（分析化学专业论文）磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究.pdf

0-lti【lil o nm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa n d c o n s t r u c t i o no fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mf o rc e l l u l o l y t i c f i l a m e n t o u sf u n g i b y l i a oh o n g d o n g b s ( x i a nj i a o t o n gu n i v e r s i t y ) 2 0 0 4 m s ( x i a n g t a nu n i v e r s i t y ) 19 9 4 ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f d o c t o ro fs c i e n c e i n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a n u n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rl i u x u a n m i n g s e p t e m b e r ，2 0 10 导下独立进行研究所取 ，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 蓠痧杳、 日期：2 , , o l o 年p 月乡p 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 导师签名： 日期：矽，夕年，厶，月夕d 日 日期：r d 年，9 月乡蚤日 ili-j 、= - ， 市沙 吨岛 乡l 殍。 磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究 摘要 纤维素酶是一组具有纤维素降解能力酶的总称，它们协同作用可以将纤维素 物质水解成简单糖，进而发酵产生乙醇，从而应用于农业、再生能源以及环境保 护等领域。将已商业化的分泌型木霉生产的多组分纤维素酶有效固定化，不仅可 以提高酶的稳定性、重复性，降低应用成本，还能为其他大分子底物的多酶体系 的合理共固定研究奠定基础。本研究主要开展磁性纳米颗粒固定化纤维素酶和丝 状真菌转化系统研究，获得了以下主要研究结果： 一、以f e 2 0 3 纳米颗粒和聚乙烯醇为载体物理交联固定纤维素酶方法的建立。 采以f e 2 0 3 纳米颗粒为载体，以聚乙烯醇为包覆物和交联物对纤维素酶进行反复 冻融固定，形成了催化性质稳定的固定化复合物。采用透射电镜、红外光谱仪、 振动样品磁强度计对固定化酶复合体进行了表征，结果显示：固定化酶凝胶团由 大小约lp m 的微凝胶团组成，微胶团内含1 0n m 左右的f e 2 0 3 纳米颗粒。对影响 固定化因素的研究发现：当p h 为6 ，固定化时间为1 1h ，纤维素酶p v a 为4 ， p v a f e 为5 0 时，固定化纤维素酶效果最高。通过该方法固定后酶活回收率达4 2 ， 经过5 次反应后的固定化酶相对酶活力仍保留5 0 以上。结果表明：基于f e 2 0 3 纳米颗粒和聚乙烯醇为载体的反复冻融法可以有效固定纤维素酶。 二、以牛血清蛋白( b s a ) 为模式蛋白，建立了采用硅油s p a n 8 0 微乳体系固定 化蛋白质的方法，并探讨了p h 对固定化蛋白质在复合物空间分布的影响。对制 备的b s a p v a f e 2 0 3 纳米颗粒复合物进行酶联免疫、粒径、蛋白质含量分析， 结果表明：较高p h 值( p h - - 5 、6 ) 有利于b s a 分布在复合物表层，而较低p h 值 ( p h = 3 、4 ) 使b s a 则更多地镶嵌在复合物内层。透射电镜、z e t a 电位、红外光谱 分析的结果显示b s a p v a f e 2 0 3 纳米颗粒复合物粒径分布都较为均匀，具有球型 核壳状的立体结构，并较好地保持了b s a 的活力。 三、利用硅油s p a n 8 0 微乳体系对纤维素酶( i c m ) 进行了固定，考察了油相种 类、油水比、纤维素酶浓度，搅拌转速，p h 值，交联方式等因素对固定化纤维素 酶活力的影响。结果显示：采用硅油s p a n8 0 体系，水油比值为1 2 5 ，水相纤维 素酶浓度为2 0m g m l ，搅拌转速为2 0 0 0r p m ，p h 值为5 的条件下固定化效果 最佳。滤纸酶活力可达7u m g 一。透射电镜和粒径分析表明该固定化酶的粒径为 3 0 0n m 左右，并形成f e 2 0 3 纳米颗粒聚集在内，高分子物质分布在外的复合物。 振动样品强度分析显示该复合物的饱和磁化强度为4 8 7a m 2 k g ，矫顽力为5 0 o e ，有较强的顺磁性，红外光谱分析表明纤维素酶固定在p v a f e 2 0 3 纳米颗粒体 系中。 对固定化酶的性质分析表明：该固定化方法虽然c 1 酶活力和p 葡萄糖苷 酶活力均下降，但比游离酶的c x 酶活力8 5u m g 一要高很多，显示该方法能够有 h 博士学位论文 效调整纤维素酶组分的位置。酶学性质研究结果显示该固定化酶水解曲线、最适 p h 值与游离酶等性能基本相似，并具有较强的耐机械剪切能力。 四、纤维素的晶体结构是提高酶活力的主要障碍之一，球磨技术虽然能够很 好地破坏结晶纤维但是对酶活力影响也比较大。实验将固定化酶与球磨联用处理 纤维素。酶活力和糖化分析结果表明：与球磨( 3 0 0 r p m ) 联合处理微晶纤维素( m c c ) 6h 后，微乳固定化酶的单位蛋白酶活力是游离酶活力的3 5 倍，且固定化酶与球 磨对于微晶纤维素的降解具有明显协同作用。红外光谱、x 晶体衍射和环境扫描 电镜分析结果显示：球磨能够增加微晶纤维素的吸水量；微晶纤维的有序晶体排 列在处理过程中被机械球磨降低，并使更多的不定型特性的纤维素纤丝出现，而 固定化酶能够迅速降解这一不定型纤丝，从而使球磨和固定化酶呈现出良好的协 同降解微晶纤维素作用，表明乳固定化酶结合湿法球磨是一种新型潜在的有效降 解微晶纤维素的方法。 五、为了便于探索丝状真菌纤维素降解机制，对丝状真菌的转化方法进行了 探索，建立的农杆菌介导的丝状真菌转化体系。利用根癌农杆菌l b 4 4 0 4 和质粒 p p k 2 成功实现了简青霉菌株的转化。通过分子检测表明，h p h 基因成功转化至简 青霉中，而且呈单拷贝。转化过程中影响遗传转化效率因素的研究结果表明在乙 酰丁香酮浓度为2 5 01 t m 、o d 值在0 8 、共培养时间为4 8h 的条件下转化效率最 高。验证结果表明在该条件下，平均转化率可达5 0 个转化子1 0 5 孢子。该转化体 系的建立为建立更合理的固定化纤维素酶模式奠定了基础。 关键词：纤维素酶；聚乙烯醇；f e 2 0 3 纳米颗粒；固定化；冻融；微乳；球磨；微 晶纤维素；转化；简青霉 i i ! p o t e n t i a la p p l i c a t i o n s i ns o m ef i e l d s ，s u c ha s a g r i c u l t u r e ，r e n e w a b l ee n e r g y e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n t h ei m m o b i l i z e dc e l l u l a s ec o u l db em o r es t a b i l ea n d r e u s a b l et h a nf r e ec e l l u a s e ，a n dr e s u l ti nl o w e rc o s ti ni n d u s t r i a la p p l i c a t i o n i n a d d i t i o n ，an o v e li m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g yo fc e l l u a s ec o u l db r i n gan e wi d e ao f r e a s o n a b l ei m m o b i l i z a t i o no fm u t i e n z y m ec o m p l e x t h i sd i s s e r t a t i o nh a sf o c u s e do n t h e s t u d yo fp r e p a r a t i o n o ft h ei m m o b i l e dc e l l u l a s ei n p o l y v i n y la l c o h o l f e 2 0 3 n a n o p a r t i c l e s ，a n dt h ec o n s t r u c t i o no ft r a n s f o r m a t i o no fp e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m m e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s t h et h e s i sm a i n l yi n c l u d e st h ef o l l o w i n g p a r t s ： 1 t h ei m m o b i l e dc e l l u l a s ei np o l y v i n y la l c o h o l f e 2 0 3n a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e d b yc y c l i cf r e e z i n g - t h a w i n gp r o c e s s c h a r a c t e r so ft e m ，i ra n dv s ms u g g e s t e dt h a t t h ea v e r a g ed i a m e t e r so fi m m o b i l l e de e l l u l a s ec o m p l e x sw e r e1 “mw h i c h c o n t a i n e d 10 n mf e 2 0 3n a o p a r t i c l e f a c t o r sa f f e c t i n ga c t i v i t i e so fi m m o b i l i z a t e dc e l l u l a s ew e r e r e s e a r c h e d a b o u t4 2 a c t i v i t yr e t e n t i o no fi m m o b i l i z e dc e l l u l a s ew a sa c h i e v e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ：p h6 0 ，c e l l u l a s e p v ae q u a lt o4 ，p v a f ee q u a lt o5 0 ， 11h o u rf o ri m m o b i l i z a t i o n t h ei m m o b i l i z e dc e l l u l a s ee x h i b i t e dg r e a t e re f f i c i e n c y t h a nf r e ec e l l u l a s ea n dr e t a i n e d5 0 r e l a t i v e l ya c t i v i t ya f t e rf i v ec y c l e so fr e u s e ， w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h i sn o v e lm e t h o do fi m m o b i l i z a t i o nc o u l db ep r o p i t i o u st or e u s e a n di m p r o v ee f f i c i e n c yo fc e l l u l a s e 2 u s i n gb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a sam o d e lp r o t e i n ，w ee s t a b l i s h e dap a t t e r n o fs i l i c o n eo i l s p a n 8 0m i c r o e m u l s i o nt oi m m o b i l i z ep r o t e i na n di n v e s t i g a t e dt h e a d j u s t m e n to ft h ep r o t e i nr e g u l a t i o no fi m m o b i l i z i e dc o m p l e xb yp ht h r o u g he l i s a ， z e t a s i z e r ，i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm o r eb s aw e r ed i s t r i b u t e d i nt h ee x t e r i o ro fc o m p l e xi nt h eh i g hp h ( p h = 5 ，6 ) a n dm o r eb s aw e r ed i s t r i b u t e di n t h ei n t e r i o ro fc o m p l e xi nt h el o wp h ( p h = 3 ，4 ) t h er e s u l t so fe t a s i z e r ，i n f r a r e d s p e c t r o s c o p ya l s os h o w e dt h ec o m p e xh a dh o m o g e n e o u ss i z e sa n dc o r e s h e l ls t r u c t u r e ， m o r e o v e r ，t h ea c t i v i t yo fb s aw o u l db eg o o dr e t a i n e db yt h i si m m o b i l i z e dm e t h o d 3 w ei m m o b i l i z e dt h ec e l l u l a s e ( i c m ) p o l y v i n y la l c o h o l f e 2 0 3n a n o p a r t i c l e s u n d e rt h es i l i c o n eo i l s p a n 8 0m i c r o e m u l s i o ns y s t e m ，a n dw ea l s oi n v e s t i g a t i e dt h e i v e f f e c t so ft h ei m m o b i l i z a t i o no fc e l l u l a s e a c t i v i t y ，s u c ha s t y p e so fo i lp h a s e ， 0 1 l 。w a t e rr a t i o ，c e l l u l o s ec o n c e n t r a t i o n ，s t i r r i n gs p e e d ，p h ，c r o s s 1 i n k i n gf o 瑚s t h e r e s t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fi c mw a s b e s t ( f i l t e rp a p e re n z y m ea c t i v i t vu pt o7 u 。m 9 1 ) u n d e rs u c hc o n d i t i o na st h eo i lp h a s eo f s i l i c o n eo i l s p a n8 0 ，t h ew a t e r o i l r a t i oo f1 2 5 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fc e l l u l a s ei na q u e o u sa t2 0 m g m l ，s t i r r i n gs p e e d a t2 0 0 0r p m ，p h5 t h ea n a l y s i s r e s u l t so ft r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya n d z e t a s l z e rs h o w e dt h a tt h ei m m o b i l i z e de n z y m ef o r m e dak i n do f s p h e r ec o m p l e xw i t h t h ed i a m e t e ro f a p p r o x i m a t e l y3 0 0a m ，a n dw i t ht h es t r u c t u r eo fa g g r e g a t i o n a lf e 2 0 3 n a n o p a r t i c l e si nt h e i ri n t e r i o r a n d ，p o l y m e ri nt h e i r e x t e r i o r v i b r a t i n gs a m p l e a n a j y s i ss h o w e dt h a tt h es a t u r a t i o nm a g n e t i z a t i o no fi m m o b l i e de n z y m ei s4 8 7a m 2 k g1 ，a n dt h ec o e r c i v i t yi s5 0o e ，w h i c h s u g g e s t e dt h ec o m p l e x sh a das t r o n g p a r a m a g n e t i c t h ei n f r a r e d s p e c t r o s c o p yi m a g e sa l s os h o w e dt h a tc e l l u l a s ew a s 1 m m o b i l i z e di n p v a f e 2 0 3s y s t e m t h ee n z y m a t i cc h a r a t e ro ft h e i m m o b i l i z e d e n z y m es h o w e dt h a t ：a l t h o u g hc1 a c t i i t ya n d1 3 - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yd e c r e a s e di nt h i s c o m p l e x s ，c xi sm u c hh i g h e rt h a nt h ef r e ee n z y m ea c t i v i t y8 5 u m g 一，i n d i c a t i n g t h a tt h i sm e t h o dc a na d j u s tt h ep o s i t i o no fc e l l u l a s ec o m p e n t c h a r a c t e r i z a t i o nr e s u i t s s h o w e dt h a tt h eh y d r o l y s i sc u r v ea n dt h eo p t i m u m p hv a l u eo fi m m o b i l i z e de n z y m e w e r es l m i l a rw i t ht h ef r e ee n z y m e s ，a n dh a ds t r o n gr e s i s t a n c et om e c h a n i c a ls h e a r i n g 4 - t h ec r y s t a ls t r u c t u r eo fc e l l u l o s ei so n eo ft h em a i no b s t a c l e st o d e g r a d e b a l l m i l l i n gc o u l dd e s t r o yt h ec r y s t a ls t r u c t u r e ( m c c ) b u td og r e a th a r mt ot h ea c t i v i t vo f c e l l u l a s e w ec o m b i n e db a l l m i l l i n gw i t hi c m t h ea n a l y s i so fr e t a i n e da c t i v i t v s h o w e dt h a tt h es p e c i f i ca c t i v i t yo fi c mw a sa b o u t3 5t i m e so f t h a to ff r e ec e l l u l a s e a t i e rt r e a t e db yt h eb a l l m i l l i n gi n3 0 0 r p m6h t h eg l u c o s ea n a l y s i ss u g g e s t st h a t t h e r ea r es y n e r 9 1 e sb e t w e e nm i l l i n ga n di m m o b i l i z e de n z y m ef o rt h e d e g r a d a t i o no f m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e i n f r a r e da n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eb a l lc a ni n c r e a s ew a t e r a b s o r p t l o nm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e x r da n de s e m a n a l y s i sr e s u l t ss u g g e s t e dt h a t b a l lm i l l i n gl o o s e dt h ec r y s t a l l i n es u r f a c ea n dm a d e a m o r p h o u ss t r u c t u r e ，w h i c hw a s m o r ea c c e s s i b l eb yi c m w i t ht h ee n z y m e h y d r o l y s i so fm c c ，t h ef i b r o u ss t r u c t u r eo f c e u l o s ew a sb r o k e n ，w h i c hi sc o n s i d e r e dt o b ea d o p t a b l ef o rb e t t e rm e c h a n i ca n d c n e m i c a lm o d i f i c a t i o n t h e s et w or e a c t i o n sp r o c e e d e dr e p e a t e d l ya n ds y n e r 百s t i c a l l y a n t i lt h em c cw a sd e g r a d e de f f i c i e n t l y t h e s er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o m b i n a t i o no f m i c r o e m u l s i o ni m m o b i l i z e dp o t e n t i a lw e t m i l l i n gi san e wa n de f f e c t i v em e t h o do f d e g r a d i n gm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e 5 t o s i m p l i f yt h ei n v e s t i g a t i o no ft h ec e l l u l o s e d e g r a d a t i o nm e c h a n i s mi n n i a m e n t o u s f u n g i ， an o v e l a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o m a t i o nm e t h o do f v c o n d i t i o n g ：t h e c o n c e n t r a t i o no fa g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n a t 2 5 0 “m ，t h e c o n c e n t r a t i o no fa c e t o y r i n g o n ea t0 8o da n dt h ec o c u l t u r et i m ea t4 8h t h e e s t a b l i s h m e n to ft h i dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw o u l dc o n t r i b u t et ot h ee s t a b i l i s h m e n to f am o r er a t i o n a lm e t h o do fi m m o b i l i z e dc e l l u l a s e k e yw o r d s ：c e l l u l a s e ，p o l y v i n y la l c o h o l ，f e 2 0 3n a n o p a r t i c l e s ，i m m o b i l i z a t i o n ， f r e e z i n g - t h a w i n g ，m i c r o e m u l s i o n ，m i c r o c e l l u l o s e ，t r a n s f o r m a t i o n ，p e n i c i l l i u m s i m p l i c i s s i m u m v i 1 3 1 固定化酶技术一9 1 3 2 传统的纤维素酶固定化方法1 1 1 3 3 新型的酶固定化方法1 2 1 4 纳米颗粒固定纤维素酶1 5 1 4 1 传统固定化纤维素酶的某些缺陷和磁性纳米颗粒载体1 5 1 4 2f e 2 0 3 磁性纳米颗粒载体简介1 5 1 4 3 磁性纳米颗粒固定纤维素酶的可能和前景1 6 1 5 本论文的设想和主要内容1 6 1 5 1 本研究的目的与意义1 6 1 5 2 本论文的设想和主要内容1 7 第2 章基于聚乙烯醇f e 2 0 3 纳米颗粒的反复冻融法固定纤维素酶1 9 2 1 前言l9 2 2 实验部分2 0 2 2 1 材料与方法一2 0 2 2 2 实验方法2 0 2 3 结果与讨论2 4 2 3 1 固定化酶复合体表征2 4 2 3 2 固定化过程影响酶活力的因素2 7 v h i h v 1 l 1 l 3 5 7 7 9 9 一 r 一 一 一 一 一 统 一 题 一 一 一 一 一系 问 一 一 一 一 匕 一h j ，甲 口 一 转 在 一 传 存 一 磁r 丰纳米颗粒同定纤维索酶和产酶丝状真菌转化的研究 2 3 3 固定化对酶的效率和稳定性的影响3 0 2 4 小结3 3 第3 章p h 对b s a 在p v a f e 2 0 3 颗粒微乳体系中分布的影响3 4 3 1 前言3 4 3 2 材料与方法3 5 3 2 1 仪器与试剂3 5 3 2 2 实验方法3 6 3 3 结果与讨论3 8 3 3 1 微乳体系的确定与微乳体系固定化原理3 8 3 3 2 不同条件下水相z e t a 电位分析3 8 3 3 3p h 对b s a p v a f e 2 0 3 纳米颗粒复合物制备的影响因素分析4 3 3 3 3 2p h 对b s a p v a f e 2 0 3 纳米颗粒复合物的粒径分布影响4 4 3 3 3 3p h 对b s a p v a f e 2 0 3 纳米颗粒复合物蛋白质固定量的影响4 4 3 3 4b s a p v a f e 2 0 3 纳米颗粒复合物的表征口4 5 3 4 小结4 7 第4 章聚乙烯醇f e 2 0 3 纳米颗粒 纤维素酶复合物的制备4 9 4 1 前言4 9 4 2 材料与方法5 0 4 2 1 仪器与试剂5 0 4 3 实验方法5 0 4 3 1i c m 的制备条件的优化5 0 4 3 2i c m 的理化性质分析5 1 4 3 3i c m 的基本酶学性质分析5 1 4 4 结果和讨论5 3 4 4 1i c m 制备和条件的优化5 3 4 4 2i c m 的物理表征5 8 4 4 3i c m 的基本酶学性质分析6 l 4 5 小结6 4 第5 章固定化纤维素酶在微晶纤维球磨处理中的应用6 5 5 1 前言6 5 5 2 材料与方法6 5 + 5 2 1 仪器与试剂6 5 5 2 2 实验方法6 6 5 3 结果与讨论6 7 5 3 1i c m 和游离纤维素酶的催化性质比较6 7 v 1 1 1 博士学位论文 5 3 2m c c 在球磨和固定化酶共同的降解情况6 8 5 3 3 微晶纤维在球磨和固定化酶共同处理后的结构分析6 9 5 4 小结7 5 第6 章基于农杆菌的简青霉转化系统的构建7 6 6 1 前言7 6 6 2 实验试剂和材料7 7 6 2 1 主要实验试剂和引物7 7 6 2 2 培养基和主要缓冲液的配制7 7 6 2 3 菌株和质粒7 8 6 3 实验方法7 8 6 3 1 农杆菌冻融法感受态细胞的制备及其转化7 8 6 3 2 简青霉孢子悬液的制备7 9 6 3 3 农杆菌和简青霉孢子的共培养7 9 - 6 3 4 转化子抗生素初步筛选7 9 6 3 5 简青霉总d n a 的提取7 9 6 3 4 转化子p c r 8 0 6 3 5s o u t h e r nb l o t 鉴定8 0 6 4 结果与讨论8 0 6 4 1 简青霉对潮霉素抗性实验，确定潮霉素的浓度8 0 6 4 2 农杆菌介导的简青霉转化8 1 6 4 3 简青霉a m t 转化子的分子验证8 1 6 4 4 影响农杆菌介导简青霉转化效率的研究8 3 6 5 ，j 、结8 6 结论8 7 参考文献9 0 附录a攻读学位期间所发表的学术论文目录1 0 4 致j 射10 5 i x 博士学位论文 1 1 纤维素酶简介 第1 章绪论 1 1 1 纤维素酶的组成与分类 纤维素酶是一组纤维素降解能力酶的总称，它们的协同作用可以将纤维素物 质水解成简单糖，进而发酵产生乙醇，从而解决农业废弃物、再生能源以及环境 污染等问题。典型的纤维素酶系包括多种水解酶组分【l 】，依据其催化活性的差异 可以归纳为三大类：( 1 ) 外切纤维素酶( e c3 2 1 9 1 ，e x o 1 ，4 b d g l u c a n a s e 或 1 ，4 p d g l u c a nc e l l o b i h y d r o l a s e ，来自于真菌简称c b h ；来自于细菌简称c e x ) 。 外切纤维素酶从纤维素的还原或者非还原链末端开始切割，水解b 1 ，4 糖苷键， 每次切下一个纤维二糖分子。由于该酶组分水解产物主要为纤维二糖，所以又常 被称为纤维二糖水解酶。外切纤维素酶能作用于微晶纤维素，其原因可能是该酶 能从微晶纤维素的结构中驱除纤维素链【2 】；( 2 ) 内切纤维素酶( e c3 2 1 4 ， e n d o - 1 ，4 - p d g l u c a n a s e 或1 , 4 - p d - g l u c a ng l u c a n h y d r o l a s e ，来自于真菌简称e g ； 来自于细菌简称l e n ) 。内切纤维素酶能以随机的形式对纤维素不定型链内部进行 切割，对末端键的敏感性比中间键小，同时还能降解一些纤维素衍生物，如羧甲 基纤维素，羧乙基纤维素等，其主要产物是纤维糊精，纤维二糖和纤维三糖【3 1 。 ( 3 ) p 葡萄糖苷酶( e c3 2 1 2 1 ，p 一1 ，4 一g l u c o s i d a s e ，简称b g ) 。该酶能水解纤维二 糖以纤维寡糖生成葡萄糖，从而完成纤维素的最终酶水解【4 】。除此这几种主要的 纤维素降解酶之外，纤维二糖氧化酶( c e l l o b i o s eo x i d a s e s ) 和纤维二糖脱氢酶 ( c e l l o b i o s ed e h y d r o g e n a s e ) 也能起到降解纤维素的作用【5 】【6 】。 不同的微生物包含的纤维素酶组分不同，数量从十几种至几十种不等。真菌 纤维素酶系统通常由几种外切酶、内切酶和一两种b 葡萄糖苷酶组成。如里氏木 霉( t r e e s e i ) 就包含两种外切酶( c b hi ，c b h i i ) 、四种内切酶( e gi ，e gi i ，e g i i i ， e g v ) 和一种p 葡萄糖苷酶。某些细菌( 如c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) 的纤维素酶组 分会形成被称为纤维酶小体( c e l l u l o s o m e ) 的大型多酶复合体。这些纤维素酶小体 能高效降解木质纤维素，而且纤维素酶小体中酶组分的分布、含量对小体的降解 能力有很大的影响【_ 7 ，s ，9 】。 1 1 2 纤维素酶的结构特征 尽管不同来源的纤维素酶的分子量大小和结构大相径庭，但它们都有类似的 结构特征。对纤维素酶的拆分研究发现，纤维素降解酶一般由催化结构域( c a t a l y t i c 磁十牛纳米颗粒固定化纤维素酶和丝状真菌转化系统研究 d o m a i n ，c d ) 、连接i r ( 1 i n k e r ) 和纤维素结合结构域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 三部分组成( 如图1 1 ) 【10 1 。此外，其他的结构元件也有可能插入到纤维素酶的结构 中，如第二个催化区域、i i i 型纤连蛋白、重复疏水序y l j ( c o h e s i o n d o c k e r i n ) 等。 n c m l 硼i cc o r nd o m a i n l i n k e r d o m a 跏r e g i o nc b d 一一一 图1 1 里氏木霉c b hi 的结构示意图【l o j f i g1 1s t r u c t u r eo fc b h if r o mt r i c h o d e r m ar e e s e i ( 1 ) 催化结构域。c d 的形态结构呈契型或球形，主要是由类似凝集素的1 3 夹心折叠、( 1 3 a ) s 桶折叠、( 0 c ，a ) 6 桶折叠等基本结构组成，这些基本结构的组合 最后构成几大类三维结构、催化特异性迥异的区域。以里氏木霉产的纤维素酶为 例：外切酶c b h 的活性部位呈袋状结构，只允许纤维素的末端逐步进入并将其 水解( 见图1 1 ) ；而内切酶e g 的活性部位有较大的沟，可允许整条纤维素链进入， 但结晶纤维素由于氢键和疏水作用形成致密的空间结构，不能进入e g 的活性部 位，因此e g 对结晶纤维素不起作用 1 1 儿1 2 】。纤维素酶的结构和序列分析表