（森林培育专业论文）冰核细菌对仁用杏授粉生物学特性影响的研究.pdf

摘要 以优一和龙王帽两个仁用杏品种的雌蕊和雄蕊为试材，研究了i n a 细菌对花药 和柱头过冷却点、花粉的生活力、发芽率、花粉管长度、授粉后花粉管的生长情况以 及对花柱和花药的生理生化指标的变化，探讨了冰核活性细菌( 简称i n a 细菌) 对 杏授粉生物学特性的影响，主要结果如下： 1 接种i n a 细菌后，极显著提高了花药和柱头的过冷却点温度，使优一花药和 柱头的过冷却温度分别由4 6 和- 3 8 ，升高到了乞5 和一2 2 ，提高了2 1 和 1 6 。龙王帽花药和柱头的过冷却温度分别由- 4 0 c 和3 0 c ，升高到了2 4 c 和1 9 ，提高了1 6 和1 1 。 2 低温处理降低了花粉生活力、花粉发芽率和花粉管长度，- 6 低温处理后， 优一的花粉生活力较常温处理低3 6 5 7 ，发芽率在5 低温处理后低于常温处理 1 6 7 5 ，花粉管生长长度变短了3 4 5 5 6 1 x m 。i n a 细菌的存在加重了低温的影响，同 一低温处理后，优一接菌的花粉生活力较未接菌低4 4 1 4 7 ，花粉发芽率较未接 菌低0 7 3 0 o 一- 2 6 3 ，花粉管的生长长度较未接菌短2 0 0 8 1 x m 2 0 8 8 9 t u n 。且接菌花粉 在4 时不再萌发，受影响温度高于未接菌2 。 3 对授粉后4 h 、2 4 h 进行- 2 低温处理后，花柱的荧光显微镜观察表明，未接 种i n a 细菌的花粉于授粉4 h 时低温处理后可大量萌发，花粉管的生长速度和数量低 于对照，在恢复4 4 h 后未观察到向花柱基部生长；在授粉后2 4 h 低温影响后花粉管可 以生长至子房，而接种i n a 细菌的花粉粒于授粉4 h 时低温处理后萌发受到抑制，花 粉管不能继续生长，授粉后2 4 h 低温处理使花粉管生长缓慢甚至停止。 4 低温降低了花柱和花药中s o d 和p o d 保护酶的活性，使自由基不能及时清 除，可溶性糖、蛋白的含量减少，生长素类物质合成减少，使膜脂过氧化物m d a 含 量积累。i n a 细菌的存在显著加重了低温对花柱和花药的影响，提高了受害温度，降 低了花柱和花药的抗寒能力。 5 i n a 细菌的存在降低了花柱和花药的抗寒能力，提高了花药和柱头的过冷却 点温度，加重了低温的危害，引起杏树体内的生理生化反应，促进体内代谢的改变， 使授粉受精过程中所需要的营养成分减少，花粉的生活力降低，发芽率下降，花粉管 不能正常向下生长进入子房，从而影响了杏授粉受精的完成，影响到产量。 关键词：杏；i n a 细菌；花粉；花粉发芽率；花粉生活力；花粉管 e f f e c t so f i n ab a c t e r i ao hp o l l i n a t i o nb i o l o g yo fk e r n e la p r i c o t a u t h o r ：z h a n gq i a n s u p c r v i s y a n gj i a n - m i n m a j o r f o r e s tc u l t i v a t i o n a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ep i s t a la n ds t a m e no f t w ok e r n e la p r i c o t sv a i l c t i e sw e r eu s e da s t h ee x p e r i m e n tm a t e r i a l s t h ed i f f e r e n c e sa m o n gt h es u p e r c o o l i n gp o i n tt e m p e r a t u r e o fa n t h e ra n ds t i g m a , t h ep o l l e na c t i v i t y , p o l l e ng e r m i n a t i o n ，p o l l e nt u b el 锄g 札t h e t u b eg r o w t ha n dp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r sw i t hl n ab a c t e r i aa n d w i t h o u ti n ab a c t e r i aw e r ei n v e s t e d i no r d e rt oe x p l a i nt h ee f f e c t so fi n ab a c t e r i ao n p o l l i n a t i o nb i o l o g yo fa p r i c o t u n d e rl o wt e m p e r a t u r e 1 1 h em a i nr c s u t sw e r ea s f o l l o w i n g s ： 1 a f t e ri n o c u l a t ei n ab a c t e r i a , t h es u p e r c o o l i n gp o i n tw e r es i g n i f i c a n t i n c r e a s e d t h es u p e r c o o l i n gp o i n tt e m p e r a t u r eo f t h ea n t h e ra n ds t i g m ao f y o u 妒w e r e s e p a r a t e l yf r o m - 4 6 c a n d - 3 8 t o - 2 5 ca n d 一2 2 c 2 1 a n d1 6 c h i 【g h e rt h a n c o n t r 0 1 t h et e m p e r a u r eo fl o n g w a n g m a ow e r es e p a r a t e l yf r o m - 4 0 a n d - 3 o c t o - 2 4 a n d - 1 9 1 6 a n d1 1 o f h i g h e r t h a nc o n t r 0 1 2 u n d e rt h et r e a t m e n to fl o wt e m p e r a t u r ei tw e r ec u td o w nt h ep o l l e na c t i v i t y , p o l l e ng e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b el e n g t h a t t h et r e a t m e n to f 6 t h ep o l l e n a c t i v i t yo fy o u y iw e r e3 6 5 7 l o w e rt h a nc o n t r 0 1 t h ep o l l e ng e r m i n a t i o nw e r e 1 6 7 5 l o w e rt h a nc o n t r o la t - 5 。mp o l l e nt u b el e n g t ho f y o u y i3 4 5 5 6 p ms h o r t e r t h a nc k 1 1 1 ee x i s t e do f1 n ab a c t c r i aa g g r a v a t et h ec o l dd a m a g ea n da tt h es a m e t e m p e r a t u r et r e a t m e n t , t h ep o l l e na c t i v i t y w e r e4 4 p 1 4 7 l o w e rt h a n f i o n i n o c u l a t e di n a t h ep o l l e ng e r m i n a t i o nw e r e0 7 3 * o - - - 2 6 3 l o w e r , t h ep o l l e n t u b el e n g t hw e r e2 0 0 8 岬2 0 8 8 9 p ms h o r t e r 3 i no r d e rt oe x p l a i nt h ee f f e c t so fi n ao np o l l e ng e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b e g r o w t h ，8 0t h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ew a $ u s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el o w t e m p e r a t u r et r e a t m e n tm a n yn o n ei n o c u l a t e di n ap o l l e ng e r m i n a t e do nt h es t i g m a a f t e r4 hp o l l i n a t i o na n dc o u l dr e a c h e dt h eo v a r ya f t e r2 4 hp o l l i n a t i o n t h ee x i s t e n c e o fi n ab a c t e r i ai n h i b i t e dp o l l e ng e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b eg r o w t ha f t e r4 h g e r m i n a t i o na n dt h ep o l l e nt u b eg r o w t hs l o w l ya n ds t o p p e da f t e r2 4 hg e r m i n a t i o n w i t l ll o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n t 4 u n d e rl o wt e m p e r a t u r e , t h et r e a t m e n to fi n ab a c t e r i ac a ng r e a t l yc u td o w nt h e s o da n dp o da c t i v i t y , a n dr e d u c et h ec o n t e n to f s o l u b l ep r o t e i na n ds u g a r , d e c r e a s e d t h ec o n t e n to fi a aa n do a , i n c r e a s e dt h ec o n t e n to fm d 八t h ee x i s t e do fi n a r e d u c e dt h ec o l dh a r d i n e s so f a p r i c o tp i s f i la n da n t h e r 5 t os 啪u p , i n a b a c t e r i ai n c r e a s e dt h es u p e r c o o l i n gp o i n to f a n t h e ra n ds t i g m a , a g g r a v a t e dt h ec o l dh a r d i n e s s ，a n dc h a n g i n gt h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r s r e d u c e dt h en u 仃i t i o no fp o l l e ng e r m i n a t i o n 1 1 b ep o l l e na c t i v i t yd e c l i n e d a n dt h ep o l l e nt u b eg r o w t hu n - n o r m a l s ot h es t r e s so fl o wt e m p e r a t u r ei n ab a c t e r i a c o u l di n f l u e n c et h ep o l l i n a t i o na n df e r t i l i z a t i o n k e y w o r d s ：a p r i c o t ；i n ab a c t e r i a ；p o l l e n ；p o l l e ng e r m i n a t i o n ；p o l l e na c t i v i t y , p o l l e n t u b e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭壅些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：火1 舂 签字日期：。，7 年6 月，乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些塞些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑些壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：专民编 签字日期：0 7 年臼哆日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字吼卅年多月哆日l， 电话： 邮编： 冰核细菌对仁用杏授粉生物学特性影响的研究 1 引言 一般而论授粉是指在花瓣展开后雄蕊的花粉落到雌蕊的柱头上，花粉开始萌 发直至进入子房完成受精的过袒n 。 1 1 影响离体花粉生命力的因素 在自然条件下，成熟的花粉粒从花药中散出后，保持具有受精能力的时间即 为花粉的寿命。果树花粉的寿命均较长，因种类不同也有很大差异，一般可维持 几周至几个月。 1 1 1 花粉的采集时间 植物花粉的产量、质量、散粉特性往往受到遗传特性及环境等因素的限制。 d a n t o n i o 等【2 】认为一天中不同的时间采集芹菜花粉不影响其生活力。m a r c h a n t 等 【3 l 对未开、半开、全开3 种状态月季品种的研究认为，全开或未开的花朵是可取的， 尤其是未开的花朵可以减少花粉交叉污染的风险：梁立等h l 在紫菜苔花粉超低温保 存研究中对比了幼嫩花粉( 开花前7 8 d ，单核后期至二核早期) 、近成熟花粉( 开花前 2 d 二核期) 和成熟花粉( 开花当天) 3 个发育时期，结果认为成熟花粉的保存效果与 近成熟花粉相近，幼嫩花粉较差；c r a d d o c k 等【5 】对山茱英的研究认为刚刚开裂的 花药作为保存花粉较好：欧李l 不同花期的花粉生活力分别为6 1 ( 小蕾期) ，8 1 ( 大蕾期) ，9 2 ( 开放期) ，离开花越近，花粉生活力越高，达到最高。花前2 - 3 d 成熟的花粉不多，因而有生活力的花粉比率很低，从开花前到开花盛期，成熟的 花粉越来越多，致使开花盛期有生活力花粉比率最高，从开花盛期到开花末期， 因为受精，营养加速向予房转移，使成熟的花粉的不到营养而不能继续发育，发 育成熟的也因花丝凋零而逐渐失去生活力。从目前的研究来看，大部分植物材料 在初花至盛花期采集铃铛花收集到的花粉质量最好。 1 1 2 花粉的贮藏条件 在科研和生产工作中经常进行人工授粉，如果亲本花期不遇，采集的花粉还 必须贮藏。因花粉不断进行呼吸等新陈代谢过程，消耗可溶性糖和有机酸等营养 物质，同时花粉中含有的酶、蛋白质、核酸及其它有生命活性的物质在花粉保存 过程中极易变性，从而导致花粉生活力下降以至丧失。所以凡是能够减弱呼吸的 外界条件，等办法均能有效地降低呼吸强度，减少消耗，延长花粉的寿命。研究 表吲nn * 州：未干燥花粉在常温和低温0 c 下保存，生活力下降都很快，干燥花粉 低温保存、超低温保存均能取得理想的效果，刘武林等( 1 9 8 4 ) 用苯、丙酮、石 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 油醚、乙酸乙酯等，试验了山茶、柳、杏等1 1 种植物花粉在有机溶剂保存，均具 有很好的效果。花粉的超低温保存是在8 0 c 以下超低温保存种质的一种生物学技 术，在超低温条件下保存材料可以减少甚至几乎中止代谢衰老过程，保存生物材 料的稳定性，最大限度地抑制生理代谢强度，达到长期保存种质的目的。王红【l i j 等对1 4 份柑桔材料试验，大部分品种贮藏1 年后花粉仍保持较高的萌发率，花粉 管伸长情况正常。冷冻前的预处理和冰冻降温的方法是超低温保存的主要因素。 张富云等【1 2 1 ，梨花粉在室温保存在，随保存时间延长，花粉发芽率迅速降低。在4 的条件下保存可以明显延长花粉寿命，但在较长时期的保存中，采用一2 0 的低 温条件效果更好。液氮温度( 一1 9 6 ) 条件下，保存时间延长，花粉发芽率与当 年新鲜花粉差异很小，液氮长期保存是最有效的方法。干燥花粉中的生物活性物 质处于致钝状态，因而相对未干燥花粉具有较好的保存性，但它在常温下还是较 易失活，而在低温条件下保存效果较好。 1 1 3 花粉离体萌发的条件 花粉的离体萌发，前人有过许多研究报道，b r i n k ( 1 9 2 4 ) 1 1 3 j j o h r i 和v a s i l ( 1 9 6 1 ) “j 先后发表过有关花粉萌发的资料。近年来，许多学者在这方面作了更广泛的研究， 其中温度对花粉的萌发和花粉管的生长很重要，但也因不同的树种和品种之间存 在差异，郑诚乐 15 】等研究3 0 ( 2 - - - 3 5 温度条件最适于锥栗花粉萌发和花粉管伸长； 金英善等1 1 6 1 研究苹果梨授粉花粉萌发的适宜温度2 5 - 3 0 c ，徐娟等1 1 日对柑桔花 粉生活力及萌发的影响研究，金柑、枳壳品种的花粉发芽最适温度为3 6 。本地 早品种发芽最适温度为2 7 。柿【l 州的花粉萌发最适温度2 5 。 在人工培养基中，蔗糖是有效成分，萌发的适宜浓度为5 8 0 不等。硼对 花粉萌发的重要性首先由s c h m c k e r ( 1 9 3 3 ) 发现，以后g a u c h 、d u g g a r ( 1 9 5 4 ) 1 9 j 有很 多观察报告，近几年的大量资料表明硼对花粉萌发的必要性。锥栗的花粉 0 1 加，5 的硼酸可促进其萌发，张绍铃等【2 0 i 对8 种果树花粉的研究，得出以含 1 0 蔗糖，1 琼脂和o 0 1 硼酸的培养基最适宜萌发。苹果梨萌发的蔗糖浓度为 5 一1 5 ，硼酸浓度为1 0 0 - - 4 0 0 m g l - - 。 花粉的萌发及花粉管的生长还受其它多种外源物质，如多胺、c a 2 + 等的影响， 关军峰等花药培养过程中花粉壁渗出的c a 2 + 量与萌发率和花粉管生长长度呈显著 正相关，1 0 4 m o l l 1 的游离c a 2 + 最有利于花粉的萌发。徐继忠等t 2 l 】研究认为多胺 能够促进花粉管生长，浓度1 l f f s m o l l - 1 效果为好。陈迪新等皿j 认为精胺、亚 精胺和腐胺促进梨花粉萌发及花粉管生长的适宜浓度分别为 0 0 0 5 - 4 ) 2 5 m m o l l 1 、0 0 5 - - 0 2 5 m m o l l 和0 0 5 - - 0 2 5 m m o l l 。宋长冰等归j 研究外源多胺处理元帅、国光花粉，对萌发率和花粉管长度产生极显著影响，精 胺、亚精胺和腐胺处理的有效促进浓度分别为0 0 0 3 - - - 0 0 0 7m m o l l - 1 、0 0 3 - 4 ) 0 7 m m o l l 1 和0 0 3 - 4 3 0 5m m o l l 1 ，低于下限时作用不明显，高于上限则产生显著 抑制作用。 花粉的液体培养基成分现在也有了更加深入的研究，张绍铃等【2 4 】通过对果梅 花粉的液体培养，其液体培养基为l o 蔗糖，0 0 1 硼酸，1 5 p e g 4 0 0 0 ， 0 0 7 c a ( n 0 3 ) 2 4 h 2 0 ，0 0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 ，p h 以6 肌6 5 为宜。梨口刈花粉的液 2 堡堡塑堕翌竺旦查堡塑兰望兰堑堡墅堕塑里茎 体培养最适宜的培养基组分为3 0 m m o l u 1 m e s 、0 0 1 硼酸、0 0 3 c a c l 2 2 h 2 0 、 1 5 p e g - 4 0 0 0 、5 果糖( 或5 t h 梨醇、1 0 蔗糖) ，最适宜p h 值为6 5 。 1 2 影响果树的授粉的因素 1 2 1 有效授粉期 被子植物受精作用是一个长的过程，经历下列的程序：花粉在柱头上萌发和 长出花粉管，花粉管通过花柱，花粉管进入胚囊和释放内容物和配子融合。亲和 的花粉与柱头接触后达到受精目的【硼。w i l l i a m s ( 1 9 6 5 ) 【2 7 1 首次提出了有效授粉期 ( e f f e c t i v ep o l l i n a t i o np e r i o d 简称e p p ) 的概念，指出胚囊的寿命减去花粉管伸入到达 胚囊所需的时间。一般果树大约在5 - 7 d 左右【2 6 j 。据杨槐俊( 1 9 8 8 ) 研究，金冠苹果 柱头的授粉有效期为9 d ，红星苹果柱头有效授粉期为7 d ；砀山酥梨从开花当天至 第5 d 授粉坐果率均很耐z 盯，木奈在开花后3 d 内均保持较高的授粉能力，以开花 当天的坐果率达到最高【2 9 】。鸭梨最佳授粉时间为开花后1 0 1 1 内，最迟不超过开花 后2 4 h 3 0 1 。龙眼的有效授粉时间为开花后1 - - - 4 ( t ，开花后2 d 内授粉坐果率最高【3 ”。 果树有效授粉期( e p p ) 受许多因素的限制，主要有柱头的接受能力，雌蕊的生 理状况和胚的成熟度。这些限制因素取决于遗传，环境或栽培因烈3 2 1 。赵习平等p 习 研究认为，杏花开半小时后雌蕊柱头接受花粉处于最佳状态，授粉最佳时期在花 后4 h 之内，在4 8 h 内授粉都有一定结实率。授粉后6 0 h 就有少数花粉进入子房， 一般杏花粉从授粉后到进入子房需3 5 d 。巴旦杏的有效授粉期在开花后2 - - 4 ( t 内， 在此期问授粉，坐果率较高1 3 4 】，杏的雌蕊接受花粉的时间较长，但以开花后3 d 花 粉萌发率较胄l ”j 。 1 2 2 自然条件 自然条件影响花粉萌发的因素也很多，我国华北地区，杏开花较早，容易遭 受晚霜危害，花期晚霜往往直接造成花器官冻害，造成减产或绝产m 3 7 1 0h i l l p 驯 对蜂群活动规律作了较深入的研究，提出大多数的有效传粉归功于蜂群。但多数 情况下低温影响蜜蜂活动，影响授粉受精，因此适当的延迟花期对杏树生产极为 有利，在这种情况下，花期及时进行人工授粉，增产效果极为显掣。 仁用杏的各品种间均存在雌蕊败育的现象。张建光【4 0 认为，休眠期生理干旱， 可能导致杏花雌蕊败育。李隐生】发现，在兰州大接杏花芽分化后期，尤其是进 入雌蕊分化后，凡是花柱弯曲、向内回拢以及花柱萎缩的即形成败育花。 花粉粒在与柱头的相互作用下萌发。通常是以花粉的萌发孔突出花粉管为萌 发的标志。从传粉至长出花粉管需要经过一定的时间，这段时间的长短，因植物 而异。有些植物，花粉落到柱头上很快就萌发。水稻、高粱和甘蔗等，几乎是在 传粉后立即萌发。有些植物需要经过较长的时间才萌发。晴天授粉，茌梨需 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 4 0 m i n l 4 2 1 ，张建光1 4 3 1 研究发现，杏花粉授粉后2 h 就可以萌发进入柱头，5 0 h 进入 子房，授粉后4 天受精。苹果梨1 4 4 】的授粉花粉在柱头上约2 h 开始萌发，1 0 h 花粉 管通过柱头到达花柱上部的引导组织。 萌发的花粉呈亮白色，花粉管外壁发出一种特异的黄绿色荧光，这种黄绿色 的荧光团只有在苯胺兰诱导下对胼胝质具有专一性【4 5 】，花粉管是依赖其末端生长 的。当花粉管生长到一定的长度后，原来在花粉粒中的内含物全部集中到花粉管 的前端，花粉粒及花粉管老的区域为大的液泡占据，郑洲等嗍对杏授粉生物学的 研究指出萌发的花粉管顶端呈倒锥形，可继续生长，花粉管的顶端膨大呈球形， 花粉管停止生长。许多植物当花粉管长到相当的长度后，在距离花粉管末端的一 定距离形成胼胝质的塞。这可用苯胺蓝诱导荧光法清楚的显示，花粉管循着花柱 中的引导组织向下生长。山楂花粉管发育过程1 4 o ，种间杂交花粉管行为和早期胚 胎发生的观察1 4 s ，都是用苯胺蓝诱导荧光法观察的。因此，可以用苯胺蓝诱导荧 光法观察花粉萌发，花粉管进入柱头及子房的时期。 1 2 3 自交不亲和机制 关于杏坐果率低的原因，归因为管理粗放，树势衰弱，花期天气恶劣，低温 和霜害损伤了花器，不完全花的存在和自花结实率低，其中授粉受精不良也是比 较重要的原因之一吕增仁等f 4 9 1 研究发现，缺乏合适的授粉品种也是杏结实率低 的重要原因之一；一个优良的授粉品种，要与主栽品种有良好的亲和力和良好的 花粉生活力1 5 0 ，g u e r r i e r o 等【5 ”调查了4 1 个自交不亲和的杏品种，研究指出杏品 种授粉结实特性是一个很复杂的问题，值得进一步深入研究。 e g e aj 等【5 2 j 发现杏自交不亲和机制发生在花柱内，主要表现为花粉管在花柱 内停止生长。杏柱头产生分泌液，花粉在其中萌发，花粉管在花柱分裂和延长的 花柱细胞间基质物质中生长。在此过程中，不亲和的花粉管在某些点被抑制，可 穿透花柱长度的1 3 ，然后在顶端裂解。在杏中最普遍的情况是花粉管在花柱的3 4 处受阻，停滞。自交亲和性等位基因允许花粉管在花柱中生长，并到达胚珠；自 交不亲和性等位基因在当花粉粒和雌蕊呈现出相同的等位基因时，将阻止花粉管 生长【5 3 1 。 目前已从茄科、蔷薇科等多种植物中分离出s 核酸酶。苹果和日本梨的s 核 酸酶基因的初级结构已被报道。其基本结构特征与茄科的s 核酸酶相似，被称为 t 2 s r n a s e 型s 一核酸酶。s a s s ah 等【5 4 】研究发现苹果和日木梨的洲亥酸酶基因在氨 基酸水平上表现高度的同源性( 6 2 - 6 9 ) 。近来分离出扁桃和樱桃的s 核酸酶基 因型1 5 5 1 。它们在活性部位也具有t 2 s r n a s e 型s 核酸酶的结构特征，但在其它部 位具有李属的专一性，与苹果和日木梨的氨基酸同源性较低( 2 5 、3 0 1 【5 5 j 。现已 阐明了苹果、日木梨m j 、和甜樱桃【5 5 】的s 基因型。最近研究表明，杏自交不亲和 的机制与苹果1 5 ；q ，日木梨【5 8 】，扁桃5 川及甜樱桃f 5 5 】等蔷薇科植物相同，属于同型的、 由单个s 基因控制的配予体不亲和系统上的一个复等位基因s 位点控制【5 9 】， 4 冰核细菌对仁用杏授粉生物学特性影响的研究 b u r g o s 等删已经在9 个杏品种中，验明了与自交不亲和基因( s 1 ，s 2 ，s s 和s 6 ) 和自交亲和基因( s o 相关连的核酸酶，发现核酸酶同杏的配子体型不亲和相关连， 可能是s 基因的产物。 1 2 4i n a 细菌对杏花粉的影响 杏树上冰核细菌的发现为研究杏花期的霜冻害展开了一个新的领域。孙福在 等i6 l 】首次从河北地区l o 个杏品种上分离到1 9 株i n a 菌株，经细菌学鉴定为2 个 属中的2 个种? 只置p v s y r i n g a e 和eu r e d o v o r a 。前者活性高于后者。按3 产生一 个冰核所需细菌数量差异来划分冰核活性等级，结果表明，1 9 株菌株中，强菌株 占2 1 1 ，中等菌株占1 5 8 ，弱菌株占6 3 1 ，总体冰核活性属于中等。i n a 细 菌分布因地域环境影响而有一定差异，不同种类的i n a 细菌和菌株间的冰核活性 强弱也存在差异。 关于冰核细菌对花期霜冻害的影响已经进行了较为深入的研究，彭伟秀等1 6 2 1 应用透射电镜对几个仁用杏品种接种i n a 细菌并低温处理后的花粉超微结构进行 观察，发现冰核细菌对花粉超微结构的影响很大，可以使花粉壁的覆盖层在某些 区域解体消失或整个花粉外壁缺失，使花粉中的细胞器受到破坏，包括线粒体被 膜不完整，嵴呈囊泡状，内质网呈同心圆卷绕或折叠状排列包围部分细胞质而形 成膜内含物，核糖体数量明显减少等。因为花粉中细胞器的破坏，花粉细胞内部 形成一此空腔，花粉失去生话力接种冰核细菌并低温处理比单纯低温处理对花粉 超微结构的破坏程度加重。 冰核细菌对胚珠的超微结构有一定影响，使珠心细胞发生严重的质壁分离， 细胞质中存在大量泡状结构，线粒体的内部结构完全被破坏，呈透明状，而且有 些珠心细胞中形成同心圆状的多膜内含物，使胚囊中卵细胞的细胞核外膜膨胀， 甚至核膜局部解体，细胞质中细胞器减少这些变化致使胚珠发育不正常，影响受 精而导致减产或绝收接种冰核细菌并低温处理比单纯低温处理对胚珠超微结构的 破坏程度重。 1 3 研究目的及意义 杏是重要的经济林栽培树种之一，由于春季开花较早，经常遭受晚霜危害， 轻者出现减产【6 3 】，重者造成绝收【“6 5 1 ，花期霜冻害已经成为杏生产和发展的限制 因子之一。为了有效防止霜冻对杏造成的危害，必须弄清杏花期霜冻害的机理。 前人从不同的角度对杏树的霜冻机理进行了大量的研究，并取得很大的成功忡“ 6 8 以7 0 1 。已有的研究证明，杏树上广泛存在的1 n a 细菌是诱发和加重霜冻害的关 键因素。关于i n a 细菌与杏花期霜冻害的关系，前人已经从品种、器官抗寒性i ，“ 7 2 7 3 】，组织结构与超微结构【6 2 1 等方面探讨了i n a 细菌与杏花期霜冻害的关系，然 而关于i n a 细菌对杏授粉生物学的影响尚未见报道。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 本文从i n a 细菌对雌蕊和雄蕊过冷却点温度、花粉发芽率、生活力、花粉管 长度，授粉受精过程中花粉管伸长的荧光观察以及花粉和花柱的生理生化影响等 进行了深入的研究，这对于丰富和发展杏花期霜冻害的理论，制定合理有效措施 防御霜冻具有重要的意义。 6 冰核细菌对仁用杏授粉生物学特性影响的研究 2 1 试验材料 2 材料与方法 试材选自张家口蔚县常宁乡杏园的2 个仁用杏( p r u n u s a r m e n i a c a l i m a ) 品种 ( 优一和龙王帽) ，树龄7 8 年，生长健壮，管理水平较高。采树冠中部东、西、南、 北四个方位的大蕾期的花枝，长度2 0 - - 3 0 c m ，每个方向取2 0 个花枝，每株树共取 8 0 个花枝组成混合样。试验采用单株小区，重复3 次。将采集的大蕾期花枝带回 实验室内，1 8 恒温光照培养箱内水培。 试验于2 0 0 6 2 0 0 7 年进行，激素样品检测在河北昌黎果树研究所、河北大型 仪器分析中心完成。其它各项指标的处理和测定均在河北农业大学园林与旅游学 院植物栽培生理实验室进行。 2 2 试验方法 2 2 1in a 细菌对花药和柱头过冷却点温度的影响 2 2 1 1 材料的选取和接菌处理 分别选取优一和龙王帽2 个品种水培至盛开的花枝，挑选雌蕊高于或等于雄 蕊的花朵。将从仁用杏树上分离出来的中等活性的1 n a 细菌( pi s y r i n g a e ) 在 k b 平板培养基上培养3 d ，然后用灭菌的去离子水配成5 1 0 s c f u m l 的菌悬液， 倒入手压小喷壶( 己消毒) 后，在超净工作台上，将菌液均匀喷布在花药和花柱 上，以不接菌喷布灭菌的去离子水作为对照。 2 2 1 2 低温处理和测定 将两个处理的材料放入能够准确模拟自然霜夜降温过程的m s x 2 f 人工霜箱 内1 7 4 1 ，将p t - 1 0 0 型热电偶温度传感器探测头安置在雄蕊的花药上和雌蕊柱头上， 每个处理的每个部位用固定探测头3 个，然后，以1 0 5 h 的速度降温，温度传 感器与微机连接，f r o s t e m 4 0 数据采集系统采集数据，计算机自动记录数据、分析 花药和柱头表面温度变化，绘制温度变化曲线，精度士o 3 。根据结冰释放凝结热 的原理，植物组织一旦结冰就使温度骤然升高，使温度变化曲线出现峰值跳跃， 该峰的起点即是过冷却点“。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 2 2i n a 细菌对花粉生命力的影响 2 2 2 1 材料的选取和接菌处理 分别选取两个品种水培至盛开的花朵，将从仁用杏树上分离出来的i n a 细菌( 只 丑7 1 , s y r i n g a e ) 在k b 平板培养基上培养3 d ，然后用灭菌的去离子水配成5x 1 0 8 c f u m l 菌悬液，倒入手压小喷壶( 已消毒) ，在超净工作台上，将菌液均匀喷布 在花药上，以喷布灭菌去离子水的作为未接菌的处理，以1 8 ( 2 室温培养喷布灭菌的 去离子水采集的花粉为对照。 2 2 2 2 低温处理 将处理好的材料分批放入入工霜箱内，先以一1 0 c 0 5 h 的速度从室温降至2 c 左 右，在以l c o 5 h 分别降至o 、1 、2 、3 c 、- 4 、5 、- 6 后维持o 5 h ， 再以1 o 5h 速度升至室温。取出材料后马上测定花粉的生活力，发芽率和花粉管 的生长长度。以常温下采集的花粉为对照。 2 2 ，2 3 花粉生活力测定 采用过氧化物酶测定法f 7 5 i 测定花粉生活力，取少量花粉撒在干净载玻片上， 滴一滴联苯胺小萘酚染色剂，然后滴一滴0 3 过氧化氢溶液，经过3 - 5 分钟后盖上 盖玻片，用吸水纸吸干多余水分，在显微镜下观察，呈红色的花粉粒表示过氧化酶 存在，花粉有生活力，能发芽呈黄色或无色的表示无生活力。每个温度处理重复3 次，每片观察6 个视野。 2 2 2 4 花粉的发芽率的测定 采用离体培养法。将采集的各处理花粉播种于1 琼脂，1 0 蔗糖、o 0 1 硼酸 培养型刎上( 调p h 值6 5 ) ，在温度2 5 ，湿度8 5 左右的恒温培养箱内培养。分 别于培养1 2 h 和2 4 h 后，用普通光学显微镜镜检。计算花粉的发芽率和目镜测微尺 测量花粉管长度，花粉发芽以花粉管伸长是否超过花粉直径为准。显微镜下观察5 个视野，取其平均值。 2 2 3in a 细菌对花粉管生长的荧光显微镜观察 2 2 3 1 授粉用花粉的采集 将两个品种大蕾期的花药分别用镊子取下，于2 0 。c 室温内阴干，待花药开裂 散粉后，分别收集两种花粉放在小瓶中，置于干燥器中，4 冰箱中保存做授粉用。 8 冰核细菌对仁用杏授粉生物学特性影响的研究 2 2 3 2 接菌方法 对水培的花枝，待花瓣即将展开时去雄，将从仁用杏树上分离出来的i n a 细 菌( 户p v s y r i n g a e ) 在k b 平板培养基上培养3 d ，然后用灭菌的去离子水配成5 1 0 8 c f u m l 菌悬液，将菌液均匀喷布在雌蕊上，以喷布到柱头和花柱为主，以 不接菌喷布灭菌的去离子水作为未接菌的处理。 2 2 3 3 授粉方法和低温处理 用收集的2 个品种的花粉分别对两个品种接菌的处理和对照相互授粉，授粉 后继续再1 8 恒温光照培养箱内培养。对授粉后的两个品种的两个处理，分别于 授粉后4h 、2 4h ，进行2 低温处理，先以1 0 ，0 5 h 的速度从室温降至2 左右 以后，在以l ，o 5h 降至- 2 后维持0 5h ，再以1 o 5h 速度升至室温，并于 恢复4 h 、8h 、2 0 h 、4 4h 取雌蕊的花柱部分用f a a 液固定。以l s 培养箱内授粉 的雌蕊为对照。对照花粉花柱的采集时间段为授粉后4 h 、8 h 、1 2 h 、2 4 h 、3 2 h 、4 8 h 、 6 8 h 、7 2 h 。每个时间段分别采集不同处理和对照的5 个花柱用固定液固定。 2 2 3 4 花粉管生长的荧光显微镜观察方法 将f a a 液固定的花柱用蒸馏水冲洗3 次后，加入2 m o l l n a o h 溶液，6 0 下 软化，至柱头变成褐色，然后放入含有1m o l lk 2 h p 0 4 的0 1 水溶性苯胺蓝染色 液遮光染色1 2 h 后常规压片观察，盖上盖玻片后用镊子稍加压力，使花柱展开， 日本o l y m p u sb h 一2 荧光显微镜观察花粉管生长的情况，并用数码照相机拍照。 2 2 4i 细菌对花柱和花药生理生化的影响 2 2 4 1 材料的选择和接菌处理 分别选取两个品种水培至盛开的花朵，将从仁用杏树上分离出来的i n a 细菌 ( pn 肼s y r i n g a e ) 在k b 平板培养基上培养3 d ，然后用灭菌的去离子水配成5x 1 0 8 c f u m l 菌悬液，倒入手压小喷壶( 已消毒) ，在超净工作台内，将菌液均匀喷 布在花药和雌蕊上，以喷布灭菌的去离子水作为未接菌的处理。 2 2 4 2 低温处理 将处理好的材料分批放入人工霜箱内，先以一1 0 c 0 5 h 的速度从室温降至2 左 右，在以1 o 5h 分别降至o 、1 、2 、3 c 、- 4 、5 、6 后维持0 5h ， 再以19 c 0 5h 速度升至室温。将各温度处理的花药和花柱分别取0 3 9 分别测定各指 标。每个处理的各指标重复3 次。 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 , 2 4 3 指标测定方法 ( 1 ) s o d ( 超氧化物歧化酶) 活性测定采用n b t 光还原法1 7 蚰 ( 2 ) p o d ( 过氧化物酶) 活性测定采用愈创木酚法【7 h ( 3 ) 丙二醛含量测定 采用硫代巴比妥酸( t b a ) 显色法【7 5 】 ( 4 ) 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法【7 埘 ( 5 ) 可溶性糖含量测定采用葱酮比色法【鼬l ( 6 ) 内源激素含量测定 内源激素的提取与分析：万分之一天平称取不同温度处理下的花药和雌蕊0 3 9 ， 加入提取液( 异丙醇：冰乙酸= 9 9 ：1 ) 于研钵中冰浴研磨后转入离心管中，放入4 0 冰箱中浸提过夜后，在4 、1 0 0 0 0 r m i n 的条件下离心1 0 r a i n ，取上清液，用甲醇 活化，在过c 1 8 小柱，8 0 甲醇( 含1 冰乙酸) 液洗、干燥后放入迸样瓶。进样 体积均为1 0 0 斗l 。采用日本岛津高效液相色谱仪检测。系统进样器：s c l - 1 0 a v p ； 系统进样器：s i l 1 0 a dv p ；泵：l c 1 0 a tv p ；吸收波长2 5 4 n m 。0 8 m l m i n3 0 ； 示差折光检测器：s p d 1 0 a v p 。 1 0 冰核细菌对仁用杏授粉生物学特性影响的研究 3 结果与分析 3 1i n a 细菌对花药和柱头过冷却点的影响 表1i n a 细菌处理后花药和柱头的过冷却点温度 t a b l e ie f f e c t s o f l n a b a c t e r i a o i ls u p e r c o o l i n g p o i n t o f a n t h e r a n ds t i g m a 注：表示t 检验p = 0 o l 水平下的显著性差异 n o t e ：* r e p r e s e n ttt e s ta tp = 0 0 1t h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i n a 细菌处理后花药和柱头的过冷却点变化见表l 。由表l 可以看出，优一花 药和柱头的过冷却点温度分别为- 4 6 和一3 8 c ，龙王帽花药和柱头的过冷却点温 度分别为4 0 c 和2 4 c 。接种1 n a 细菌后，极显著提高了花药和柱头的过冷却点 温度，优一的花药的过冷却点温度升高到了2 5 。c ，比对照提高了2 1 ，柱头的 过冷却点温度升高到了2 2 ，比对照提高了1 6 。 两个品种不同部位间的冰点温度有很大差异，花药的过冷却点温度低于柱头， 优一花药的过冷却点温度为- 4 6 c ，柱头的过冷却点温度为- 3 8 ，花药的过冷却 点温度低于柱头o 8 c 。龙王帽花药的过冷却点温度为- 4 0 c ，柱头的过冷却点温 度为3 0 c ，花药的过冷却点温要低于柱头1 。 对两个品种问比较，优一的过冷却点温度和结冰温度低于龙王帽，优一花药 的过冷却点温度为- 4 6 c ，龙王帽花药的过冷却点温度为- 4 o ，优一的花药的过 冷却点温度低于龙王帽0 6 c 。优一柱头的过冷却点温度为- 3 8 c ，龙王帽柱头的 过冷却点温度为3 o ，优一柱头的过冷却点温度低于龙王帽0 8 c 。