花药材 中所含的黄酮类和咖啡酸酯类化合物1 8 0 - 8 7 1 ，采用不同的溶剂进行提取，实验涉及 色谱条件的优化及