（植物学专业论文）寒兰离体化学诱变研究.pdf

摘要 本文以甲基磺酸乙酯( e m s ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 、秋水仙素( c o l c h i d n e s ) 、 咖啡碱( c a 此i n ) 、5 溴尿嘧啶( 5 b u ) 、马来酰肼( i m o 、亚硫酸钠o 妇2 s 0 3 ) 为化 学诱变剂，以寒_ 兰( c y r a b i d i u m c a n r a nm a k i n o ) 原球茎为材料进行离体化学诱 变研究，探讨这7 种化学诱变剂对寒兰原球茎生长、增殖和分化的效应，筛 选适宜的诱变浓度和时间，以形态学方法鉴定再生植株的表型变异，以细胞 学方法观察化学诱变剂对寒兰根尖细胞核的影响，并分析诱变后的再生植株 在生理生化指标的变化，以i s s r - p c r 扩增体系对化学诱变剂造成的寒兰 遗传物质的改变进行了初步分析。结果表明： 1 各化学诱变剂对寒兰原球茎的生长均有一定的抑制作用，随着浓度 升高或时间的延长，原球茎的褐变率和死亡率升高，褐变率始终小于死亡率。 2 各化学诱变剂对寒兰原球茎的增殖均有一定的抑制作用，随着浓度 升高或时间的延长，原球茎的死亡率升高。增殖率和绝对生长速度的变化与 处理浓度和时间之间并非简单的相关关系。 3 通过对各处理结果的分析，计算了7 种诱变剂对寒兰原球茎的半致 死量，它与浓度和时间都有关系，可作为寒兰离体化学诱变的参考剂量。 4 再生植株在表型上均有一定的变异，主要以叶色变黄为主。其中e m s 和秋水仙素处理后原球茎的再生植株表型变异显著，但是表型变异再生植株 的比率并不高。 5 各化学诱变剂都能在细胞学水平对寒兰根尖细胞核造成明显改变， 主要有畸形核、微核、多核、核破裂、核质浓缩、染色体畸变f 加倍、滞后、 缺失1 等现象。 6 再生植株可溶性糖含量较正常植株有不同程度的升高；e m s 、d e s 、 秋水仙素和n a 2 s 0 3 处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量增高，咖啡 碱、5 - b u 、马来酰肼处理后的原球茎再生植株的可溶性蛋白含量降低。 7 再生植株的可溶性蛋白质图谱、超氧物歧化酶同工酶酶谱、酯酶同 工酶酶谱、过氧化氢酶同工酶酶谱、过氧化物酶同工酶酶谱较正常植株有不 同程度的变化，存在条带的减少和增加现象。 8 再生植株和正常植株之间的基因组i s s r 扩增图谱条带均有差异性， 其中e m s 、d e s 、5 b u 诱变处理后再生植株的基因组扩增条带差异性较其 他诱变剂的明显。 关键词：寒兰；原球茎；化学诱变 a b s t r a c t a b s t r a c t u s i n ge m s ，d e s ，c o l c h c i n e s ，c a f f e i n e ，5 一b u ，m 风n a 2 s 0 3a sm u t a g e m ca g e n t s ， a n du s i n gt h ep l b so fc y m b i d i u mk a n r a nm a k i n oa sm a t e r i a l w es t u d i e dt h et e c h n i q u eo fm u t a g e ni n “缸d t h i sa r t i c l er 鼯e a r c h e dt h ee f f e c t so ng r o w t h , p r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no fp l b st r e a t e dw i t hm u m g e n i ca g e n t s ，c h o s e da p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o n a n dt i m e , u s e dt e c h n i q u eo fm o l p h o l o o ct oc h e c ku pp h e n o t y p i cm u t a f i o n u s e d c y t o l o g i c a lt e c h n i q u et oo b s e r v et h ei n f l u e n c e so nl 卿o o so fr o o tt i p ，a n a l y z e dt h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a n g eo fp l a n t sf r o mp l b st r e a t e dw i t hm u t a g c n i c a g e n t s ，a tl a s t ，u s e di s s r - p c ra m p l i f i e ds y s t e mt oa n a l y z et h ec h a n g eo ng e n o m co f p l a n t sf r o mp l b st r e a t e dw i t hm u m g e m ca g e n t s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 e a c hm u t a g e m ca g e n tc o u l dr e s r a i nt h eg r o w t ho fp l b s ，w i t ht h ei n c r e a s eo f c o n c e n t r a t i o na n dt h ep r o l o n g e dt i m e ，t h eb r o w nr a t i oa n dd e a t hr a t i or i s e d , t h eb r o w n r a t i ow e r ea l w a y sl e s st h a nd e a t hr a t i o 2 e a c hm u t a g e n i ca g e n t sc o u l dr c s r a i nt h ep r o l i f e r a t i o no fp l b s w i t ht h e i n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o na n dt h ep r o l o n g e dt i m e ，t h ed e a t hr a t i or i s e d , t h ec o n n e c t i o n b e t w e e np r o l i f e r a t i o nr a t ea n da b s o l u t eg r o w t hr a t ew e r en o ts i m p l ec o r r e l a t i v i t y 3 a n a l y z i n gt h er e s u l t s ，w ec a l c u l a t e dt h el d s oo np l b so fm u t a g e m ca g e n t s ， i tr e l a t e dt oc o n c e n t r a t i o na n dt i m e ，t h er e s u l t sc o u l db et h er e f e r e n c e dd o s a g ef o r c h e m i c a lm u t a t i o no fc y m b i d i u mk a n r a nm a k i n o 4 s o m ep h e n o t y p i cm u t a t i o n a p p e a r e do np l a n t s f r o mp l b st r e a t e dw i t h m u t a g e n i ca g e n t s ，m o s t l yw e r ef l a v i c a n tl e a f s t h ed i s t i n c tp h e n o t y p i cm u t a t i o n m o s t l ya p p e a r e do nt h ep l a n t st r e a t e dw i t he m sa n dc o l c h i c i n e s t h ep e r c e n t a g eo f p h e n o t y p i cm u t a t i o nw e r en o th i g h 5 e a c hm u t a g e n i ca g e n tc o u l dc h a n g ek a r y o n so fr o o tt j po nc y t o l o g i c a ll e v e l ， m o s t l yw e r ea b n o r m a lk a r y o u sp h e n o m e n a , m i c r o n u c l e u sp h e n o m e n a ，m u l t i n u c l e n s p h e n o m e n a ，c r a c k e dk a r y o n sp h e n o m e n a , c o n c e n t r a t e dk a r y o p l a s m sp h e n o m e n a ， c h r o m o s o m ea b e r r a n c ep h e n o m e n o n ( d o u b l e ，l a g , d e l e t i o n ) 6 t h es o l u b l es u g a rc o n t e n to ft h ep l a n t sf r o mp l b st r e a t e dw i t hm u t a g e n i c a g e n t sw e r eh i g h c rt h a nn o r m a lp l a n t s ；t h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n to fp l a n t s f r o m i a b s t r a c t p l b st r e a t e d 、i t i ie m s ，d e s ，c o l c h i c i n e s ，n a 2 s 0 3w c i eh i g h e rt h a nn o r m a lp l a n t s ， t h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n to fp l a n t sf r o mp l b st r e a t e dw i t hc a f f e i n e ，5 - b u ，m h w o r el o w e rt h a nn o r m a lp l a n t s 7 t h es o l u b l ep r o t e i nb a n d s ，s o di s o z y m eb a n d s ，e s ti s o z y m eb a n d s ，c a t i s o z y m eb a n d sa n dp o di s o z y m eb a n d s o fp l a n t sf i o mp l b st r e a t e dw i t h7m u t a g e n i c a g e n t sw e r ed i f f e r e n tf r o mn o r m a lp l a n t s ，e x i s t e dt h ep h e n o m e n o n o fa b s e n tb a n d so r a d d e db a n d s 8 t h ei s s r - p c ra m p f l e dg e n o m eb a n d so fp l a n t sf r o mp l b st r e a t e dw i t h m u t a g e n i ca g e n t sw e l cd i f f e r e n tf r o mn o r m a lp l a n t s ，c o m p a r e dw i t ho t h e rm u t a g e n i c a g e n t s ，t h e r ed i s t i n c td i f f e r e n c e s0 1 1g e n o m eb a n d sb e t w e e np l a n t sf r o mp l b st r e a t e d w i t he m s ，d e s ，5 - b ua n dn o r m a lp l a n t s k e y w o r d s ：c y m b i d i u mk a n r a nm a k i n o ；p l b s ；c h e m i c a lm u t a t i o n i v 缩略符号注释 e m s d 匹s 5 一b u m h m s 6 b a n a a p l b s i n t o h d s t r p m t h s s d s t e n 也d n b t p m s n a d m r i t s o d 髓 m d h c a t p o d p c r 缩略符号注释 e t h y lm e t h a n es u l f o n a t e d i e t h y ls u l f a t e 5 - b r o m o u r a e i l m a l e i ch y d r a z i d e m u r a s h i g es k o o g b e n z yl a d e n i n e n a p h t h a l e n aa c e t i c a c i d p r o t o c o m l i k eb o d i e s m i n u t e h o u r d a y s e c o n d r o t a t i o n r o u n dp e rm i n u t e t r i s m y d r o x y m e t h y l ) a m i n o e t h a n e s o d i u ml a u r y ls u l f a t e n ，n ，n , n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e n i t r ob l u et e r a z o l i u m p h e n a z i n em e t h o s u l p h t e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d en a d i d e t h l a z o l y lb l u e s u p e r o k i d a ed i s m u t a s e e s t e r a s e m a f a t ed e h y d r o g e n a s e c a t a l a s e p e r o x i d a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n v 甲基磺酸乙酯 硫酸二乙酯 5 溴尿嘧啶 马来酰肼 m s 培养基 6 苄基氨基嘌呤 萘乙酸 原球茎 分钟 小时 天 秒 转 转f 分 三( 羟甲基) 氨基甲烷 十二烷基硫酸钠 n n ，n ，n 。一四甲基二乙胺 氮蓝四唑 酚嗪硫酸甲酯 辅酶i 噻唑兰 超氧物歧化酶 酯酶 苹果酸脱氢酶 过氧化氢酶 过氧化物酶 聚合酶链式反应 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：李夏 签字日期：加年f 2 月2 6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌友堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：才汉， 导师签名：拈中仍乃 签字日期：2 0 - 年彦月日 签字日期：7 年h n 哪d 第1 章绪论 第1 章绪论 寒兰( c y m b i d i u mk a n r a nm a k i n o ) ，兰科兰属中的地生兰，生长于海拔枷 2 4 0 0 米，主要分布在江西、台湾、福建、浙江、湖南、广东、广西和四川等地， 也见于日本和朝鲜半岛南端。寒兰的营养繁殖为分株繁殖，是传统繁殖方式， 然而其繁殖系数极低；通过种子萌发来繁殖，为有性繁殖，但是寒兰种子极小， 没有胚乳，只有一个发育不完全的胚，种皮致密有蜡质，并且可能含有抑制物， 因此，自然条件下极难萌发。 目前野生寒兰资源正面临一场劫难，表现为寒兰数量剧减，一些种群甚至 濒危或灭绝，其主要原因有三：一是自然繁殖系数低：二是因为其巨大的经济 价值而遭到人为的滥采，有资料统计表明，市场上交易的寒兰9 9 来自于自然 野生资源；三是由于森林砍伐，水土流失，寒兰赖以生存的生态环境遭到严重 破坏。随着国内寒兰热的急剧升温，野生寒兰资源保护面临着严峻挑战，幕兰 的种质资源保存也被提上议题。 。在兰花市场上，寻购“新、奇、特”的寒兰精品的兰友络绎不绝，甚至不 借重金收集，在此强烈的市场需求下，寒兰的价格被逐渐抬高。在经济利益的 驱动下，人们纷纷在野生寒兰品种中寻找变异植株，而寒兰在自然界的变异率 仅有百万分之一，随着人们毫无限制性的采撷，使得原本就不算丰富的野生寒一 兰资源迅速走向枯竭，成为濒危珍稀植物，这使得保护寒兰的种质资源成为迫 在眉睫的任务。因此，为了保护寒兰资源，满足市场需求，需要建立一套寒兰 快速繁殖培养体系，可以迅速大量的培养寒兰，并且在此基础上进行化学诱变 研究，培育出新品种，尽可能的满足人们对“新、奇、特”兰花的需求。 1 1 组织培养是保护兰花种质资源的有效手段 兰花是整个兰科植物( o r c h i d a c e a e ) 的总称，全世界约有7 3 0 多属，2 1 5 0 0 多 种，广泛分布于全球各地，但主要分布在热带、亚热带地区。我国约1 7 3 余属， 1 2 4 0 余种，在南北各地均有分布，但以云南、台湾、海南最为丰富i ”。兰科植 物可分为三种类型：地生兰、附生兰和腐生兰。在我国，习惯把兰花分为国兰 和洋兰。国兰一般指原产于我国、花型小、有香气的兰属( c 咖1 6 地研) 中的几种 第1 章绪论 地生兰，主要有春兰( cg o e r i n g i i ) ，慧兰( cf b m 3 、建兰( c 跏5 和地所) 、墨兰( c s i n e n s e ) 、寒兰( c k a n a r a n ) 、莲瓣兰( cl i a n p a n ) 和春剑( cg o e r i n g i i i _ ，a r , l o n g i b r a c t e a t u m ) 等。洋兰主要是指原在热带的国外生产和培育的一些花大、色艳 的附生种类，主要有卡特兰属( c a t t l e y a ) 、蝴蝶兰属( p h a l a e n o p s i s ) 、石斛兰属 ( d e n d r o b i u m ) 、文心兰属( 伽c 油“m ) 等1 2 j 目前，兰花在世界各地逐渐发展成为 产业。 兰科植物一直倍受国际社会关注，在生物进化研究、生物多样性保护等方 面发挥着极其关键的作用，尤其是在观赏花卉、医药保健等领域更具有巨大的 经济开发和利用价值。在兰花观赏上，“新、奇、特”的兰花精品供不应求，人 们甚至不惜重金收集，在此强烈的市场需求下，兰花的价格被逐渐抬高。受到 经济利益的驱使，野生兰资源遭受了人为的滥采，这就需要人们寻找有效的方 式来保护兰花的种质资源删 植物的种质资源保存主要有原地保存、异地保存和设施保存3 种方式。原 地保存和异地保存都是指在自然状态下保存植物。设施保存，也叫设备保存、 离体保存，就是利用种质资源库( 冷藏库、超低温库、组织培养室) 等保存设施长 期保存种子、配子体、器官、组织、细胞等种质材料，来达到保存植物种质资 源的目的，它也可以被看作是异地保存中的一种形式，组织培养就是其中最安 全有效的保存方式。植物组织培养( p l a n tt i s s u ec u l t u r e ) ，是指在无菌条件下，将 离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给 予适当的培养条件，使其长成完整的植株。由于培养的是脱离植物母体的培养 物，所以也叫植物离体培养( i n v i t r oc u l t u r e o f p l a n t ) 或植物试管培养唧a n t c u l t u r e i nt e s t t u b e ) 。广义的组织培养，不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组 织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。利用组织培养 的方式进行大规模克隆繁育，可以缓解对兰科植物资源的采集压力。兰花组织 培养的外植体有：根、茎段、顶芽、侧芽、花茎等。自从1 9 6 0 年法国g m o r e l 开创了兰花茎尖组织培养法以来，全世界已有7 0 多个属，数百种和更多的品种 兰花走上了工厂化生产。我国在2 0 世纪7 0 年代末就开始进行兰属植物组织培 养方法的研究，并取得了阶段性成果，这一技术的应用对其快繁、品种复壮、 加快优良品种的培育、挽救珍稀濒危种类等方面起到了重要作用。近几年来， 由于我国经济的发展，兰花种子萌发技术的进步、组培快繁技术的应用和栽培 技术的不断提高，兰花开始走上产业化的道路。兰花产业发展到今天，组织培 第1 章绪论 养技术功不可没，国兰中的墨兰( cs i n e n s e ) 、建兰( c 绷和l i u m ) 、春兰( c g o e r i n g i 0 、惹兰( c 如b n 3 都建立了无性快速繁殖体系，培养出来的新植株和它们 母体具有相同的全部遗传信息，即遗传上的相对稳定性，然而有关寒兰的组织 培养报道较少。所以，建立完整的寒兰快速繁殖体系对其物种资源保护具有重 要的意义。 1 2 人工诱变是获得兰花新品种的技术措施 众所周知，兰花市场的竞争，实质上就是优良品种的竞争，组织培养能快 速繁殖培养兰花品种，但对培育新品种来说，由于其变异率低，而少有单独用 于品种培育；基因工程手段显然是育种主要研究方向之一，由于起步晚，需要 较高的实验手段，方法条件尚不成熟处于探索之中；再加上中国兰花繁殖的特 殊性，试图通过杂交获得优良变异并使之遗传下去，难度较大，并且所需时间 也很长，所以，中国兰很少用杂交的方式来培育新品种。 燕上个世纪3 0 年代，遗传学史上最重要的发现之一就是m u l l e r 发现突变能够 被诱发( 1 9 3 0 ) ，并由此产生了一种新的育种途径一诱变育种。它的出现为植物 优良种质的创造和优良品种的选育开辟了一个新的途径，具有重要的意义。与 常规育种相比，诱变育种能够提高突变率，扩大变异谱，诱变的突变率一般可 达千分之几，有时可达1 3 0 ，甚至可能获得自然界罕见的珍稀变异，在短时间一 内育出新品种。因其育种程序简单而可有效缩短育种年限；更由于其可控因素 较多，可控性强而适用于个别性状的改良。 1 2 1 诱变育种的发展过程及现状 1 2 1 1 自发突变给人工诱变育种引发的思路 自发突变是指自然条件下发生的突变，在生物体进化的历史中，它是生物 变异的重要来源，也是自然进化的基础。自然界存在广泛的自然突变，无论是 低等生物，还是高等动植物及人类，都可能发生自然突变。一方面，自然突变 的发现和研究为人类实践诱变育种奠定了基础，另一方面自发突变也为人类提 供了极有价值的育种材料。自发突变为最初的人工诱变育种的出现开拓了思路， 第1 章绪论 但由于自发突变的突变频率极低( 只有1 f f 5 1 0 a ) ，恢复率高，群体太小，分离 麻烦和非遗传变异较多，而且选择的优良个体少、鉴定时间长，无法收集到足 够的突变体。另外，自发突变基因通常需要用图位克隆方法进行分离，时问长， 耗费大，只能作为突变体构建的辅助方法所以在此基础上出现了最初的人工 诱变，即运用物理化学等方法实施人为定性的变异诱导 1 2 1 2 人工诱变育种的产生和发展 诱变育种从2 0 世纪发现和使用至今，在植物上的应用已有相当长的时间， 主要有2 种方式：辐射诱变和化学诱变。m u l l e r 在1 9 2 4 年发现x 射线能引起果 蝇产生遗传变异，并由此发现了物理因素的诱变作用后，s t a d l e r 、n i l s s o n e h l e 和g u s t a f s s o n 、t o l l e n l e r 等先后利用射线在玉米、大麦、烟草等植物上诱发了有 实用价值的突变体，由此，成为早期诱变的主要方式。辐射诱变使用各种射线 以造成染色体水平的畸变，如倒位、缺失等等形成突变【2 j 。特点是对染色体伤害 较大，因此致死突变较多。尽管如此，由于早期是诱变技术的主流，从事诱变 及其后代品种筛选工作的人员众多，也获取了大量的用于生产的稳定突变体后 代。 利用化学试剂进行人工诱变的尝试开始于1 9 2 4 年，a u e r b a c h 用芥子气诱导 产生类似于射线诱导的各种变异，而后在小麦、水稻、高粱、大豆以及蔬菜、 花卉等2 0 多种植物上获得突变体。化学诱变的应用虽然晚于物理因素，但目前 在诱变领域的应用也并不逊色。化学诱变通过化学试剂造成生物d n a 的损伤和 错误修复，产生突变体。这些突变以点突变为主，并且因试剂不同具有某些相 对高频而且较为稳定的突变谱。由于这一技术还具有易操作、剂量易控制、对 基因组损伤小、突变率高等特点，因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。 狭意的化学诱变的技术包括诱变材料的选择、诱变剂的选用，而广意上说，突 变体筛选技术和随后的突变体分子检测技术的发展也是重要的组成部分；决定 着化学诱变技术在当代科技的背景下，在育种上的广泛而有效的应用【4 j 。在近 4 0 年的发展过程中，从诱变剂的利用到诱变手段和分离筛选技术的不断研究， 使得诱变体系日臻完善。化学诱变的特点满足了人们对兰花求新求异的要求， 使化学诱变成为目前兰花品种培育与改良中的一种非常重要的手段，国内外在 此领域的研究均有较为乐观的成果。 4 第1 章绪论 1 2 1 3 人工诱变的原理 l 辐射诱变原理 辐射诱变的主要机理为：通过高能电子或带电粒子把能量传递给靶物质， 导致生物体合成被抑制，d n a 分子损伤( 包括碱基脱落、碱基破坏、二聚体形成 等1 ，d n a 双链断裂，从而引起生物体通过损伤修复而产生遗传性变异。目前应 用最广泛的辐射源，包括x 射线、y 射线、1 3 射线、紫外线和中子等1 5 1 。 2 化学诱变原理 常见的化学诱变剂主要有以下几类 ( 1 ) 烷化剂 作用机制：烷化作用重点是核酸，导致d n a 断裂、缺失或修补。烷化剂分 为以下几类： 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐 代表药剂：甲基磺酸乙酯( e m s ) 、硫酸- - 7 , 酯( d e s l 亚硝基烷基化合物 代表药剂：亚硝基乙基脲( n e 哪、n 亚硝基n 乙基脲烷( n e u ) 次乙胺和环氧乙烷类 代表药剂：乙烯亚胺( e i ) 芥子气类：氮芥类、硫芥类 ( 2 ) 核酸碱基类似物 作用机制：作为d n a 的成份而渗入到d n a 分子中去，使d n a 复制时发 生配对错误，从而引起有机体变异。 代表药剂：5 一溴尿嘧啶( 5 一b u ) 、5 一溴去氧尿嘧啶核苷( 5 b u d r ) ，8 - 氮鸟嘌呤、 咖啡碱、马来酰肼等。 ( 3 ) 其他诱变剂 包含一些无机化合物和生物碱 亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成d n a 复制紊 乱。h n 0 2 还能造成d n a 双链间的交联而引起遗传效应。 秋水仙素可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向 两极，从而产生染色体加倍的核i “。适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的 形成，但对染色体结构无明显影响，用秋水仙素主要是诱导多倍体植株。 第1 章绪论 1 8 诱变技术与植物组织培养结合的方式 1 3 1 诱变与茎尖培养结合 诱变与茎尖培养相结合的研究主要集中在香蕉和马铃薯等无性繁殖植物 上。o m a r 等研究了e m s 对香蕉两个无性系茎尖培养的作用方式，发现标记的 诱变剂在茎尖顶端分生组织、叶原基部位累积，并在球茎区域更广泛地存在， 而这个区域正是新的不定芽起源的部位。随着e m s 浓度的提高，新的不定芽产 生的数量减“从理论而言，在诱变与茎尖培养的结合中，诱变了的细胞发育 为再生植株的机率主要依赖其在多细胞的茎尖组织中的位置，表层细胞要比深 层细胞机率要大，如果诱变发生在顶端原始细胞，这些细胞会产生较大的突变 区域，那么则可保证获得数量较多的突变体。b h a g w a t 和d u n c a n 研究了叠氮化 钠、硫酸二乙酯和e m s 作为诱变剂结合香蕉茎尖培养抗镰刀菌萎蔫症突变体， 发现不同诱变剂之间及不同处理时间长短对诱导产生的变异数目影响不显著， 从三种化学诱变剂处理产生的植株中分别获得4 2 、1 9 和6 1 的耐性植株。 他们还研究了不同剂量的y 射线对香蕉茎尖培养的诱变效果，发现新切割下的 茎端和球茎要比在液体培养基中培养4 周的茎端外植体的有效性高【8 1 1 3 2 诱变与单倍体育种技术结合 单倍体育种或加倍单倍体育种技术包括对花药( 小孢子) 培养、( 未受精) 胚珠 培养和染色体去除获得单倍体植株及染色体加倍技术。利用诱变与花药培养结 合的研究见诸于多种植物的报道，v a g e r a 等报道用m n h ( n - 甲基n 亚硝基脲) 和b m s ( n 丁基甲基碘酸盐) 处理烟草种子进行花药培养，其产生单倍体的数量比 对照增加1 0 0 2 2 0 ，即使较高剂量的诱变剂也能显著增加花药出愈率和雄核 发育单倍体的频率。p r z e w o z n y 等也发表了类似的研究报道，用x 射线、1 ，射线 和化学诱变剂处理双单倍体的马铃薯花序，在其花药培养物中由小孢子衍生出 来的多细胞频率增加，其中用0 1 或0 5 m mm n h 处理的刺激效应比最高，比对 照分别增加1 6 5 和1 2 6 。 6 第1 章绪论 1 3 3 诱变结合其它器官外植体及愈伤组织培养结合 除茎尖和花粉外，其它再生能力较强的外植体如叶柄、叶片、花序、花瓣、 果柄等也可经诱变处理获得较高频率的突变体，如以马铃薯叶轴、叶柄和小叶 圆片作为外植体，经x 射线处理后，体外培养产生的不定芽中，平均突变率达 6 8 2 ，其中小叶圆片作为外植体产生不定芽的频率最高，达8 5 9 。以愈伤组 织作为材料，也可获得较高频率的突变体。需要指出的是，不同剂量或浓度的 诱变剂对愈伤组织的诱导率、成活率、绿苗分化率及再生植株突变率有较大的 影响 9 1 。由于绝大多数植物的细胞悬浮培养和原生质体培养难以再生植株，所以 这方面的报道极少。 1 4 诱变技术与组织培养相结合在兰花育种中的应用 近年来随着组培和生物技术的不断发展和完善，将组织培养，生物技术和 诱变育种相结合，产生了一种新型的育种途径生物技术诱变育种。组织培 养原来的目标是母本性状的克隆和快繁，近几年来却成为创造新种质的有效方 法。植物体细胞经组织培养，可以产生大量的变异，自然条件下出现无性系变 异是一种正常的现象，其自然变异频率随培养时间的延长而提高。这些变异的 个别性状可稳定遗传给后代，给创造新的种质资源提供了可靠的遗传基础。组 培过程中产生的变异个别性状稳定快，一般r 3 即可稳定，比常规育种方法稳定 世代短，有利于加速育种的进程。采用这种方法已经获得多种优良品种：如孔 繁伦等通过水稻体细胞培养获得了大粒型水稻：何世贤等用小麦体细胞培养选 育出几个新的优良品系：王呈祥等通过组培研究表明高粱体细胞无性系变异类 型丰富，许多形态学及生物学性状均可发生变异等。 随着诱变育种范围的不断拓广，其与组培技术的结合为显现体细胞突变开 辟了广阔前景。它可以彻底暴露内部组织，为不同的细胞提供更多更深刻的变 异机会，进一步扩大诱变频率；将诱变后的材料再利用分离突变体的培养基、 培养液或短期胁迫进行筛选，以使突变型尽早显现出来，还可以提前获得突变 体，缩短诱变与选择时间。b r o e r j e s 指出，离体叶片、叶柄、花梗上产生的不定 芽多起源于单细胞，而来自辐射材料单个或少数细胞产生的不定芽，获得突变 的机率较大，可以减少体细胞选择，获得高频的周缘嵌合体或同质突变体，对 7 第1 章绪论 缩短育种年限、提高育种效率大有益处1 1 0 l 。结合诱变和利用选择压力进行细胞 突变体筛选，还可实现一定程度的定向诱发和选择，克服辐射诱变本身的随机 性、嵌合性和单细胞突变的缺陷，育种效率提高，周期缩短。使用植物激素， 尤其是高浓度的细胞分裂素6 - b a ( 3 m g l 1 ) 等诱导愈伤组织，会提高多倍体细胞 的分裂频率或导致不正常细胞分裂1 1 1 埘，从而增加变异机率。因此，利用化学 诱变剂处理外植体可提高获得突变体的可能性【”i 。 兰花的组织培养始于2 0 世纪6 0 年代，m o r e l 采用大花蕙兰的茎尖，将其分 生组织诱导形成原球茎并分化成植株【1 4 l ，导致兰花栽培技术变革，建立了兰花 工业，之后4 0 多年来，兰花组培技术不断发展和完善，先后大约有6 0 余属数 百种兰花的组织培养研究见诸报道。国外的洋兰组织培养早己发展成为产业， 在我国，中国兰的组织培养也取得了很大突破，王熊于1 9 7 3 1 9 7 4 年用建兰建立 了快速无性繁殖系，随后建立了秋兰和春兰快速无性繁殖系1 1 5 1 ，为我国兰花工 业开辟了新的技术途径，此外段金玉、吴汉珠、潘瑞炽也等对中国兰花的组织 培养进行了广泛而深入的研究，2 0 0 6 年，朱国兵等以寒兰的根状茎为外植体， 建立了一套完整的寒兰组培快繁体系，填补了寒兰组培研究的空白己经建立起 了一套完整的寒兰离体快繁体系，这对寒兰的物种资源保护有极其现实的意义， 并为寒兰工厂化育苗提供了一定的技术支持1 1 6 】。虽然组织培养在兰花育种中的 应用取褥了长足进展，但是与人工诱变技术相结合的育种研究尚处于起步阶段， 两者的结合已经在其他花卉育种上取得了突破，能否将其利用在兰花育种中并 取得品种改良和创新，逐渐受到许多学者的高度重视。 虽然通过组培繁殖的兰花也会产生变异，但人工诱变能使突变频率提高。 在兰花育种中，近年来已有人致力于将诱变技术与组织培养相结合，得到了一 些研究成果。 陈超等用不同浓度的甲基磺酸乙酯( e m s ) 和叠氮化钠( n a n 3 ) 对蝴蝶兰僻j a p h r o d i t e ) 原球茎做不同时间的处理，结果显示：e m s 和n a n 3 均可使部分原球 茎白化或褐化并逐渐死亡，切片观察发现，用这两种诱变剂处理均可使细胞体 积增大，细胞形状改变，细胞质浓缩；较高n a n 3 浓度处理的原球茎细胞中出现 晶体物质、双核、畸形核和核仁丢失等现象；同浓度的同种诱变剂随处理时间 的增加材料的变异程度有增大趋势，但不是很显著；另外，通过对比还发现e m s 比n a n 3 的诱变处理效果好1 1 7 j 。d o l c z e l 等用秋水仙素对兰属( c 朋6 触“肌) 杂种的 原球茎进行处理，结果发现秋水仙素浓度、处理时间和多倍体诱导率之间不是 第l 章绪论 简单的相关关系，用l m g m l 秋水仙素处理7 d 获得的四倍体最多b s i 。h s i c n 等用 1 2 5 m g l 秋水仙素处理的朵丽兰( d n r 出p u l c h e r r i m a ) 的原球茎，当原球茎直径为 1 - 1 2 m m 时，处理7 d ，原球茎再生率为4 2 5 9 ，再生植株中4 6 为四倍体【1 9 l 。 林芬等用紫外线照射和秋水仙素处理对春兰( c g o e r i n g i i ) 原球茎进行人工诱变， 出现了植株变矮、叶片增宽增厚的变异植株，少数植株叶片出现艺兰的性状【刎。 张志胜等用秋水仙素处理墨兰( c s i n e n s e ) 和大花蕙兰( c h y r 甜u s ) 的杂交f 1 种子 诱导的原球茎，发现秋水仙素处理对原球茎的生长和分化起抑制作用；浓度越 高，抑制作用越强，处理时间不同，抑制作用也不同，秋水仙素处理后的再生 植株群体中，平均变异植株的百分率为9 0 6 ，是对照材料的3 7 倍；变异植株 的类型包括植株粗壮、多叶、叶片变宽、变厚、叶片墨绿色、矮化、线艺和叶 艺等，处理浓度为0 1 0 、时间为4 8 h 时，植株变异率最高【2 1 1 。陈华等选择具有 福建地方特色的建兰( ce n s i f o t i m ) 、报岁兰( cs i n e n s e ) 、四季兰( ce n s i f o l i u m ) 进行”c o y 光量子辐射处理，并将处理后的材料进行组织培养，发现辐射后的 兰花相比于参照材料生长势明显增强，且不同品种的耐辐射能力有差异，报岁 兰 四季兰 建兰，兰花辐射诱变的最佳剂量，l d s o 为1 0 g y - 2 0 g y ，为今后的兰 花辐射诱变提供了剂量参数；经辐射诱变能产生出叶片短小型、线艺叶型等不 同的变异类型【硐。 尽管对兰花诱变做了不少的工作，但到目前为止，尚未见到诱变成功兰花 新品种的报道，究其原因，可能与兰花组织培养再生植株的途径有关，即原球 茎途径。原球茎是节间极度缩短了的根状茎，是由多细胞组成的繁殖器官，其 增殖是通过体细胞胚的方式i 翻，与诱导愈伤组织或体细胞胚相比，增加了诱变 的难度，诱变了的部分细胞如果不占据主导地位便很难表达出来。 1 5 诱变与植物组织培养结合过程中应注意的问题 第一，确定适合的诱变剂 第二，确定适合的诱变材料。选择诱变的植物组织培养材料不仅要充分考 虑到其分散程度和整齐度，以及再生能力和再生途径，还要考虑到能否获得足 够大的诱变群体。如原生质体和悬浮细胞培养从分散程度和整齐度上考虑最为 理想，另外也容易获得较大的诱变群体。从再生途径考虑，经不定芽发生和体 细胞胚胎发生途径为单细胞起源，对选择纯的突变体较为有利【4 1 。 第1 章绪论 第三，需考虑到诱变剂的有效性和培养材料对诱变剂的敏感程度和特异性。 在确定最适诱变浓度及处理时间时，通常以半致死剂量条件为最适条件，但是 要注意到半致死剂量的条件未必是最适诱变条件。考虑到诱交剂对培养材料的 损伤，即使诱变材料没有死亡也不可能保证有植株再生，所以既要考虑到诱变 材料的成活率，也要考虑到植株的再生频率脚】，虽然提高诱变浓度可能会提高 突变频率，但由于随着增加了的组织损伤，会减少突变植株的发生数量，就组 织敏感性而言，细胞倍性水平，染色体大小、基因位点的杂合程度，以及细胞 活性、组织水合度等生理状态和诱变环境条件如温度和p h 值等都对诱变的有效 性存在较大影响。组织和基因型特异性是指排除不同器官外植体及不同的基因 型诱变的效果不同，诱变后的再生能力和产生的突变体频率存在差异。 第四，应结合组织培养环境条件，设计出有效的体外选择方案，提高突变 体的选择效率i 硐。 1 6 突变的筛选 诱变材料不同，将使诱变效率和筛选难度不同，诱变是基础，选择和稳定 才是关键。突变体的选择与鉴定在植物诱变育种中占有举足轻重的位置，进行 突变体的早期分离、选择是获得有益变异的重要途径【2 7 】。在组培过程中，兰花 单个细胞发生突变的可能性很大，但是植株的诱变可能性却很小，原因是兰花 的组织培养再生植株的途径不是以单细胞为单位，而是以原球茎为单位，个别 细胞发生突变后，由于生活力普遍低于正常细胞，经常被淹没在正常细胞的“汪 洋大海”中。因此，要获得有效的突变植株，必须采用很多的试验样本i 矧。经过 诱变的兰花原球茎，如果直接分化，分化出的芽的形态千变万化，从中挑选出 有园艺价值的单株，并逐一进行稳定性鉴定和快繁价值鉴定的工作量很大。因 此，通常的做法是，原球茎经过诱变处理后，并不直接分化出芽，而是先培养 几个生长周期，自然淘汰掉绝大部分生活力和稳定性差的突变，然后再分化出 芽，从这些芽中挑选有用的变异。目前常用的突变体的筛选和鉴定方法有以下 几种： 1 0 第1 章绪论 1 6 1 形态学和细胞学方法 形态学方法主要是根据诱变植株与对照植株在苗期性状差异来分离突变 体，这种方法适合于花卉诱变育种的突变体选择，可以根据株型、叶色、花色、 花型等变异对变异体进行早期鉴定1 2 9 ，细胞学方法就是观察突变植株的染色体， 包括观察染色体的数量和结构变化。目前这两种方法常常与其它鉴定方法相结 合来选择突变体，在兰花诱变研究中应用广泛。李涵等用秋水仙素诱导云南野 生齿瓣石斛( d d e v o n i a n u m ) 试管苗，观察其外部形态，发现部分试管苗植株粗壮、 叶片增厚，表面出现轻微皱褶，叶色深绿，部分叶片畸形，诱导出的根粗短， 并出现轻微木质化；对筛选出的变异植株用f - b s g 进行染色体鉴定后发现，染 色体数目发生改变，但在数目上并不稳定例。 1 6 2 生理生化方法 通过检测诱变植株体内的蛋白质含量、同工酶的活性来选择突变体。