（分析化学专业论文）新型纳米材料用于电流型酶生物传感器的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 基于酶对特定底物响应而构建的电化学酶生物传感器，具有灵敏度高、选择 性好、易于微型化和自动化等优点，具有广泛的应用前景。在电化学生物传感器 的研制中，一项关键的技术就是如何将酶稳定、保持其高活性地固定到基体电极 表面而形成传感器的敏感膜。本研究工作致力于发展新型生物材料固定方法，以 达到改进固定酶活性、延长传感器使用寿命等目的，主要完成了以下研究工作： 1 、利用壳聚糖具有很强的成膜能力的性质，在玻碳电极表面首先形成壳聚 糖膜，膜表面丰富的n h 2 与纳米a u 强静电结合，在玻碳电极表面获得稳定的纳 米a u 修饰层。在形成的纳米a u 层自组装半胱胺，以此来固定酪氨酸酶。负电 性的纳米a u 可以有效地保持酶的活性，制备得到性能良好的生物传感器，对邻 苯二酚的测定线性范围为1 o 1 0 一1 o 1 0 m o l l ，使用寿命在1 个月以上。 2 、用铁离子插入氧化石墨层间的方法合成了c f e 纳米复合材料( c f n ) ， 对此复合材料的结构和电化学特性进行了研究，研究表明此纳米复合材料具有良 好的电子传导能力。并用c f n 糊电极制备了无电子媒介的葡萄糖生物传感器一 第三代酶传感器。在无电子媒介的情况下，生物传感器上葡萄糖氧化酶保持了较 高的活性和稳定性，传感器测定葡萄糖的线性范围为6 6 7 1 0 一1 o 1 0 m o l l ： 常干扰葡萄糖测定的抗坏血酸、尿酸等在传感器上无响应，对葡萄糖测定无影响。 3 、碳纳米管因其奇特的物理、化学性质以及良好的电子传导能力在传感器 方面的应用引起了广泛的关注。在第三章中报道了在碳纳米管表面通过壳聚糖修 饰纳米a u 单分子层，利用溶胶一凝胶包埋碳纳米管制备的电极表面相当于亚微 电极阵列。利用碳纳米管表面带负电性的纳米a u 固定h r p 制备h 2 0 2 生物传感 器，研究表明，纳米a u 层可以稳定、高效地固定酶，碳纳米管具有优良的电子 传导能力；形成的亚微电极阵列比具有常规电极表面的传感器响应更加灵敏、快 速，可在6 6 7 x 1 0 1 3 3 x 1 0 “m o l l 范围内对h 2 0 2 进行检测。 4 、研究了以硼掺杂金刚石为基底电极的酪氨酸酶传感器。该酶传感器对酚 的催化作用强于以玻碳为基底电极的酪氨酸酶传感器。在浓度为1 ，o 1 0 一一 1 0 1 0 5m o l l 的范围内传感器对邻苯二酚的响应具有良好的线性关系，检测下 限为5 2 1 0 一m o l l 。酶电极的m i c h a e l i s m e t e n t 常数( k ) 为3 3 6 5p m o l l 。酶 电极对苯酚和对甲苯酚也有良好的响应线性范围分别为：5 0 x 1 0 一2 0 x 1 0 。 m o l l 、5 0 x 1 0 8 5 o 1 0 一m o l l 。酶传感器有较好的稳定性和重现性。 关键词：酶生物传感器；纳米a u 活性界面；c f e 纳米复合材料：多壁碳纳米 管( m w c n t s ) ：硼掺杂金刚石电极 新型纳米材料用于电流型酶生物传感器的研究 a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a le n z y m eb i o s e n s o r sb a s e do nt h er e c o g n i t i o no fs p e c i f i cs u b s t r a t e s h a v et h e a d v a n t a g e s o f h i g h - s e n s i t i v i t y ，n i c e - s e l e c t i v i t y a sw e l la s e a s y m i n i a t u r i z a t i o na n da u t o m a t i o n i nt h ed e s i g na n df a b r i c a t i o no ft h ee l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o rt h ec r u c i a ls t e pi sh o wt od e v e l o pas i m p l ea n de f f e c t i v es t r a t e g yf o rt h e c o n s t r u c t i o no fs e n s i t i v em e m b r a n eo no ri n t ot h ee l e c t r o d e t h i sr e s e a r c hi sa i m e d t od e v e l o pn e wi m m o b i l i z a t i o ns t r a t e g i e so fe n z y m ef o rt h ep u r p o s eo fi m p r o v i n g t h ep e r f o r m a n c ea n dl o n g - t e r ms t a b i l i t yo fb i o s e n s o r t h ed e t a i l e dm a t e r i a l sa r e s u m m a r i z e da sf o l l o w i n g ： 1 c o n s i d e r i n g c h i t o s a n se x c e l l e n t f i l m f o r m i n ga b i l i t ya n dg o o da d h e s i o n p r o p e r t i e s w eu s e di tt of o r map r e c o a t e df i l mo nt h es u r f a c eo ft h eg l a s s yc a r b o n e l e c t r o d e ( g c e ) t h ep l e n t ya m o u n t so fa m i n og r o u p so fc h i t o s a n f i l mo nt h e s u r f a c eo fg c ef a c i l i t a t e dt h ef o r m a t i o no fl l a n o a uf i l mo ni t ss u r f a c et h r o u g h s t r o n ge l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n c y s t e a m i n ec o n t a i n sm e r c a p t og r o u p sw h i c hm a k ei t c o n t a c tw i t hn a n o a ut i g h t l y ，b yi m m o b i l i z i n gt y r o s i n a s eo nt h ep o s i t i v e l y c h a r g e d a m i n og r o u p so fc y s t e a m i n e ，ac a t e c h o lb i o s e n s o rc a nb ef a b r i c a t e d t h eb i o s e n s o r p o s s e s s e d e x c e l l e n t r e s p o n s e s t ot h es u b s t r a t ew i t ht h e p r e s e n c e o f n e g a t i v e l y c h a r g e dn a n o a uw h i c hc a ne f f e c t i v e l yr e t a i na c t i v i t yo ft y r o s i n a s e t h e l i n e a rr a n g eo fd e t e c t i o nf o rc a t e c h 0 1i s1 o 1 0 一1 0 l0 4m o l la n dt h el i f e t i m eo f t h eb i o s e n s o rw a so v e r1m o n t h 2 c f en a n o c o m p o s i t ew a ss y n t h e s i z e db yi n t e r c a l a t i n gf e + i n t og r a p h i t eo x i d e ( g o ) l a y e r su n d e rar e d u c i n gh 2a t m o s p h e r e i t ss t r u c t u r ea n de l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t er i s t i c sw e r es t u d i e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec f en a n o c o m p o s i t e p o s s e s s e se x c e l l e n ta b i l i t yo fe l e c t r o n t r a n s f e r b yi m m o b i l i z i n gg o x o nt h es u r f a c e o fc f en a n o c o m p o s i t ep a s t ee l e c t r o d e ，am e d i a t o r l e s sg l u c o s eb i o s e n s o rw a s f a b r i c a t e d i nt h ea b s e n c eo fm e d i a t o r ，t h ea c t i v i t ya n ds t a b i l i t yo fg o xo nt h e s u r f a c eo fb i o s e n s o rc o u l db ee f f e c t i v e l yr e t a i n e d t h el i n e a rr a n g eo fd e t e c t i o nf o r g l u c o s ei s6 6 7 10 一1 0 10 m o l l t h eb i o s e n s o rh a sn or e s p o n s e st oa s c o r b i c a c i da n du r i ca c i dw h i c ho f t e ni n t e r f e r ew i t ht h ed e t e c t i o no fg l u c o s e 3 c a r b o nn a n o t u b e sh a v ea t t r a c t e dc o m p r e h e n s i v ea t t e n t i o n si na p p l i c a t i o no ft h e f a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r sb e c a u s eo ft h e i r u n i q u ep h y s i c a l a n dc h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n dt h e i re x c e l l e n ta b i l i t yo fe l e c t r o n t r a n s f e r w em o d i f i e d m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) w i t hn a n o - a ui nt h ep r e s e n c eo fc h i t o s a n ， i i 硕士学位论文 t h e ns o l g e l w a sa p p l i e dt oe m b e dt h en a n o a um o d i f i e dm w c n t st of a b r i c a t ea s u b m i c r o e l e c t r o d ea r r a y t h en e g a t i v e c h a r g e dn a n o a uo nt h es u r f a c eo fm w c n t s c a ni m m o b i l i z eh r pt h r o u g he l e c t r o s t a t i ci n t e r a t i o nt op r e p a r et h eh 2 0 2b i o s e n s o r r e s u l t sd i s p l a y e dt h a th r pc o u l db es t a b l yi m m o b i l i z e do nn a n o a um o n o l a y e ra n d t h em w c n t sc o u l da c c e l e r a t et h e e l e c t r o n - t r a n s f e r ；c o m p a r e d t on o r m a l d i m e n t i o n a lb i o s e n s o r ，t h es u b m i c r o e l e c t r o d ea r r a yr e s p o n s e st os u b s t r a t em o r e s e n s i t i v e l ya n dr a p i d l yw i t ht h el i n e a rr a n g ef o rh 2 0 2i s 6 6 7 x 1 0 1 3 3 x 1 0 1 m o l l 4 at y r o s i n a s eb i o s e n s o rb a s e do nab o r o n d o p e dd i a m o n d ( b d d ) e l e c t r o d ea st h e b a s ee l e c t r o d eh a sb e e nd e v e l o p e d t h ee n z y m eb i o s e n s o rc a t a l y z e sp h e n o l i c c o m p o u n d st og e tq u i n i n e sw h i c hc a nb er e d u c e dt op r o d u c er e d u c t i o nc u r r e n t t h e c a t a l y t i ce f f e c tw i t hr e s p e c tt op h e n o l so fs u c hb i o s e n s o ri sb e t t e rt h a nt h eo n ew h i c h w a sb a s e do nt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ea st h eb a s ee l e c t r o d e t h ee n z y m e e l e c t r o d ep r o v i d e dal i n e a rr e s p o n s et oc a t e c h o lo v e rac o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 10 xl0 一t o1 o xl0 。5m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f5 2 x10 一m o l l t h ea p p a r e n t m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( 彤) f o rt h es e n s o rw a sc a l c u l a t e dt ob e33 6 5g m o l l t h ee n z y m eb i o s e n s o rh a sg o o dr e s p o n s e st op h e n o la n dp - c r e s o l ，t h e l i n e a r c a t i b r a t i o nr a n g e st ot h e ma r e5 0 1 0 一2 0 x 1 0 5m o l la n d5 0 x 1 0 5 0 x 1 0 6 m o l lr e s p e c t i v e l y t h eb i o s e n s o rw a se v a l u a t e dw i t hs a t i s f a c t o r ya n a l y t i c a l p e r f o r m a n c ei nt e r m so ft h er e p e a t a b i l i t ya n ds t a b i l i t y k e yw o r d s ：e n z y m eb i o s e n s o r ；n a t i v el l a n o - a ui n t e r f a c e ；c f en a n o e o m p o s i t e ； m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) ；b o r o n d o p e dd i a m o n d e l e c t r o d e i i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： r 自姆舟 日期：，2 孵年彭月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： l 筠姆b 俞世j 切 日期：二p 汀年月二汨 日期：2 鲫睥月砚日 硕士学位论文 第1 章绪言 生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，也是电化学分析和生物技 术研究最为活跃的领域之一。所谓生物传感器就是由固定化的生物材料( 包括酶、 抗体、微生物等生物活性物质) 与适当的转换器件密切接触而形成的分析工具或 系统，它利用的是生物活性物质的亲和性，如酶一底物、酶一辅基、抗原一抗体、 激素一受体等的分子识别功能，可以有选择性地测量另一方，这种敏感元件又称 分子识别元件。由于生物活性物质具有专一识别功能，使得生物传感器具有较高 的选择性，能直接应用于复杂样品进行检测。生物传感器以灵敏度高、选择性高、 分离过程和检测技术合为一体、不需要样品制备等特点而受到广泛关注，目前发 展很快，已应用于临床医学检测、工业过程控制、环境检测、化学物质安全性评 价以及食品、制药等许多领域。 酶传感器是生物传感器领域中研究最多、且最灵敏的一种类型。1 9 6 2 年。 c l a r k 和l y o n s 提出将酶与电极结合的设想，他们将酶溶液夹在两层透析膜之间 形成一层薄的液层，再紧贴在p h 电极、氧电极和电导电极上，用于监测液层中 的反应1 1 1 ；1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c h s 采用当时最新方法，将葡萄糖氧化酶固定 在氧电极表面，研制出世界上第一支葡萄糖传感器1 2j 。此后，随着生物、化学、 物理学、医学、电子技术等相关学科的迅速发展，酶传感器的研究也取得了很大 的进步，成为国际上广泛研究的重要课题。 1 1 酶的本质和特征 酶是生物体内产生的、具有催化活性的一类蛋白质。分子量可以为一万到几 十万，甚至是数百万以上。根据化学组成酶可分为两大类，即纯蛋自酶与结合蛋 白酶。前者除蛋白质以外不含其他成分，如胰蛋白酶、胃蛋白酶和脲酶等。后者 是由蛋白质和非蛋白质两部分组成，非蛋白质部分若与酶蛋白结合得牢固，不易 分离则称辅基，如细胞色素氧化酶中的铁卧啉部分用透析法就不能将其与酶蛋白 分开；若结合得不牢，可在溶液中离解，则称为辅酶，如常见的烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸( n a d ，辅酶i ) 和烟酰胺腺嘌呤二苷酸磷酸( n a d p ，辅酶i i ) 都为脱氢 酶之辅酶。另外，根据酶的催化反应类型分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、异 构酶等。 酶的基本特征如下： ( 1 ) 酶的高效催化性酶是一类有催化活性的蛋白质，在生命活动中起着极 为重要的作用，参与所有新陈代谢过程中的生化反应，使得生命赖以生存的许多 复杂化学反应在常温下能发生，并以极高的速度和明显的方向性维持生命的代谢 新型纳米材料用于电流型酶生物传感器的研究 活动，可以说生命活动离不开酶。 ( 2 ) 酶的高度专性酶不仅具有一般催化剂加快反应速度的作用，而且具 有高度的专一性( 特异的选择性) ，即一种酶只能作用于一种或一类物质，产生 一定的产物，如淀粉酶则只能催化淀粉水解。酶催化的专一性一般表现为对作用 物分子结构的立体化学专性和非立体化学专一性。前者包括对镜像异构体的光 学专一性和对顺反异构体的几何专一性：后者包括键、基因和绝对专一性。酶的 分子识别功能及其反应过程如图1 1 所示。 底物 0 ，。 o 生成物 图i 1 酶的分子识别功能及其反应过程的示意图 酶的这种专一性及其催化低浓度底物反应的能力在化学分析上非常有用a 酶 催化反应用于分析目的已有较长时间，可用于酶的底物、催化剂、抑止剂以及酶 本身的测定。 1 2 酶传感器的类型 藕 质 透气膜、 p t 阴皇婺 电流测量 i p t # f l 电极 l = r 啪感善做幔卜电极 毫纂 象囊之， 一j 电流( 场效应) 一， 热敏电喧传感器 光纤传感器 图1 2 酶传感器的类型 2 - 硕士学位论文 酶传感器是应用固定化酶作为敏感元件的生物传感器。根据信号转换器的 类型，酶传感器大致可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器等( 见 图1 2 所示) 。 一、酶电极 酶电极是由固定化酶与离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电 极组合而成的生物传感器，因而具有酶的分子识别和选择催化功能，又有电化学 电极响应快、操作简便的特点，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度，且需 很少量的样品。目前，酶电极用于糖类、醇类、有机酸，氨基酸、激紊、三磷酸 腺苷等成分的测定。根据电化学测量信号，酶电极主要分为电流型酶电极和电位 型酶电极。 ( 1 ) 电流型酶电极【3 。j 电流型酶电极是指将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应产 生的电流信号，在一定条件下，铡得的电流信号与被测裼浓度呈线性关系。萁基 础电极可采用氧、过氧化氢电极，还可采用近年开发的介体修饰的碳、铂、钯和 金等基础电极。 ( 2 ) 电子介体增敏的酶电极m 7 i 酶氧化还原活性中心与电极表面之间的电子传递，在电流墅酶传感器中起着 关键的作用。对于分子量较大的酶，由于其氧化还原中心被一层很厚的绝缘蛋白 质包围，所以酶活性孛心与电极表蕊闻的童接电予传递难以发生。各种电子传递 介体的使用，使得电流型酶传感器的响应速度和检测灵敏度都得到了很大的提 高。电子介体是指能将酶反应过程中产生的电子扶酶反应中心转移到电极表面， 使电极产生相应电流变化的分子导电体。目前，常用的电子介体为有机低分子介 体齑离分子介体两类。有机低分子奔体主要是二茂铁及其徼生物、有机染料、醌 及其衍生物、四硫富瓦烯等；高分子介体主要包括变价过渡金属离子型和有机氧 化还原型等氧化还原聚合扬。离分子介体化合物通掌是由低分子介体化舍物与赢 分予链所带的活性基团进行反应固载生成的。由于高分子链间的相互缠结或交 联，能够扶根本上消除贪体的扩散流失阏题，傈证酶传感器具有稳定的嚷应。 ( 3 ) 电位型酶电极8 川j 电位型酶电极是将酶促反应所弓| 起的物质量的变化转变成电位信号输出，电 位信号大小与底物浓度的对数值里线性关系。所用的基础电极有p h 电极、气敏 电极( c 0 2 、n h 3 ) 等，它影璃着酶电极的响应时闻、捡测下限等许多性能。电 位型酶电极的适用范围，不仅取决于底物的溶解度，更重要的取决于基础电极的 捡测限，一般为1 0 1 0 m o i l ，当基础电极等选择适宜时可达1 0 一1 0 。 m o l l 。 二、f 疆一酶传感器 2 1 4 1 新型纳米材料用于二电流型酶生物传感器的研究 场效应晶体管酶传感器( f e t - - 酶) 是将酶膜复合场效应管的栅极，在进行 测量时，酶的催化作用使待测的有机分子反应生成了场效应晶体管能够响应的离 子。由于场效应晶体管栅极对表面电荷非常敏感，由此引起栅极的电极变化，这 样就可以对漏极电流进行调制，通过漏极电流的变化，获得所需信号。 三、热敏电阻酶传感器1 1 5 州l 热敏电阻酶传感器是由固定化酶和热敏电阻组合而成。酶反应的焓变量在5 1 0 0k j t o o l 范围内，现在市售的酶已有2 0 0 种以上，因此，在原理上至少可测 量与此相对应的2 0 0 种以上的底物。对于酶促反应，反应焓变与参与酶促反应有 关物质量相关。用酶热敏电阻测定待测物的含量是依据酶促反应产生热量的多少 来进行的。若反应体系是绝热体系，则酶促反应产生的热，使体系温度升高，借 测量体系的温度变化可推知待测物的含量。 四、光纤化学型酶传感器【1 8 2 0 】 光纤化学型酶传感器是利用酶的高选择性，待测物质( 相应酶的底物) 从样 品溶液中扩散到生物催化层，在固定化酶的催化下生成一种检测的物质；当底物 扩散速度与催化产物生成速度达成平衡时，即可得到一个稳定的光信号，信号大 小与底物浓度呈正比。 1 3 构建酶生物传感器的生物材料固定 在酶生物传感器的构建中，个关键技术就是如何将酶稳定、保持其高活性 地固定到传感换能器表面，构建酶生物传感器的敏感识别部分( 生物敏感膜) ， 这直接影响到酶生物传感器的测定重复性、灵敏性、线性范围、检测限及使用寿 命等。 1 3 1 常用的酶的固定化方法 1 、吸附法 2 - 2 3 l ：吸附法又分为物理吸附和化学离子交换吸附。物理吸附是 通过氢键、疏水键和7 c 电子亲和力等物理作用将酶固定于不溶性载体的方法；离 子交换吸附是指在适宜的p h 和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子 交换的相互作用而达到酶固定化的方法。物理吸附具有无需化学试剂、极少的活 化和清洗步骤，以及同其他化学法相比。很少发生酶降解，对酶分子活性影响较 小等优点。但对溶液的p h 变化、温度、离子强度和电极基底比较敏感，需要对 实验条件进行相当程度的优化，该方法还由于生物组分易从电极表面脱落，而不 被广泛采用，而且同其他固定技术相比，生物组分的寿命比较短。 2 、共价偶联法1 2 4 2 矾：共价偶联法是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团 和载体的功能基团进行共价偶联以固定酶的方法。通常要求在低温( 0 。c ) 、低 离子强度和生理p h 条件下进行，并常加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极 硕士学位论文 表面发生键合。共价偶联法的特点是结合牢固，蛋白质分子不易脱落，载体不易 被生物降解，使用寿命长，缺点是操作步骤较麻烦，酶活性可能因化学修饰而降 低，制备高活性固定化酶较困难。多用于酶膜和免疫膜的制作。 3 、交联法 2 7 2 8 】：交联法是利用双功能或多功能试齐j 在酶分子与载体问、或 酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法，例如用戊二醛加小牛 血浆蛋白交联葡萄糖氧化酶。交联法广泛用于酶膜和免疫膜的制备，操作简单， 结合牢固。但是这种方法的主要缺点是生物膜与换能器表面结合力不强，固定的 稳定性差。 4 、包理法：根据包埋方式不同，包埋法可分为生物材料整体包堙1 2 9 】和表面 膜包埋法 3 0 3 3 1 。整体包埋主要应用于电化学生物传感器制备中，将酶、导电材 料以及粘结荆一起混合均匀，形成导电复合材料，压至特制的管榜中，并形成电 连接，便获得生物材料修饰电极；表面膜包埋法则是用特定的膜将生物材料固定 在换熊器表面，获得生物敏感膜，可利用的膜材料较多，包括水凝胶、l b 膜、 溶胶一凝胶膜以及各种电聚合膜等。膜包埋一般不涉及对生物材料化学处理，所 以，对固定生物材料活性影响较小，同时，膜的孔径和几何形状可以适当调控， 有利于底物分子及电子媒介的穿透。由于有广泛可得的成膜材料，因而使得膜包 埋技术成为生物材料固定的主要方法。但膜的生物褶容性、稳定性、膜与换能器 表面的粘结性等，是膜包埋技术中常遇到的问题。因此。致力于改进膜的性能， 延长生物传感嚣的使用寿命，仍是嚣翦生物传感器研制中豹热门研究领域。 5 、夹心法：将生物活性物质封闭在双层滤膜之间，形象地称为夹心法。依 生物材料不同两选择不同孑l 径的滤膜。如耀于酶的滤骥孔径为1 0 3 0 0 耻m ，用 于微生物的为0 0 5 1 0t a m ，用于组织的膜孔为0 5 1 0 a m 。这种方法操作简单， 不需任何化学处理，固定生物量大，响应速度快，重用性好。特别适应于微生物 和组织膜的制作，当用于制作酶膜时稳定性较差。 1 3 2 近期生物材料固定靳方法简介 如上所述。虽然常用于固定生物材料的方法很多，但每种技术都有自身的优 势与不足，人们一直在努力探索生物材料新的固定方法，以达到高稳定固定、商 生物活性保持、简单实用、良好的固定重复性等目的。近年来的研究表明：通过 带相反电荷聚电解质在圆体表面的层层组装，可以形成非常稳定的自组装膜 3 4 - 3 7 1 ，常用的正电性聚电解质有聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、聚l 赖氨酸、聚( n 乙基4 一烯基吡啶) 、聚二甲基二烯丙基胺等：负电性聚电解质包括聚苯烯磺酸、 聚甲基丙烯酸、聚苯胺丙烯酸等。人们利用聚电解质的这种性质固定生物材料， 构建生物传感器。传感器性能得到显著改善。s i r k a r 等利用s - a u 共价结合性质， 将1 1 一巯基十一酸修饰到a u 电极表面，得到负电性表面，再交替将正电性聚电 新型纳米材料用f 电流型酶生物传感器的研究 解质：共价结合电子媒介锇一联吡啶络合物的聚乙烯吡啶与聚烯丙基胺共聚物与 负电性葡萄糖氧化酶及乳酸氧化酶组装到a u 电极表面，得到一个纳米复合生物 活性膜，用于对葡萄糖和乳酸的传感测定【3 8 】；m i z u t a n i 等将a u 电极表面自组装 一层巯基丙酸，然后正电性的聚赖氨酸和负电性的聚苯烯磺酸交替组装在其上， 再将葡萄糖氧化酶用戊二醛交联固定到聚赖氨酸层表面，构成测定葡萄糖的酶电 极，这种固定酶的方法所制备的葡萄糖传感器可以极大地减小来自抗坏血酸、 尿酸等的干扰 3 9 】。除此之外，还发展了一些其它新的生物材料固定方法。例如 利用聚合物材料水溶性对p h 变化敏感的特性，用阳极电化学氧化或阴极还原水， 使电极表面附近p h 发生改变，从而改变聚合物的溶解度，使其沉积在电极表面， 生物材料可随聚合物同时沉积在电极表面，从而将生物材料固定，这种方法具有 固定重复性高、生物组分活性良好保持等优点 4 0 l 。 1 4 纳米材料在酶生物传感中的应用 纳米科学技术是2 0 世纪8 0 年代初迅速发展起来的新型前沿科研领域，1 9 9 0 年在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科学技术会议，正式标志着纳米科学的 诞生1 4 “。纳米是一种计量单位，它特指粒径在1 1 0 0n m 的颗粒，纳米科学是指 研究在i 1 0 0n m 尺寸范围内物质具有的物理、化学性质和功能的科学。这一尺 寸大小的粒子处在原予、分子为代表的微观世界和宏观物质世界交界的过渡区 域，因此，纳米颗粒产生了常规颗粒所不具有的新效应。( 1 ) 表谣效应：指缩米 粒子表面原子数与总体积原子数之比随粒径的变小而急剧增大，从而引起性质上 的突变。表面原子数的增加，原子配位的不足，使纳米材料具有很离的表蘧自由 能表面活性很强：( 2 ) 体积效应：由于纳米粒子体积极小包含数目极少的原 子，相应的质量也缀小，因此，呈现出与常规物质不同的性质：( 3 ) 量子尺寸效 应：当粒子的尺寸小到某一值时，金属的费米能级附近的电子能级由准连续变为 离教，纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据分子轨道和最低未被占据的分子 轨道能级，从而使得能隙变宽，这种现象称为量子尺寸效应：( 4 ) 宏观量子隧道 效应：纳米粒子具有贯穿势垒的麓力，称为隧道效应。近年来，入们发现一些宏 观量，例如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁能量以及电荷等亦具有隧道 效应，它们可以穿越宏鼹体系的势垒。正是具有以上特性，使得纳米颗粒与生物 材料有着特殊的相互作用，人们已经将金属纳米粒子、碳纳米管以及磁性纳米粒 子等应用到化学、生物分辑及传感器设计中。纳米颗粒在酶生物传感嚣设计中的 应用大致可以分为以下几方面： 1 4 1 通过掺杂纳米粒子改进酶生物传感器性麓 将纳米粒子直接掺杂到固定生物材料的敏感膜或与生物活性组分一起整体 新型纳米材料用于电流型酶生物传感器的研究 解质：共价结合电子媒介锇一联吡啶络合物的聚乙烯吡啶与聚烯丙基胺共聚物与 负电性葡萄糖氧化酶及乳酸氧化酶组装到a u 电极表面，得到一个纳米复合生物 活性膜，用于对葡萄糖和乳酸的传感测定 3 8 1 ；m i z u t a n i 等将a u 电极表面自组装 一层巯基丙酸，然后正电性的聚赖氨酸和负电性的聚苯烯磺酸交替组装在其上， 再将葡萄糖氧化酶用戊二醛交联固定到聚赖氨酸层表面，构成测定葡萄糖的酶电 极，这种固定酶的方法所制各的葡萄糖传感器，可以极大地减小来自抗坏血酸、 尿酸等的干扰【”l 。除此之外，还发展了一些其它新的生物材料固定方法。例如 利用聚合物材料水溶性对p h 变化敏感的特性，用阳极电化学氧化或阴极还原水， 使电极表面附近p h 发生改变，从而改变聚合物的溶解度，使其沉积在电极表面， 生物材料可随聚合物同时沉积在电极表面，从而将生物材料固定，这种方法具有 固定重复性高、生物组分活性良好保持等优点h 0 1 。 1 4 纳米材料在酶生物传感中的应用 纳米科学技术是2 0 世纪8 0 年代仞迅速发展起来的新型前沿科研领域，1 9 9 0 年在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科学技术会议，正式标志着纳米科学的 诞生 4 1 1 。纳米是种计量单位，它特指粒径在1 1 0 0n m 的颗粒，纳米科学是指 研究在1 1 0 01 3 m 尺寸范围内物质具有的物理、化学性质和功能的科学。这尺 寸大小的粒子处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物质世界交界的过渡区 域，因此，纳米颗粒产生了常规颗粒所不具有的新效应。( 1 ) 表面效应：指纳米 粒子表面原子数与总体积原子数之比随粒径的变小而急剧增大，从而引起性质上 的突变。表面原子数的增加，原子配位的不足，使纳米材料具有很高的表面自由 能，表面活性很强；( 2 ) 体积效应：由于纳米粒子体积极小，包含数目极少的原 子，相应的质量也很小，因此，呈现出与常规物质不同的性质；( 3 ) 量子尺寸效 应：当粒子的尺寸小到某一值时，金属的费米能级附近的电子能级由准连续变为 离散，纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据分子轨道和最低未被占据的分子 轨道能级。从而使得能隙变宽，这种现象称为量子尺寸效应；( 4 ) 宏观量子隧道 效应：纳米粒子具有贯穿势垒的能力，称为隧道效应。近年来，人们发现一些宏 观量，例如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁能量以及电荷等亦具有隧道 效应，它们可以穿越宏观体系的势垒。正是具有以上特性，使得纳米颗粒与生物 材料有着特殊的相互作用，人们已经将金属纳米粒子、碳纳米管以及磁性纳米粒 子等应用到化学、生物分析及传感器设计中。纳米颗粒在酶生物传感器设计中的 应用大致可以分为以下几方面： 1 4 1 通过掺杂纳米粒予改进酶生物传感器性能 将纳米粒子直接掺杂到固定生物材料的敏感膜或与生物活性组分一起整体 将纳米粒子直接掺杂到固定生物材料的敏感膜或与生物活性组分一起整体 硕士学位论文 包埋于电极体内，由于纳米颗粒比表面积大、表面自由能高、具有良好的生物相 容性，因而可以增加生物材料固定的稳定性和有效保持固定生物材料的活性，并 可改进生物酶与基体电极之间的电子传导能力，实现酶与基体电极之间的直接电 子转移。c r u m b l i s s 研究小组最早以纳米a u 和辣根过氧化物酶( h r p ) 为对象进行 这一方面的研究【4 2 q5 1 ，例如，将纳米a u 溶胶与h r p 混合后，通过蒸发沉积的 方法将h r p 固定在a u 电极和玻碳电极表面，h r p 与电极之间产生直接电子转 移，构成无需媒介的第三代h 2 0 2 生物传感器【4 2 j ；最近几年，这一领域的研究又 得到了新的发展，开始应用于其他生物酶，b h a r a t h i 等人以n - 3 - ( 三甲氧基硅 基) 丙基1 乙二氨为合成纳米a u 的稳定剂，合成的纳米a u 与葡萄糖氧化酶混合 后用电化学沉积方法将其沉积到i t o 电极表面，制备葡萄糖生物传感器，其 有效使用寿命达4 个月之久1 4 6 】；l i m 等人将纳米p t 和葡萄糖氧化酶一起电沉积 到经n a t i o n 溶解的多壁碳纳米管膜表面，制备的传感器对葡萄糖响应迅速、灵 敏【4 7 1 。唐芳琼等合成了亲水纳米a u 、憎水纳米a u 、纳米a g 、憎水纳米s i 0 2 等纳米颗粒，单独或复合使用于葡萄糖酶电极的制备中，利用聚乙烯醇缩丁醛为 膜材料，将葡萄糖氧化酶与纳米颗粒共同包埋于p t 电极表面，制备了一系列纳 米颗粒增强的葡萄糖生物传感器，并对其作用机理作了详细阐明 4 a s h 。 1 4 2 构建纳米活性界面用于固定生物材料 采用适当的物理、化学方法，通过对换能器表面修饰后，获锝纳米亲合基团， 再在其上形成纳米活性界面：也可以用特殊的交联试剂通过层层组装的方法将纳 米颗粒修饰到换能器表面，形成纳米活性界面。然后利用形成的纳米活性界面来 固定生物材料，制备生物传感器。j i a 等通过3 一巯基丙基三甲氧基硅烷在金电极 表面自组装，在金电极表面获得含巯基的溶胶一凝胶膜，再将纳米a u 结合到巯 基上，最后将h r p 固定到纳米a u 表面，由此固定的h r p 可以直接电化学测定 h 2 0 2 ，构建无需电子媒介体的第三代h 2 0 2 生物传感器 5 2 】；c h e n 等人在a u 电极 表面修饰一层半胱胺，并共价结合戊二醛，通过戊二醛，再结合一层半胱胺，半 胱胺的一s h 端基用于固定纳米a u ，于是，在金电极表面形成纳米a u 活性界面， 用此活性界面固定h r p ，制成h 2 0 2 传感器，研究结果表明：固定在纳米a u 上 的h r p 活性得到有效保持，对h 2 0 2 有很强的催化能力1 5 3 1 。h r a p o v i c 等人利用 n a t i o n 溶解单壁碳纳米管与纳米p t 混合形成电极表面，通过戊二醛固定h r p ， 制备的传感器对过氧化氢的响应灵敏度显著提高【54 1 。l i n 等在覆盏有c r 的s i 片 表面电沉积n i 纳米粒子，然后利用等离子化学气相沉积的方法在这些n i 纳米粒 子上形成碳纳米管阵列，通过e d c 交联将葡萄糖氧化酶固定到碳纳米管顶端制 备了无电子媒介的葡萄糖纳米电极阵列，结果显示，碳纳米管具有良好的电子传 导能力和电催化能力，形成的传感器具有良好的抗干扰能力 5 5 1 。 新型纳米材料用于电流型酶生物传感器的研究 1 5 本研究工作的构思 在广泛查阕生物传感器相关最新文献报道的基础上，结合本实验室原有工作 基础，针对目前电化学酶生物传感器研究中的热点问题，即如何发展简便、可靠 的方法将酶高稳定、保持其高活性地固定到基体电极表面，制备响应性能优良、 使用寿命延长的新型电化学生物传感器，具体考虑从以下几方面开展研究工作： ( 1 ) 研究表明：很多纳米颗粒具有良好的生物相容性，可以有效保持生物材 料的活性；另一方面，表面效应是纳米颗粒最重要的效应之一，纳米颗粒的表面 效应使得其具有很高的表面吸附能力，是固定生物材料合适的媒介，同时纳米粒 子可与生物分子的某些特定基团定向结合，使固定的生物分子达到定向排列、取 向规则的目的，可望进一步提高固定生物材料的活性。因此，直接利用在传感换 能器表面形成的纳米活性界面固定生物材料，将具有固定稳定、高效地保持生物 活性等优点，是生物传感器敏感膜构建的有效方法，可望构建性能优良的新型电 化学生物传感器。目前，这方面的研究报道所用的方法相对复杂。本研究中拟选 用纳米a u 为材料，通过化学修饰的方法获锝纳米a u 亲合电极表面，然后，通 过纳米a u 与亲合基团的强相互作用，在电极表面形成稳定的纳米a u 活性界面， 并用于酶的固定，研制基于纳米a u 活性界面固定酶的新型电化学酶生物传感器； ( 2 ) 电流型酶传感器是利用酶催化的氧化还原反应，即在恒电位下快速进行， 将电子从反应中心转移到电极表面。电子转移的难易和速度决定着这种传感器的 性质。但似乎很难发生酶与电极之间的直接电予转移，因为酶的活性中心是深埋 在蛋白质内部的，氧化状态的酶从电极上直接得到电子是非常困难的，人们一直