（分析化学专业论文）薄层色谱法和高效液相色谱法综合考察签字笔油墨.pdf

首都师范丈学硬士学位论文 中文摘要 随着计算机和网络的发展，电子通信，电子署名和整体电子经济业务变得越来越流 行，但是笔墨书写的文件依然是人们在商业交往中广泛使用和信任的法律文件。因此， 可疑文件的检测依然是法庭科学中的重要课题。本文主要针对国内外不同生产厂家的9 0 种黑色签字笔和9 4 种蓝色签字笔进行色谱法分类的研究，主要包括薄层色谱法( t l c ) 和高效液相色谱法( h p l c ) 。 首先，本文概述了油墨的主要成分，包括染料、溶剂、树脂、抗氧化剂，耐热裁、 防水剂以及耐光剂等。并对薄层色谱法、高效液相色谱法在该领域的研究进行了总结。 其次，通过薄层色谱法、高效液相色谱法对样品笔进行了系统的分析。其中，薄层 色谱法由于操作方便、廉价、快速等优点得到广泛应用。根据油墨中不同的化学组分在 薄层板上产生的斑点的个数、颜色以及比移值的不同对签字笔进行分类。根据本实验的 薄层色谱条件，将黑色签字笔分为9 类，蓝色签字笔分为l l 类。薄层色谱法分辨能力 有其局限性，无法区分组分的微小的差异，而高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和分 辨率，因此，研究了高效液相色谱法对这些签字笔进行进一步分类的可能性。最后在实 验中，找到了分别适合黑色签字笔和蓝色签字笔分析的色谱条件。使用p u r o s p h e rs t a g c 1 8 色谱柱，在黑色签字笔和篮色签字笔的流动相中分别加入了四丁基氢氧化铵离子对 试剂( o 0 0 4 9 m l ，p h 6 5 ) 和碳酸氢铵缓冲盐( 1 0 m m o l l ，p h 8 o ) ，二极管阵列检测器 对4 0 0 - 7 0 0 n m 进行扫描。最后，在薄层色谱分析结果的基础上，进一步分析黑色签字笔 和蓝色签字笔。 关键词：法庭科学，签字笔，油墨，薄层色谱法，高效液相色谱法 首都师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fc o m p u t e ra n di n t e m e t , e l e c t r o n i cc o m m u n i c a t i o n , e l e c t r o n i c s i g n a t u r e sa n daw h o l ea r r a yo fe l e c t r o n i cb u s i n e s s 仃a n 8 a c d o n sb e c o m em o r ea n dm o r e p o p u l a r , b u tt h ei n k - b a s e dd o c u m e n tr e m a i n sw i d e l yu s e da n dt r u s t e df o ra n y b u s i n e s sa n d l e g a ld o c u m e n t s s ot h ep r o b l e mo fq u e s t i o n e dd o c u m e n tr e m a i n sav e r yi m p o r t a n tp r o b l e m i nf o r e n s i cs e i e n c e i nt h i sa r t i c l ew er e s e a r c h e do nt h ee l a s s i f i c a t i o no f9 0k i n d so fb l a c k s i g n i n g - p e n sa n d9 4k i n d so fb l u es i g n i n g - p e n s ，w h i c hm a n u f a c t u r e db yt h ed i f f e r e n t d o m e s t i ca n df o r e i g nf a c t o r i e s i nt h i sp r o j e c t ，v a r i o u st y p e so fc h r o m a t o g r a p h yf o rt h e i d e n t i f i c a t i o no fi n k sw e l ei n v e s t i g a t e d ，i n c l u d i n gt h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) a n dh i 曲 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) f i r s t ，w es u m m a r i z e dt h em a i nc o m p o s i t i o no f i n k si n c l u d i n gd y e s t u f f , s o l v e n lr e s i na n dr e s i s t a n c et oo x i d a t i o n ，h e a t , l i g h t ，w a t e r , e r ea n d t h e nr e c a p i t u l a t e dt h ed i s c r i m i n a t i o no fq u e s t i o n e dd o c u m e n t sb yc h r o m a t o g r a p h yi n c l u d i n g t l ca n dh p l c s e c o n d l y , w es y s t e m a t i c a la n a l y z e do nt h es i g n i n g - p e n sw i t ht h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) a n dh i g lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t l ci sav e r yp o p u l a rt e c h n i q u ed u et ot h ee a s eo f n s e ，s p e e da n dc o s te f f e c t i v e n e s s t h er e t a r d a t i o nf a c t o r , r fv a l u eo fac o m p o u n do fi n ki sd e p e n d a n to nt h ea b s o r b e n ta n d m o b i l ep h a s e , a n dt h en u m b e r sa n dc o l o u r so fs p o t sc a nb eu s e dt oi d e n t i f yt h ed i f f e r e n c a a m o n gt h ei n k s i nt h ec o n d i t i o no ft h i se x p e r i m e n t ，t h eb l a c ks i g n i n g - p e n sa r es e p a r a t e di n t o 9k i n d s ，a n dt h eb l u es i g n i n g - p e n sa r es e p a r a t e di n t o11k i n d s t h er e s o l u t i o no ft l ci s l i m i t e da n dc a no f t e np r o v ei n c a p a b l eo fd i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nd i f f e r e n tb a t c h e so fi n kw i t l l t h e8 a h eg e n e r a lc o m p o s i t i o n h p l cc a ni m p r o v et h ea b i l i t yt od i s t i n g u i s hb e t w e e ni n k s o w i n gt ot l l e i rg r e a t e rs e n s i t i v i t ya n dr e s o l v i n gp o w e r w ee x p l o r e da l lh p l cm e t h o dt o i d e n t i f yt h e s es i g n i n g - p e n s t h em e t h o di n v o l v e dt h eu s eo fap u r o s p h e rs t a rc o l u m n , w i t h t b a ( o 0 0 4 9 m l , p h 6 5 ) a n dn h 4 h c 0 3 ( 1 0 m m o u l ，p h 8 o ) i nm o b i l ep h a s ew h i c hi ss u i t a b l e f o rb l a c ka n db l u es i g n i n g - p e n ss e p a r a t e l y , a n dad i o d ea r r a ym u l t i w a v e l e n g t hd e t e c t o r s c a n n i n gf r o m4 0 0 - 7 0 0n n l h p l cw a sc a p a b l eo ft h ed e t e c t i o no f s u b t l eb a t c hd i f f e r e n c e s ， n o t d i f f e r e n t i a t e d b y t l c f i n a l l y , o n t h e b a s e o f t h e t l cr e s u l t s , b l a c ks i g n i n g - p e n sa n d b l u e s i g n i n g - p e n sw e r ec l a s s i f i e da g a i n k e y w o r d s ：f o r e n s i cs c i e n c e , s i g n i n g - p e n ，i n k s ，t l c ，h p l c i ；i 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表 或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：刁老遍 日期：d 7 年月7 日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论 文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非 赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有 关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后 适用本规定。 学位论文作者签名： ；长柏 日期：口7 年g 鼠日 首都拜蓖大学硬士学位论文 1 1 课题的重要性和意义 第一章绪论 在我们的社会中，文件的法庭科学检测是非常重要的，因为文献记录着我们生活中 所发生的一切事情。从我们的出生证明到死亡证明以及在出生到死亡的( 即我们的生活) 过程中，收据、契约、功绩、合同、支票、遗嘱、出售协议、贷款、医疗记录、税收等 时刻伴随着我们。在诉讼的过程中，所有这些文件的有效性都是可疑的，实际上，在社 会中伪造文件是新闻和媒体报道的强奸，谋杀，爆炸，绑架，纵火及其他暴力事件以外 发生的最常见的犯罪。然而，每年有关文件涉及大量金额案件的发生率比暴力犯罪要多 很多。因此，对收据、发票、借条、公章、契约、合同和批件等各种可疑文件上字迹鉴 定的工作倍受关注。为此，建立签字笔油墨字迹的准确、可靠的分析检测方法，可以鉴 别笔的种类、成分、生产厂家、批号，因此油墨鉴定的研究有着重要意义。 1 2 国内外书写油墨的色谱检测方法的概述 为了正确评价当前法庭科学中油墨的分类以及鉴定书写时间的状况，有必要了解这 个领域的先驱们所做的工作。他们的工作为本课题的研究方法奠定了基础。由于签字笔 是一种新型的书写工具，所以一直以来，各国对签字笔检测方法的研究并不多，主要还 是针对传统书写工具圆珠笔进行分析。所以我们先分析研究圆珠笔检测方法，借鉴 其经验，从而完成对签字笔这种新型书写工具的分析。主要包括色谱法有薄层色谱法 ( t l c ) ，高效液相色谱法( l p t l c ) ，气相色谱法( g c ) ，毛细管电泳( c e ) 以及色谱 质联用技术。 1 2 1 薄层色谱法( t l c ) 1 9 3 8 年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。薄层色谱 ( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 常用t l c 表示，又称薄层层析，属于固一液吸附色谱。薄 层色谱是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。薄层色谱法工作的过程是 首先将要分离的混合物点在用固定相均匀涂布的薄板的一端，然后将薄板的这端浸入 流动相，在流动楣浸湿薄板的过程中。样品随着流动梗被展开，不同的组分随流动相以 l 首都师范大学硕士学位论文 不同的速度向前移动，最终保留在薄板上的不同位置，从而达到分离的目的；再用适当 的方法对不同的组分进行检测，就可以定性或定量的对样品作出分析。此时的固定相被 称为载体或吸附剂，而流动相被称为展开剂，被展开的样品叫做斑点。在法庭油墨分析 中使用最多的是薄层色谱法，其主要原理是油墨中非挥发性物质的迁移速度不同，从而 会使它们分为“谱带”状。薄层色谱法既可以分离油墨中的染料，也可以分离油墨中的 一些其它的有机组分。通过这一点，我们可以在同一块薄层板上对油墨进行鉴定，还可 以通过薄层色谱光密度扫描仪来测定染料组分的相对浓度。与其它方法相比，薄层色谱 法( t l c ) 在油墨的检测中成本低、灵敏度高、速度快、取样量小、对样品预处理要求 低、改变参数比较容易等优点。 z l o t n i c k 综述了自1 9 5 0 年以来色谱技术在墨水分析方面的进展，包括薄层色谱法、 气相色谱法、液相色谱法等1 。王岩等1 2 对所研究的蓝色圆珠笔油墨提出了较理想的的 薄层色谱扫描条件并进行了溺定。李继民用t l c 法对国内市场上收集到的3 2 种蓝色圆 珠笔油墨进行了分析，将这些笔分为五大类，并对每一类样品进行了鉴别【3 j ，同时对市 售1 5 种不同厂家、不同品牌或同品牌不同规格签字笔油墨的成分进行了分析并通过 t l c 和红外光谱对这些笔进行了测定 4 1 。任玲用t l c 法对市场上常见的1 2 种已知黑色圆 珠笔进行了鉴别同，谢朋等人采用新型薄层色谱法，通过使钢笔墨水色料以“斑环”的 形式展开，对钢笔墨水种类进行了鉴定阿。关于油墨书写时间的鉴定，有学者利用薄层 色谱法分析了圆珠笔油墨样品，选出了最佳展开体系，分析红色、蓝黑色、纯蓝色油墨， 并确定了染料随时问的变化规律，不仅能够鉴别油墨中的染料，而且通过树脂中两个成 分的比值随时间变化而得出变化曲线【7 8 9 1 0 1 。赵鹏程等1 用t i c 法对书写时间在8 个 月内的蓝色圆珠笔油墨的染料成分的变化进行了定量分析，根据t l c 扫描仪在5 8 0 n m 下对各斑点的扫描结果确定了蓝色圆珠笔油墨中碱性紫和铜酞菁染料的峰高比值随时 间的变化关系。a g i n s k y 【1 2 】研究了一种根据t l c 法直接测定分离组分( 树脂和染料) 的 质量比的方法来测定圆珠笔色痕的书写时间，该方法比用峰信号比例得到的结果更为可 靠。j a s u j a 应用双溶剂体系提取了2 0 种( 蓝、红和绿色) 打印墨水，用t l c 进行了分 析”。a g i n s k y 采用t l c 法，用三种展开剂，进行三步分离，对多种墨水中的约1 2 0 种 合成色素和染料进行检测分析，分析结果比较可靠有效，这种方法目前被俄罗斯刑事科 学实验室广泛使用；a g i n s k ) j 1 4 】还运用氯仿、四氯化碳和其它合适溶剂对墨水进行萃取， 用含荧光指示剂的t l c 板展开，建立了工作曲线，对墨水书写时间进行鉴定，以高效 2 首都师范大学硕士学位论文 薄层色谱( h p t l c ) 法分离提取物，荧光淬灭扫描技术对墨水书写时间进行鉴定，他们 又研究了一种新的方法一质量比对法f 旧，先从五个已知书写时间的样品中，通过提取 不同体积的待测液，在一块板上同时绘制五条标准曲线，然后再根据绘出的曲线，测定 未知样品的书写时间。这种方法突出之处是得到了油墨的老化程度与油墨中组分质量的 直接比例关系，该法结果较可靠。 李继民对市售1 5 种不同厂家、不同品牌或同一品牌不同规格签字笔油墨的成分进 行分析。考查了不同种溶剂对1 5 种签字笔油墨的提取能力，确定出较佳的提取溶剂，并 采用均匀设计法选出了最佳的展开剂。测定了1 5 种签字笔油墨的薄层色谱，获得了满 意的结果【1 q 。黄建同筛选出有效的提取剂9 5 5 的乙醇：水( 1 ：1 ) ，选择的展开剂为正丁 醇：无水乙醇：水：冰醋酸= 6 ：2 ：2 ：1 【1 7 1 。 1 2 2 高效液相色谱法( h p l c ) 法庭科学中，高效液相色谱法以其分离效能高、灵敏度高和样品用量少等特点而倍 受关注，但目前高效液相色谱法仅对少量样品作了初步的探索、分析。在这方面的应用 也有一些报道t 1 3 1 9 , 2 0 1 。1 9 8 0 年初期，h p l c 开始用于研究字迹书写形成的时间，1 9 8 2 年l y t e r 等人【1 8 诵h p l c 法对十种圆珠笔油墨进行了定性和定量鉴别，同时又对四种相 同配方但批次不同的样品进行了分析鉴定【2 n 。1 9 9 8 年c - h e n g 和p l l 用h p l c - d a d ( 二 极阵列检测器) 对1 6 种不同种类的墨水( 8 种为蓝色，8 种为黑色) 进行分离、分析， 将这些墨水逐一区分开来嘲。运用这种方法还能对墨水的书写时间作出准确的鉴定，通 常墨水变干的时间是3 5 个月，如果在5 个月以上的可疑样品中检测到易挥发性的组分， 便可判定该样品为伪造的。2 0 0 1 年k h e r 用主成分分析( p c a ) 对用h p l c - d a d 对文档 中相同颜色的可疑圆珠笔油墨进行分析鉴定，并对取自5 个不同厂家的两组十六种圆珠 笔墨水( 8 种为蓝色，8 种为黑色) 替换进行分析，结果两组中不同种类的墨水都能被 一一鉴别开来，化学计量学的方法配合h p l c p d a 法庭化学方法适合用于庞大而复杂 的数据分析【2 3 1 。a n d r a s k o 等探讨了在不同光照条件下保存的圆珠笔油墨书写的文件的情 况，他们将书写的笔画分别放置在日光下和荧光灯下进行照射，将油墨笔画从文件上提 取下来后用h p l c 进行分析，发现在光照条件下油墨的成分发生了显著变化，并用三相 图对蓝色圆珠笔油墨染料的变化情况进行了分析 2 4 1 。他们又研究了写在日记本和笔记本 上的圆珠笔油墨书字迹( 贮存在暗处的情况下) ，比较字迹形成的相对时间，并用三相 图表示油墨中染料的变化情况。得出了字迹五年间的变化曲线【2 冠，发现所研究的油墨如 3 - 首邦师范大学硕士学位论文 果在1 0 0 ( 2 下加热4 h ，其相当于正常条件下老化四个月；如果在日光下曝光l 天，基本 相当于在暗处存放一个月，结果与人工老化的情况的结果相同，他们还对纸张的影响作 了研究。李继民【2 6 】采用s p h c r i s o r bc 1 8 柱。以甲醇：水- - 6 5 ：3 5 做流动楣。对不同厂家 及不同生产批号的圆珠笔油墨种类进行鉴别研究，接着他们又分析了1 5 种圆珠笔书写 字迹形成的相对时间，发现油墨的变化最初一个月的交化较大的规律c 2 7 l 。b u e r g i 用h p l c 分析了圆珠笔和自来水笔墨水中的游离态的芳香胺，其结果与二极管阵列检测器和半定 量g c m s 分析的结果相吻合郾l ，并证明通过g c m s 和h p l c 分析了从圆珠笔油墨中 释放出来的苯胺和甲苯胺，两种方法均能得到一致的结果【2 9 】。 许英健等使用高效液相色谱法分析黑色签字笔字迹色痕，实验中，以甲醇水( 6 0 ：4 0 ) 为提取剂对4 9 种不同产地、不同牌号的黑色签字笔字迹色痕进行了有效的提取，所得提 取液进行了反相离子对色谱分析，依据所得色谱图中峰的个数、峰的保留时间、峰形等数 据，可将其分为八大类【3 0 l 。 1 2 3 气相色谱法( g o 气相色谱法是一种高分离效能、高选择性、高灵敏度、高分析速度和应用广泛的一 种分析方法。在法庭科学中，气相色谱法主要用于圆珠笔油墨中一些挥发性溶剂成分的 分析。s 。c r a s t o g i 【3 l j 在1 9 9 1 年运用气相色谱法对2 9 种圆珠笔浊墨中的溶剂成分进行了 测定，并通过g c m s 对结果进行了统计分析。在其报告中详细描述了实验条件的优化 以及方法的准确度和局限性。a g i n s k y t 位】用g c 与分光光度计结合进行墨水书写时间的 鉴定，后来该作者又用内标定量法测定油墨中所有的溶剂和有色染料，通过各溶剂问及 溶剂与染料间的比例，建立了多条工作曲线来确定墨水的书写时间，提高了鉴定的准确 性，他们采用强弱溶剂两步萃取程序，应用弱极性溶剂萃取物的百分数来确定墨水的书 写时间。汪聪掣强】采用气相色谱法绘制了圆珠笔油墨中苯甲醇和苯酐含量比值随时间变 化的规律曲线，从而实现了对上海、武汉、天津和长沙地区的4 2 4 # 型蓝色圆珠笔的分 类和书写时间的鉴定。该法成功区别了近期和2 3 个月以后书写的文档的真伪。 i 2 4 毛细管电泳( c e ) c e 是相对较新的一种分离技术，与h p l c 相比，它具有更有效的分离功能，而且 快速、重现性好、所需的样品和溶剂较少。在法庭科学中，已成功应用于药物、炸弹爆 炸残留的有机物和d n a 的分析3 4 1 。f a n a l i 等人应用c e 可对黑色和红色水溶性墨水 4 首都师范大学硕士学位论文 进行分离1 3 5 1 。用c e u v v i s 检测器对水溶性墨水进行分析，在所选择的条件下，1 5 种 由不同厂商或不同国家生产的墨水中的成分都能在3 0 分钟内达到基线分离，同种颜色 的不同墨水也能从电泳图上区分开来，经多次实验和隔天考察，其重现性都很好【3 6 】。v o g t 等还采用c e 结合u v v i s 检测器、荧光检测器和p i x e 技术对微溶或不溶于水的圆珠笔 墨水进行分离检测【”l 。r o h d e 用毛细管电泳一紫外一可见激光诱导荧光检测器，于 1 0 0 m m ，p t - i = 8 0 含2 0 甲醇的硼酸缓冲液介质中分离、检测了不同厂商的1 7 种水溶 性蓝、黑钢笔墨水，纸上提取样品和采自原产地比对样品的电泳图谱有显著差异，可以 说明毛细管电泳是用于文档中水溶性墨水鉴定的强有力的工具【3 8 】。m a t y s i k 用循环伏安 法和毛细管电泳研究了各种水不溶解的染料，如碱性红2 8 ，碱性蓝8 ( 耽碱性绿l0 i ) 和溶剂蓝7 0 ( 1 1 1 ) 等，在非水介质中，用c e - - e d 进行分离、检测【3 9 1 。z l o t n i c k 等人对 一些黑色滚珠笔墨水进行了分离和分析，得到一些有用的数据1 4 0 1 ，但是该法目前仅处于 理论研究和种类的鉴定阶段。张建华等人用毛细管电泳法分析了微量蓝色圆珠笔油墨的 方法1 4 1 】，探讨了缓冲体系提取渡、提取时间、进样量等因素对圆珠笔油墨分离的影响， 他们还用正交法优化了分析蓝色圆珠笔油墨的缓冲体系1 4 2 1 ，并用胶束电动毛细管色谱法 鉴别了蓝色圆珠笔油墨【4 3 1 。 在墨水真伪和书写时间的鉴定分析中，c e 毛细管电泳是相对较新的一种分析技术， 它具有强大的分辨力，所需的样品量小，无疑将是一种很有潜力的技术畔；4 5 l 。 1 2 5 色谱一质联用技术 色谱一质谱联用技术很适于组成比较复杂的墨水的鉴定。s a k a y a n a g i 等用f d m s 对 2 1 种含蓝、黑、红三种颜色的圆珠笔墨水中的基本染料成分进行分析，并将这种方法应 用于实际案例检材的的鉴定，不需色谱的分离，所需的样品量少，仅用l m m 长的笔画 就可用于提取分析 4 6 1 。a g i n s k y 曾采用t l c 分离，m s 分析检测被提取物的方法进行墨 水书写时间的鉴定【4 ”，用t l c 、g c 和g c m s 在一些案例分析中的应用发现：g c m s 法得到的结果准确最好、效率最高【4 ”。他们还采用g c m s 对笔迹、喷墨打印机的油墨 等进行书写时间的鉴定【4 9 l ，并进一步对测定墨水中挥发性组分的g c m s 法和检测墨水 中染料成分的t l c 法进行比较，结果证明：g c m s 的鉴定结果更准确，重现性更好， 受温度、湿度等条件的影响小；测定易挥发性组分进行鉴定的准确性要高于测定染料成 分的准确性踟。h p l c m s 由于建立方法较难，对操作者专业技术的要求较高，目前还 未见报道。相信色谱一质谱技术将会在未来的墨水真伪、书写时间鉴定方面起重要作用。 5 首都师范大学硕士学位论文 2 1 概述 第二章黑色签字笔的t l g 和h p l c 分析 在法庭油墨分析中使用最多的是薄层色谱法，薄层色谱法既可以分离油墨中的染 料，也可以分离油墨中的一些其它的有机组分。通过这一点，我们可以在同一块薄层板 上对油墨进行鉴定，还可以通过薄层色谱光密度扫描仪来测定染料组分的相对浓度。由 于薄层色谱法具有一些其它方法不可代替的优越性，因此目前薄层色谱法( t l c ) 在法 庭科学鉴定圆珠笔油墨领域得到广泛的应用。 液相色谱与薄层色谱在许多方面具有相似性，但是与薄层色谱相比，它属于封闭 系统，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其分离效率、检测灵敏度高，在线检测 和自动化操作能力远远高于薄层色谱。在油墨的鉴定中，二者可以互相补充。通常用t l c 进行前期的初步分类后，再通过高效液相色谱对一些t l c 无法区分的情况进行进一步的 鉴定。 本实验的创新之处在于在t l c 分类的基础上进行液楣色谱分析，因为t l c 只是对签 字笔进行了初步的分类，利用液相色谱法的优点对t l c 中的同一类笔中的多支签字笔进 行再次分类，比较同一类签字笔的色谱图的异同进行再次分类，找到与薄层的斑点相对 应的色谱峰。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器、试剂及器材 仪器：p h 计、紫外灯( 2 5 4 n m ，3 6 5 n m ) 、c a m a gr e p r o s t a r 3 薄层色谱软件_ l r i n c a t s 数码相机系统、w a t e r s 6 0 0 液稆色谱仪( w a t e r s6 0 0c o n t r o l l e r ，d e l t a 6 0 0 检测器： w a t e r s 2 9 9 6 ) 。 试剂：甲醇、无水乙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、三氯甲烷、冰醋酸、水、乙酸乙 酯、丁酮、n ，n 一二甲基甲酰胺( d 盯) 、四丁基氢氧化化铵、n i 吼h c & 、浓磷酸( 以上试 剂均为分析纯) ，甲醇( 色谱纯) 。 6 首都师范大学硕士学位论文 器材：无荧光纸( 百旺牌a 4 打印纸) 、手术刀、剪刀、直尺、0 5 m l 带塞锥形小管、 5 m l 锥形小试管、迸样器、封口膜、微过滤膜( o 4 5 “m ) 、硅胶板g f 。，规格l o o m m x l o o m ，( 青岛海洋化工厂) 、薄层色谱展开缸( 上海信宜仪器厂制造) 、玻璃点样毛细管 ( 内径0 。5 m ，华西医科大学仪器厂生产) 。 2 2 2 实验方法 t l c 实验步骤： 硅胶板的活化：使用前将硅胶板置于1 0 0 c 下，活化3 0 m i n 。 展开剂的配置及饱和：正丁酮：无水乙醇：水：冰乙酸= 1 4 ：1 0 ：6 ：1 。 样品溶液的制备：将不同编号的签字笔在纸张上划直线制样，用洁净的手术刀片从 样品上划取2 c m 长，并分成数段放入0 5 m l 带塞锥形小试管中，分别加入2 0ul5 0 乙 醇溶液，在室温下进行提取l o m i n 。 点样：在硅胶板上进行点样，点样体积约为5 ul 。在点样过程中秉承“少量多次” 的原则，而且每一次都要在前一次点样完全干透后进行。 样品展开：待样品完全干透后，将硅胶板置于相应的饱和的展开剂中。展开后，将 硅胶板取出，冷风阴干。 结果记录：分别在可见光以及紫外灯照射下进行观察并拍照，记录各签字笔油墨 展开后的斑点个数、颜色以及比移值。 h p l c 实验步骤； 缓冲溶液的制备：0 0 0 4 9 m l 四丁基氢氧化铵水溶液，用浓磷酸调节p h 值至6 5 。 待测液的制备：将不同笔在纸张上划直线制样，用洁净的手术刀片从样品上划取长 5 c m ，宽2 m ，并分成数段置于锥形小试管中，用5 0 0 i i l 提取剂( 甲醇：水- - - - 6 0 ：4 0 ) 常温 下提取l o m i n 后过膜，取l o l al 进行液相分析。 高效液相色谱分析：柱子：p u r o s p h e rs t a r2 5 0 4 6 5 ；柱温：室温；进样量： l o u l ；流速：1 o m l m i m 检测波长：5 8 0 n m ；流动相：甲醇：水( o 0 0 4 9 m l 四丁基氢氧 化铵水溶液，p h 6 5 ) = 4 2 ：5 8 。 7 首都师范大学硕士学位论文 2 3 结果与讨论 2 3 1t l e 条件的讨论 提取剂的选择。在薄层色谱法测定签字笔油墨的实验中，对于萃取签字笔字迹的溶 剂，应选用对签字笔中组分溶解度相对较小但萃取的物质种类又尽可能多的溶剂( 如果 溶鳃度过大，在点样过程中容易出现斑环影响斑点的形状) ，并且粘度不宣过高，沸点 适中。本实验中，根据常用溶剂极性、沸点，随机抽取签字笔l o 支，根据2 2 2 的实验 方法对提取后的纸张上的残留情况进行比较，结果发现对于签字笔字迹的提取，甲醇、 乙腈、5 0 z 醇、n ，n - - - 甲基甲酰胺效果较好，提取比较完全，n ，n 一二甲基甲酰胺( d m f ) 提取后的纸张上几乎不存在残留物，但是由于n ，n 二甲基甲酰胺的沸点较高，因此不做 为提取剂的首选。同时，考虑试剂的毒性和价格，最终选择5 0 乙醇溶液作为黑色签字 笔的提取剂。 展开剂的选择。在薄层色谱法对签字笔油墨的分析中，因为展开体系决定性的影响 着吸附的选择性和待分离物质的比移值( r f ) ，因此必须选择能够使签字笔油墨中的物 质很好的分离的展开体系。分析本实验中所有签字笔，结果发现，黑色签字笔最合适展 开体系是正丁酮：无水乙醇：水：冰乙酸= 1 4 ：1 0 ：6 ：1 。 展开体系饱和时间的选择。饱和时间2 0 m i n ，4 0 m i n ，l h ，2 h ，3 h ，4 h ，5 h ，6 h 的展开剂体 系进行了考察，结果表明当饱和时间达到4 h 时，展开效果较好，不仅斑点能够得到很 好的分离，而且不出现拖尾现象和边沿效应。 纸张的影响。本试验进行了纸张空白的实验。实验中选取了试验所用的百旺牌a 4 打印纸，分别按2 2 2 的实验方法进行操作。结果表明；在白光照射下，硅胶板上未出 现任何染料的斑点。在紫外灯照射下，出现三个荧光斑点，但可以通过扣除本底的操作， 消除纸张的影响。 重瑰性的考察。实验条件和实验技术直接影响实验数据的重复性，因此，找出影响 实验数据的主要因素，在实验中加以控制，对于达到误差要求是很重要的。在该实验过 程中，需要注意以下因素：( 1 ) 板的干燥程度、( 2 ) 实验室的湿度、( 3 ) 层析板的薄层厚度、 ( 4 ) 点样技术、( 5 ) 实验室温度。 首都师范大学硕士学位论文 2 3 2i i p l c 条件的讨论 签字笔油墨字迹色痕的萃取过程并非简单的溶解过程，而是溶剂和色痕之间发生了复杂的物理 变化过程。提取剂种类、提取时间、提取方式，都会对提取的效果产生影响。我们以提取液的吸光 度作为衡量标准，考察了以下几个方面的影响因素。 2 3 2 1 字迹提取条件的选择 提取剂种类。提取剂的性质对色痕的提取效果有很大的影响。本实验中，根据常用 溶剂极性、沸点，取代表性的签字笔1 1 2 在无荧光纸张上划线，并截取l o c m 剪碎，放 入1 5 m l 小烧杯中，分别加入有机溶剂l o m l ，在室温下进行提取l o m i n ，肉眼观察几种 提取剂的提取效果，包括：乙腈，甲醇，乙腈水，甲醇水，异丙醇，正丁醇，乙酸乙酯， 二甲亚砜，n ，n 一二甲基甲酰胺，三氯甲烷等。实验证明甲醇水和乙腈水的提取效果 都较好，但是考虑到提取剂应该尽量与流动相保持一致的原则，以及试剂价格等多方面 因素，所以最后选择甲醇：水( 6 0 ：4 0 ) 作为签字笔的提取剂。 提取时间的考察。提取时间的长短对色痕的提取效果也是有很大影响的。本实验中， 用签字笔1 1 2 在无荧光纸张上划线，并截取l o c m 剪碎，放入1 5 m l 小烧杯中，分别加入 所确定的提取剂( 甲醇：水= 6 0 ：4 0 ) l o m l ，在室温下，分别提取o m i n ，5 m i n ，l o m i n ， 2 5 r a i n ，3 0 r a i n 。通过紫外可见分光光度计检测提取液的吸光度( 表2 - 2 ) 。从而确定最佳 的提取时间。实验中，以提取时间作为横坐标，吸光度作为纵坐标作图( 图2 1 ) 。从图 中可以看出，提取液的吸光度随提取时间的增大而增大，当提取时间大于1 5 m i n 后，吸 光度变化减小。考虑到实验操作的情况，最后选择的提取时间为l o m i n 。 表7 - 2 不同提取时间下，所得到提取液的吸光度值 提取时问o m i na 皿l nl o m i n1 5 r a i n3 0 r a i n 1 1 2 吸光度0 1 4 8 0 1 6 1 0 1 7 10 1 7 6 0 1 7 8 9 首都师箍大学硕士学位论文 图2 一l1 t 2 吸光度值随提取时间的变化趋势 o 2 魁0 1 8 芸 娶0 。1 6 0 1 4 o51 01 52 02 53 03 5 提取时间( r a i n ) 提取方式的考察。提取方式的选择对色痕的提取效果也是有很大影响的。本实验中， 用签字笔1 1 2 在无荧光纸张上划线，并截取l o c m 剪碎，放入1 5 m 小烧杯中，分别加入 提取剂( 甲醇：水= 4 0 ：6 0 ) l o m l ，在室温下，分别通过四种方式提取l o m i n ，包括静置、 翅声、离心、超声后再离心。通过紫铃可见分光竞度诗检溅提取液钓吸光度，扶而确定 最佳的提取方式。从试验结果我们发现，超声后1 1 2 提取液的吸光度值明显大于其他三 r 方式，但是由于超声使纸张纤维也被破坏，以致干扰检测。所以试图将超声后的提取 液离心，排除纸张的干扰。但离心后，提取液的吸光度与静置提取的方法相比，差别并 不大。所以从试验可操作性上考虑，我们选择了静置作为最佳的提取方式。 表2 - 3 采用不同提取方式，所得到提取液的吸光度值 i提取方式 静置超声离心 超声后再离心 i1 1 2 的吸光度0 0 9 90 1 7 0 0 t 2 7o 1 2 3 2 z 色谱条件的选择 在色谱分离中选择理想的流动相，可提供所需的选择性、柱效能并在最少时间内完 成分析。流动相的选择由所测的物质的性质和结构有关。h p l c 对流动相的基本要求： 不与固定相发生化学反应：对样品有适宜的溶解度：必须与检测器相适应，如用紫 外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂；粘度小。国内外的一些法庭科 学家在研究液相色谱法鉴定圆珠笔浊墨对运用了不同的滚动相【5 1 5 25 3 5 45 5 5 65 7 s a l 。 所要测的签字笔油墨中的染料是有机分子，黑色签字笔中的染料主要为离子型的极性有 机化合物，在一般的反相固定相( 如c 1 8 ，c 8 ) 上进行高效液相色谱分离时，由于他们 的强极性，所以保留较弱。因而分析此类化合物时，就必须要使用离子对反相液相色谱。 在分析黑色签字笔时，因为其中的染科大部分为阴离子，所以在流动相中加入了阳离子 1 0 首都师范大学硕士学位论文 离子对试剂四丁基氢氧化铵。染料的紫外吸收谱带主要在4 0 0 - 7 0 0 n t o 之间，而且大部分 染料的紫外吸收接近于5 8 0 n m ，所以我们的检测波长选在4 0 0 - 7 0 0 h m ，且以5 8 0 n m 作为 分析波长。纸张中的白色荧光物质的紫外通常都在4 0 0 n m 以下，所以它们对于我们的分 析没有干扰。 在离子对反相液相色谱中，有很多因素会影响离子型有机化合物的分离，其中包括 离子对试剂的种类、离子对试剂的浓度、流动相的p h 值等幽8 1 鸵幻“l 。 离子对试剂的种类对l i p l c 分离的影响。选择何种阳离子离子对试剂在黑色签字笔 色谱条件的优化过程中是非常重要的一步，主要是和被分析物的种类有关【黼慷觳档 o a 。对于高分子磺酸盐阳离子染料，离子对试剂需要和染料有很强的离子配对作用。实 验中考察了多种具有不同挥发性、不同碳链长度的烷基铵盐类离子对试剂，其中包括乙 酸铵、四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化化铵、四丁基氢氧化铵，最终选择了合适的离子 对试剂。图2 屯是i f 2 在不同离子对试剂作为流动相时所得到的色谱图。 有文献嘲舯悃乙酸铵、四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化化铵作为i p - h p l c 中的离 子对试剂，来分析含有一个磺酸基基团的离子型化合物。但是我们所分析的黑色签字笔 的染料却通常含有两个甚至更多的磺酸基基团，因此在相同的条件下，其保留较弱，不 能得到有效的分离 见图2 屯( a 、b 、e ) 。从图中可以看到染料在柱中几乎没有保留， 随流动相一起流出。 使用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂时，几乎能很好的分离所有的黑色签字笔，而 且分离时间也较合适 见图2 2 ( d ) 。所以最后选择四丁基氢氧化铵作为h p l c 分析黑 色签字时使用的离子对试剂。 首部师范大学硕士学位论文 图2 _ 2 以乙酸铵( a ) ，n 矾( b ) 、t e a ( c ) 、l b h ( d ) 作为离子对试剂所得到1 1 2 的色谱图 离子对试剂的浓度对h p l c 分离的影响。离子对试剂的浓度对分离效果也会产生影 响。为了考察四丁基氢氧化铵的浓度对黑色签字笔分离的影响，我们一共考察了 0 0 0 2 9 m l 一0 0 1 0 9 m l 范围内的五个浓度( 图2 - 3 ) 。结果表明当四丁基氢氧化铵的浓 度低于o 0 0 4 9 m l 对，流动相中对离子的浓度过低，使染料不能被充分保留。而当四丁 基氢氧化铵的浓度大于0 0 0 4 9 m l 时，染料就可以得到有效的分离。而且当四丁基氢氧 化铵的浓度增大，形成的离子对在色谱柱上吸附增强，保留时间延长。但是峰型和分离 效率改善程度较小。 图2 - 3 ：当四丁基氢氧化铵的浓度分别为o 0 0 2 ( a ) g m l ，0 0 0 4 ( b ) g m l , 0 0 0 6 ( c ) g l ，0 0 0 8 ( d ) g 吐，0 0 1 0 ( e ) g a l 时1 1 2 的色谱图 p h 值对h p l c 分离的影响。当p h 值调到8 0 以上时四丁基氢氧化铵变浑浊，所以 分别考察了p h 值为5 0 ，6 0 ，7 0 ，的离子对试剂溶液对黑色签字笔分离的影响( 图2 4 ) 。 实验发现染料的保留时问随着缓冲溶液p h 值的减小而增大。离子对试剂的出值对峰形 1 2 首都师范大学硕士学位论文 和染料的分离效率影响并不大。黑色签字笔中染料都属于酸性染料。对于一些强酸性染 料它们的p k a 小于2 ，对于弱酸性的染料它们的p k a 在2 - 6 之问。所以当离子对试剂的 p h 值大于6 时，染料都已经完全离解，所以离子对试剂的p h 值选择了6 5 。 图2 - 4 ：四丁基氢氧化铵的p h 值分别为5 0 ( a ) ，6 0 ( b ) ，7 0 ( c ) 时1 7 的色谱图 2 3 3t i c 分类结果的讨论 由于笔中油墨成分( 如树脂和染料) 不同，且相同成分也具有不同配比，从而使其 对萃取剂、吸附剂以及展开剂的溶解度和吸附力不同。因而展开斑点的数目、颜色、比 移值( r f ) 、大小、形状以及荧光性等方面表现出差异性，根据这种差异性我们对签字笔 进行初步的分类。使用u 、检测暗箱在短波( 2 5 4 m n ) 以及长波( 3 6 5 n t a ) 对展开后的硅 胶板进行检测，其中紫外暗箱中有能够提供长波和短波的紫外激发光源。短波照射下一 些u 、f 吸收组分会显示出来，而长波照射下会激发油墨中的可见紫外荧光组分。这些特 征也为油墨的鉴定提供了新的依据。根据以上分类原则，初步对9 0 支签字笔进行了分 类，结果如表2 - 4 ，具体每一支笔的情况见附录1 。 表2 - 4t l c 对黑色签字笔分析的结果 第一类第二类第三