（海洋化学专业论文）新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究.pdf

新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究 新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究 摘要 壳聚糖由于独特的结构和优异的性能，自发现以来便得到了普遍的重视和迅 速的发展。但其在大多数溶剂中的溶解度都很小，从而限制了壳聚糖在各领域中 的应用。本论文针对壳聚糖及其化学改性和食品防腐抗菌剂的发展趋势，以壳聚 糖为原料，通过酰化反应和席夫碱化反应制备得到四种新型壳聚糖衍生物，并研 究了各反应因素对合成实验的影响，提出了较佳的合成条件。经红外光谱和元素 分析方法对壳聚糖衍生物的结构进行了表征，并研究了其溶解性能。同时，对四 种壳聚糖衍生物进行了抗菌活性实验研究。主要结论如下： 1 酰化壳聚糖衍生物的制备及表征 ( 1 ) 制各山梨酰壳聚糖衍生物。山梨酸与氯化亚砜反应生成山梨酰氯，在 超声波振荡下，与壳聚糖的乙酸溶液混合制备得到山梨酰壳聚糖衍生物，丙酮进 行索氏提取，真空干燥后得产物。正交实验确定最佳反应条件，反应温度5 0 ， 反应时间4 小时，反应物配比为l ：4 。最优化条件下，重复实验得到衍生物最 大取代度为0 8 1 。采用红外光谱和元素分析法对产物进行了结构表征。结果表明， 产物具有山梨酰壳聚糖的结构特征，山梨酰氯主要在壳聚糖的氨基上发生酰化反 应。 ( 2 ) 制备对氨基苯甲酰壳聚糖衍生物。对氨基苯甲酸与氯化亚砜反应生成 对氨基苯甲酰氯，在超声波振荡下，与壳聚糖的乙酸溶液混合制备得到对氨基苯 甲酰壳聚糖衍生物，丙酮进行索氏提取，真空干燥后得产物。正交实验确定最佳 反应条件，反应温度5 0 ，反应时间3 小时，反应物配比为1 ：3 。最优化条件 下，重复实验得到衍生物最大取代度为0 7 9 。采用红外光谱和元素分析法对产物 进行了结构表征。结果表明，产物具有对氨基苯甲酰壳聚糖的结构特征，对氨基 苯甲酰氯主要在壳聚糖的氨基上发生酰化反应。 2 席夫碱壳聚糖衍生物的制备及表征 ( 1 ) 制备壳聚糖缩柠檬醛席夫碱衍生物。壳聚糖分散于甲醇中溶胀，于恒 压滴液漏斗中缓慢滴加相应量的柠檬醛，在超声波振荡下，反应一定时间得黄色 粉末状固体产物，用无水乙醇在索氏抽提器上回流萃取，真空干燥得到壳聚糖缩 柠檬醛席夫碱产物。正交实验确定最佳反应条件，反应温度4 0 5 0 ，反应时间 新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究 1 0 小时，反应物配比为l ：6 。在最优化条件下，进行优化条件重复实验，衍生 物缩合率可达8 6 4 1 ，取代度为o 8 2 。采用红外光谱和元素分析法对产物进行 了结构表征。结果表明，产物具有壳聚糖缩柠檬醛席夫碱的结构特征。 ( 2 ) 制备壳聚糖缩肉桂醛席夫碱衍生物。壳聚糖分散于甲醇中溶胀，于恒 压滴液漏斗中缓慢滴加相应量的肉桂醛，在超声波振荡下，反应一定时间得黄色 粉末状固体产物，用无水乙醇在索氏抽提器上回流萃取，真空干燥得到壳聚糖缩 肉桂醛席夫碱产物。正交实验确定最佳反应条件，反应温度4 0 ，反应时间8 小时，反应物配比为1 ：6 。在最优化条件下，进行优化条件重复实验，衍生物 缩合率可达8 9 3 8 ，取代度为o 8 4 。采用红外光谱和元素分析法对产物进行了 结构表征。结果表明，产物具有壳聚糖缩肉桂醛席夫碱的结构特征。 3 壳聚糖衍生物抗菌活性研究 以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉为试验菌种，研究壳聚糖衍生物的抗 菌性能，绘制细菌和霉菌的生长抑制曲线，测定壳聚糖衍生物对不同菌种的抑菌 率，为其作为一种新型抗菌剂的应用提供依据。 研究结果表明，壳聚糖衍生物对实验中用到的细菌和霉菌的抑制能力均显著 优于壳聚糖。其中，壳聚糖缩肉桂醛席夫碱对革兰氏阴性菌大肠杆菌的最低抑菌 浓度为0 0 8 ；山梨酰壳聚糖对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为 o 0 8 ；壳聚糖缩柠檬醛席夫碱和壳聚糖缩肉桂醛席夫碱对霉菌黑曲霉的最低抑 菌浓度均为0 5 。四种壳聚糖衍生物的抑菌谱宽于壳聚糖，抑菌能力也远大于 其反应物壳聚糖。由此可见，在壳聚糖分子链上连接不同的基团后，不仅改变了 壳聚糖的溶解性能，而且增强了壳聚糖的抑菌活性，扩大了抑菌范围。 关键词：壳聚糖；超声波；酰化反应；席夫碱；抗菌活性 新型壳聚糖衍生物的制各及其抗菌活性研究 p r e p a r a t i o na n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so f n o v e ld e r i v a t i v e so fc h i t o s a n a b s t r a c t f o rm a n yy e a r s ，c h i t o s a nh a sa t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o nb e c a u s eo fi t sf a s c i n a t i n g s t r u c t u r a lf e a t u r e sa n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n s h o w e v e r , c h i t o s a ni sl i m i t e di nv a r i o u s a p p l i c a t i o nd o m a i n sf o rt h ep o o rs o l u b i l i t y n o v e ld e r i v a t i v e so fc h i f o s a nw e r e s y n t h e s i z e db yt h ea c y l a t e dr e a c t i o na n ds c h i f fb a s er e a c t i o n t h ee f f e c to fr e a c t i o n f a c t o r so nt h ey i e l dh a db e e ni n v e s t i g a t e da n dt h es u i t a b l ec o n d i t i o n sw e r ea c h i e v e d t h es t r u c t u r e so fd e r i v a t i v e sh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e db yt h ef t i rs p e c t r o s c o p ya n d e l e m e n t a la n a l y s i s t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fc h i t o s a na n dd e r i v a t i v e sw e r e i n v e s t i g a t e da g a i n s te s c h e r i c h i ac o i l , s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n da s p e r g i l l u sn i g e 厂 t h em a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sa x ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn - a c y lc h i t o s a n s p r e p a r a t i o no fs o r b y lc h i t o s a n s o r b y lc h l o r i d ew a ss y n t h e s i z e db yt h er e a c t i o n o fs o r b i ca c i dw i t ht h i o n y lc h l o r i d e t h e nc h i t o s a nr e a c t e d 、访ms o r b y lc h l o r i d et o f o r mt h es o r b y lc h i t o s a nw o r k i n gu n d e rh i g h - i n t e n s i t yu l t r a s o u n d t h ep r o d u c tw a s f i l t e r e da n de x t r a c t e di nas o x h l e ta p p a r a t u s 、 ，i 也a c e t o n e ，v a c u u md r y i n g t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e5 0 c ，t h er a t i oo fc h i t o s a nt os o r b i ca c i d , 1 ：4a n d r e a c t i o n t i m e ，4 h t h em a x i m u md e g r e eo fs u b s t i t u t i o nw a s0 81u n d e ro p t i m u m c o n d i t i o n s t h es t r u c t u r eo fs o r b y lc h l t o s a nh a sb e e nc h a r a c t e r i z e db yt h ef t i r s p e c t r o s c o p ya n de l e m e n t a la n a l y s i s t h er e s u l t sc o n f w m e dt h a ta m i n og r o u p so n c h i t o s a nr e a c t e d 、 ，i ms o r b y lc h l o r i d et of o r mt h es o r b y lc h l t o s a n p r e p a r a t i o n o fp - a m i n o b e n z o y l c h i t o s a n p - a m i n o b e n z o y l c h l o r i d ew a s s y n t h e s i z e db yt h er e a c t i o no fp a m i n o b e n z o y la c i dw i t ht h i o n y lc h l o r i d e t h e n c h l t o s a nr e a c t e d 、析mp - a m i n o b e n z o y lc h l o r i d et of o r mt h ep a m i n o b e n z o y lc h i t o s a n w o r k i n gu n d e rh i g h i n t e n s i t yu l t r a s o u n d t h ep r o d u c tw a sf i l t e r e da n de x t r a c t e di na s o x h l e ta p p a r a t u s 、】i r i 也a c e t o n e ，v a c u u m d r y i n g t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e t e m p e r a t u r e5 0 c ，t h er a t i oo f c h i t o s a nt op a m i n o b e n z o y la c i d ，1 ：3a n dr e a c t i o nt i m e ， 3 h t h em a x i m u md e g r e eo fs u b s t i t u t i o nw a s0 7 9u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s t h e s t r u c t u r eo fp a m i n o b e n z o y lc h l t o s a nh a sb e e nc h a r a c t e r i z e d b y t h ef t i r s p e c t r o s c o p ya n de l e m e n t a la n a l y s i s t h er e s u l t se o n f l r m e dt h a ta m i n og r o u p so n c h i t o s a nr e a c t e dw i t hp - a m i n o b e n z o y lc h l o r i d et of o r mt h ep - a m i n o b e n z o y lc h l t o s a n 2 p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs c h i f fb a s eo fc h i t o s a n s p r e p a r a t i o no fs c h i f fb a s ef r o mc h i t o s a na n de i t r a l c h l t o s a nw a sd i s p e r s e di n 新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究 m e t h a n 0 1i nt h et h r e e n e c k e df l a s k t h e ne i t r a ld i s s o l v e di na n h y d r o u se t h a n o lw r i t s a d d e dd r o p - w i s et ot h es o l u t i o nu n d e rh i g h - i n t e n s i t yu l t r a s o u n da tc e r t a i nt e m p e r a t u r e f o rs o m et i m e 。晒e nt h er e a c t i o ne n d e d 。t h ep r o d u c tw a sf i l t e r e da n dt h eu n r e a c t e d c i t r a lw a se x t r a c t e di nas o x h l e ta p p a r a t u sw i t ha n h y d r o u se t h a n o l ，a n dt h e nd r i e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e4 0 5 0 ，t h er a t i oo fc h i t o s a nt oc i t r a l ，1 ：6 a n dr e a c t i o nt i m e 1 0 h t h em a x i m u my i e l da c h i e v e dw a s8 6 4 1 a n dt h ed e g r e eo f s u b s t i t u t i o nw a s0 8 2u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s t h es t r u c t u r eo fs c h i f fb a s eh a sb e e n c h a r a c t e r i z e db yt h ef t i r s p e c t r o s c o p ya n de l e m e n t a la n a l y s i s n l er e s u l t sc o n f i r m e d t h a ta m i n og r o u p so nc h i t o s a nr e a c t e dw i t hc i t r a lt of o r mt h es c h i 行b a s e p r e p a r a t i o no fs c h i f fb a s ef r o mc h i t o s a na n dc i n n a m a l d e h y d e c h i t o s a nw a s d i s p e r s e di nm e t h a n o li nt h et h r e e n e c k e df l a s k t h e nc i n n a m a l d e h y d ed i s s o l v e di n a n h y d r o u se t h a n o l w a sa d d e dd r o p w i s et ot h es o l u t i o nu n d e rh i g h i n t e n s i t y u l t r a s o u n da tc e r t a i nt e m p e r a t u r ef o rs o m et i m e 。鼢e nt h er e a c t i o ne n d e d 。t h ep r o d u c t w a sf i l t e r e da n dt h eu n r e a c t e dc i n n a m a l d e h y d ew a se x t r a c t e di nas o x h l e ta p p a r a t u s 嘶t l la n h y d r o u se t h a n o l ，a n dt h e nd r i e d 1 1 1 eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e4 0 ，t h er a t i oo fc h i t o s a nt oc i n n a m a l d e h y d e ，1 ：6a n dr e a c t i o nt i m e ，8 h 1 1 1 em a x i m u m y i e l da c h i e v e dw a s8 9 38 a n dt h ed e g r e eo fs u b s t i t u t i o nw a s0 8 4u n d e ro p t i m u m c o n d i t i o n s t h es t r u c t u r eo fs c h i f fb a s eh a sb e e nc h a r a c t e r i z e db yt h ef t i r s p e c t r o s c o p ya n de l e m e n t a la n a l y s i s ，n l er e s u l t sc o n f i r m e dt h a ta i d i n og r o u p so n c h i t o s a nr e a c t e dw i t hc i r m a m a l d e h y d et of o r mt h es c h i f fb a s e 3 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fn o v e ld e r i v a t i v e so fc h i t o s a n 1 1 1 ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fc h i t o s a na n dd e r i v a t i v e sw e r ei n v e s t i g a t e db y a s s e s s i n gt h ei n h i b i t o r y r a t e so fe s c h e r i c h i ac o i l , s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n d a s p e r g i l l u sn i g e r n eg r o w t hc l l r v c sw e r ea l s od e s c r i b e d n l er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed e r i v a t i v e sh a dt h ee f f e c to fb a c t e r i o s t a s i sa n dt h e a n t i b a c t e r i a la c t i 帆i n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o n i tw a sa l s of o u n d t h a tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so ft h ed e r i v a t i v e sw e r es t r o n g e rt h a nt h a to fc h i t o s a n t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n 伽c ) o fs c h i f fb a s e o fc h i t o s a nw i t h c i n n a m a l d e h y d et oe c o i lw a s0 0 8 ；m i co fs o r b y lc h i t o s a nt o & a u r e u sw a s0 0 8 ； m i c so fs c h i f fb a s eo fc h i t o s a nw i t he i t r a la n ds c h i f fb a s eo fc h i t o s a nw i 也 c i n n a m a l d e h y d et oa n i g e rw e r eb o t h0 5 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed e r i v a t i v e s o fc h i t o s a nh a db e t t e ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e st h a nc h i t o s a n 1 1 1 en o v e lc h i t o s a n d e r i v a t i v e s i m p r o v e t h ea n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o fc h i t o s a na n de x p a n dt h e a n t i m i c r o b i a ls p e c t r u mc o m p a r e dw i t ht h a to fc h i t o s a n k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；u l t r a s o u n d ；a c y l a t e dr e a c t i o n ；s c h i f f b a s e ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 独创声。明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；地没查甚他盂要挂剔直明的：奎拦豆窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说剧j 并茅i 示谢意。 莩位论文作者签名：剁版签字日期：叼年b 月1 5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：眦战 签字日期：如卵年6 月j 箩日 r 一钼 年 函 卅 字 期 签 日 师 字 导 签 新型壳聚糖衍生物的制各及其抗菌活性研究 【j 刖吾 甲壳素( c h i t i n ) 广泛存在于自然界的甲壳类、昆虫类和软体类动物的骨骼 以及某些藻类和菌类的细胞壁中，它是地球上蕴藏量最丰富的有机物之一，尤其 在虾、蟹壳中的含量高达1 5 3 0 。每年生物合成的甲壳素达1 0 0 亿吨以上， 其年产量：仅次于纤维素，是地球上一种取之不尽、用之不竭的可再生天然资源。 甲壳素和脱乙酰基产物壳聚糖( c h i t o s a n ) 均属于带有氨基的线性生物大分 子多糖，具有独特的理化特性和生物学功能，与作为能量来源的淀粉和植物结构 支持物旷纤维紊有所不同。 人类利用和研究纤维素已有数千年的历史，而对甲壳素和壳聚糖的利用和研 究还只是近百年来的事，真正引起人们的重视和关注是从2 0 世纪7 0 年代开始 的。现在，甲壳素和壳聚糖及其衍生化的研究和应用已经成为了当今世界多糖研 究领域的热点之一。 随着资源的有效利用及环境友好高分子材料需求的增长，甲壳素和壳聚糖越 来越引起了诸多国内外学者的关注。目前，全球已经形成了甲壳素和壳聚糖及其 衍生物的开发热潮。我国的海岸线长，且江河湖海纵横交错，具有丰富的甲壳素 资源。因此，有效地利用这一宝贵资源，对促进国民经济的发展是很有意义的。 本论文介绍了壳聚糖的基本理化性能，总结了壳聚糖的酰化、酯化、醚化、 烷基化、席夫碱化、季铵化、交联和接枝共聚反应以及在抗菌方面的研究进展， 着重针对壳聚糖及其化学改性和食品防腐抗菌剂的发展趋势，通过酰化反应和席 夫碱化反应制备得出四种新型壳聚糖衍生物，同时，对四种壳聚糖衍生物进行了 抗菌活性实验研究。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉为试验菌种，研究壳 聚糖及其衍生物的抗菌性能，绘制细菌和霉菌的生长抑制曲线，测定壳聚糖及其 衍生物对不同菌种的抑菌率，期望能够为壳聚糖及其衍生物在食品防腐添加剂中 的应用提供可以借鉴的资料。 三年来，在导师的悉心指导下，论文工作取得了一定的进展和成绩，但由于 甲壳素和壳聚糖涉及的学科领域较多，且发展速度很快，加之作者的水平及能力 有限，时间仓促，因此对该领域的探讨分析存在很多不足之处，恐难免差错。在 此，真诚的希望各位专家、老师及同学批评指正，对本文提出宝贵的意见。 中国海洋大学硕士论文 1 文献综述 壳聚糖在自然界中储量丰富，广泛存在于虾、蟹和昆虫的外壳以及藻类、菌 类的细胞壁之中，是年产量仅次于纤维素的第二大天然高分子聚合物，也是迄今 为止发现的唯一天然碱性多糖。近年来，壳聚糖良好的生物降解性、生物相容性、 成膜特性和较强的抗菌防腐保鲜能力已引起了广泛的关注和重视，在环境保护、 生物医药、食品工业和化工等方面的开发应用研究十分活跃【1 】。 1 1 壳聚糖的物理改性 壳聚糖是乙酰胺基葡萄糖多聚物甲壳素的脱乙酰化产物，分子链由p ( 1 _ 4 ) 2 乙酰胺基d 葡糖单元和p - ( 1 - 4 ) 2 氨基d 葡糖单元组成的共聚物，它是白色无定 型、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料和制备方法有所不同，其相对分子质 量从数十万至数百万不等。壳聚糖不溶于水和碱溶液，能溶于稀的盐酸、硝酸等 无机酸和大多数有机酸，但不溶于稀的硫酸、磷酸。在稀酸中，壳聚糖的主链会 缓慢水解，其溶液的粘度逐渐降低，因此，壳聚糖溶液一般是随用随配f 2 】。 c l h 3严 c l - 1 3 c h 9 图1 1 甲壳素的结构式 f i g 1 - 1 r i ms m u c t u l 托o f c b i t l n 翰。蜉。雉hh 斗 似0 hi 早氍弘0 h 与触3 i 0 2 c 图1 2 壳聚疆的结构式 f i g 1 2t h et m u c t u u mo f c b i t o m m 相对分子质量和脱乙酰度是壳聚糖的两项主要性能指标。测定壳聚糖的分子 量【3 】，可像测定其它高聚物一样采用粘度法、高压液相色谱法、蒸气压法、光散 射法、端基分析法、渗透压法和超过滤法等等，但最常用的是粘度法。测定脱乙 酰度的方法包括酸碱滴定法【4 】、氢溴酸盐法【5 】、电位滴定法旧、元素分析法【刀、胶 体滴定法f t 、红外光谱法【引、核磁共振谱法【9 j f l 们、紫外光谱法【i l j 等等。 2 新型壳聚糖衍生物的制各及其抗菌活性研究 近年来，人们应用了各种方法对壳聚糖进行改性，以期开发出其潜在的应用 价值。壳聚糖的改性按方法分为物理改性和化学改性。物理改性方法包括将壳聚 糖进一步细化，然后得到粒径更小、比表面积更大和吸附性能更好的壳聚糖微粒； 将壳聚糖与其它的化合物( 如聚铝、小分子无机物、酶等) 复合；得到具有一定 功能的壳聚糖复合物等。 1 1 1 聚电解质复合 壳聚糖是一种天然的碱性多糖，当带有正电荷的壳聚糖与带相反电荷的另一 组相混合时，就形成聚电解质复合物( p e c ) 。所形成的p e c 的溶解性、电荷密 度等都与实验条件有极大的关系。因此，可通过不同的实验条件制备得到能满足 不同需要的微球、薄膜、纤维、胶囊、海绵状物等等【1 2 】。 壳聚糖与葡糖胺多糖( 如透明质酸和硫酸软骨素) 可形成聚电解质复合物。 此外，壳聚糖与水杨酸的衍生物聚( 4 - n 甲基丙烯酸氨基苯甲酸) 进行等摩尔浓 度混合时，也可制备得到聚电解质互聚物。卵磷脂是细胞质膜中的重要成分，其 具有两条长的烃链和带正电荷的极性头部，兼有亲水性和疏水性。将壳聚糖与卵 磷脂复合成膜，可提高膜的拉伸强度【1 3 1 。 1 1 2 小分子无机物填充 目前，壳聚糖羟基磷灰石( h a c s ) 复合材料在骨组织工程中的应用较多， 前景广阔。壳聚糖的可修饰性良好，其能促进细胞黏附、润湿和包裹材料，能形 成含大量游离氨基的阳离子表面，通过静电作用而黏附。磷酸三钙或羟基磷灰石 等无机材料与壳聚糖复合后，能提高支架材料的韧性、强度及生物相容性【1 4 1 。 m u k h e r j e e 掣1 5 1 制备得到含有谷氨酸盐的h a c s 浆糊状骨修复材料，用来 修复兔子颅骨缺损。力学性能测试结果表明，修复的组织具有和正常组织相近的 抗冲击能力，而且组织检验学结果也表明，在骨缺损区发现了矿化的骨针状体， 说明该材料可以应用于骨缺损修复中。相似的效应在兔颌骨【1 6 】和兔桡骨缺损 愈合中也有过报道。但是，壳聚糖使骨细胞增殖的机理有待于进一步确认。海藻 酸钠壳聚糖海藻酸钠作为肝细胞包囊，可以治疗大鼠急性肝功能衰竭【1 引。 物理改性方法与化学改性方法相比，物理法改性后，壳聚糖的化学性能一般 是变化不大。在很大的程度上，得到的壳聚糖复合物的性能与形成该复合物的其 它化合物有关。 中国海洋大学硕士论文 1 2 壳聚糖的化学改性 壳聚糖仅能溶解于酸性溶液介质中，从而大大限制了其应用范围。但壳聚糖 分子链上含有2 位的氨基、6 位的伯羟基和3 位的仲羟基等反应性官能团，能够 对其进行修饰反应，形成各种功能性衍生物。 1 2 1 酰化反应 壳聚糖可与多种有机酸的衍生物( 例如酸酐、酰卤等) 发生反应，引入不同 的脂肪族或芳香族酰基【1 9 1 。 + o 壳聚糖分子链上既含有羟基又含有氨基，因此，酰化反应既可以发生在氨基 上形成酰胺，也可以发生在羟基上形成酯。就壳聚糖本身的官能团而言，c 2 n h 2 的反应活性大于c 6 o h 和c 3 o h 的反应活性。但是，酰化反应首先在哪个官能 团发生，还与酰化试剂的结构、反应温度、反应溶剂、催化剂等因素有关。要想 得到o 酰化的壳聚糖，可以先将壳聚糖的氨基保护起来，然后进行酰化，反应 结束后再脱掉保护基【2 0 1 。 1 2 2 酯化反应 壳聚糖分子链上的羟基，能够被各种酸和酸的衍生物酯化【2 l 】。酯化产物有无 机酸酯和有机酸酯两种，前者包括硫酸酯、硝酸酯、磷酸酯、黄原酸酯等等，后 者包括苯甲酸酯、乙酸酯、长链脂肪酸酯等等。 常见的酯化反应有硫酸酯化和磷酸酯化两种，硫酸酯化的试剂主要有浓硫 酸和发烟硫酸、氯磺酸、三氧化硫、二氧化硫和氧气等。邬建敏等【2 3 1 对哌啶n 磺酸作为壳聚糖硫酸酯化试剂的酯化能力，以及各种反应条件对酯化程度的影响 进行了初步的研究。结果表明，反应温度8 0 ，壳聚糖与哌啶- n 磺酸的质量比 1 ：4 时，产物有较高的硫酸酯化程度。 硫酸化壳聚糖具有与肝素类似的结构和强聚阴离子性质，因此，在抗栓、抗 凝、抗病毒和抗肿瘤等诸多生物活性方面的研究引起众多学者的关注，赵峡 2 4 1 等在特定位置进行保护或限制反应活性的情况下，选择性地制备出了各种不同取 代位置( c 6 o 位、c 3 o 位、c 2 - n 位、c 2 - n - - - c 3 o 位、c 2 d 卜t 6 o 位、c 2 - n 一 4 新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究 c 3 6 0 位) 的壳聚糖硫酸酯衍生物。 磷酸酯化反应一般是在甲磺酸中与壳聚糖反应【2 5 1 。 盛家荣等2 6 1 将壳聚糖与五氧化二磷、甲磺酸反应，合成了不同取代度的壳聚 糖磷酸酯，再与碳酸钾反应制得得到壳聚糖磷酸钾，并试验其对种子萌发的作用。 实验结果表明，壳聚糖磷酸酯钾对受体种子发芽的促进作用主要与取代度有关。 1 2 3 醚化反应 壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如苄基醚、甲基醚、乙基醚、羟 甲基醚、羟乙基醚等。壳聚糖的氨基若不加以保护，在醚化反应中首先发生的是 n 烷基化。在碱性条件下，壳聚糖与氯乙酸反应生成羧甲基壳聚糖2 7 1 ，用环氧 乙烷田】或环氧丙烷【2 9 】得到羟乙基壳聚糖或羟丙基壳聚糖。 壳聚糖经醚化后，可以制得水溶性较好且又具有良好吸湿性、保湿性的衍生 物，这些衍生物在日用化学、医药、烟草工业、造纸工业等方面有着十分广阔的 用途 3 0 】。 1 2 4n 烷基化反应 壳聚糖的氨基是一级氨基，有一孤对电子，因此，其具有很强的亲核性能， n 烷基化反应是除n 酰化反应以外的另一类重要反应。 壳聚糖与卤代烃反应，首先发生的是n 烷基化。王爱勤等【3 1 1 用卤代烷与壳 聚糖反应，制备了不同长度烷基取代基的壳聚糖衍生物。其中，c 2 、c 4 和c 8 烷 基取代衍生物具有良好的水溶性，抗凝血性能随烷基取代基的增长而得以改善。 羔 l i i l 0 詈 中上 中国海洋大学硕士论文 壳聚糖与环氧衍生物的亲核开环加成反应，得到n 烷基化衍生物，如环氧丙醇 与壳聚糖生成的n 烷基化衍生物能溶于水【3 2 1 。 1 2 5 席夫碱化反应 壳聚糖在中性介质中很容易与脂肪醛、芳香醛( 酮) 反应生成席夫碱。一方 面，特殊醛形成的席夫碱，经硼氢化钠还原后，可得到一些很有用的n 衍生物； 另一方面，席夫碱可用于氨基的保护，在羟基上进行各种反应，反应结束后即可 方便地脱掉保护基。例如采用丙酮酸改性壳聚糖，可以得到具有良好溶解性与抗 菌性的丙酮酸壳聚糖席夫碱，对果蔬具有良好的保鲜效果【3 3 1 。将丙酮酸壳聚糖席 夫碱用硼氢化钠溶液还原，得到高取代度、易溶于水的丙酮酸改性壳聚糖【3 4 】。 1 2 6 季铵化反应 卜c h 3 c o c o o _ h 壳聚糖季铵盐的合成有两种方法，一种将其分子链上的氨基直接进行季铵 化，即将季铵盐基团直接连接在c 2 上。如壳聚糖与碘甲烷反应生成碘化n 三甲 基壳聚糖季铵盐，d o u g l a sd eb r i t t o 等【3 5 】用二甲基硫酸盐作为甲基化试剂，合成 n 三甲基壳聚糖；另一种是把一个低分子的季铵盐接到氨基上，例如，把缩水甘 油三甲基氯化铵与壳聚糖反应，可得到壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵，具有较好的 絮凝性能和吸湿保湿性制珀】。 卜赢蚴c r o h 1 2 7 交联和接枝共聚反应 壳聚糖可通过双官能团的醛或酸酐等进行交联反应，得到网状结构的不溶产 6 新型壳聚糖衍生物的制备及其抗茵活性研究 物，党明岩【3 7 1 和夏彩芬分别对交联壳聚糖的制备合成方法、化学改性以及应 。 用研究进展等方面作了详细综述。 壳聚糖与纤维素结构相似，也能进行接枝共聚反应改善其性能。乙烯基单体 在壳聚糖上进行接枝聚合，得到新型的特种合成多糖聚合物，使这些天然聚合物 与合成聚合物的某些性质相结合，以满足特殊的需要1 3 9 1 。h a m i tc a n e r 等删将聚 ( n 乙烯基咪唑) 接枝到壳聚糖上，研究了壳聚糖分子量、n 乙烯基咪唑单体、 温度和反应时间等对接枝率的影响。结果表明，通氮气的条件下，1 0 ( 、洲) 壳聚糖溶液和o 2mn 乙烯基咪唑在7 0 反应3h 得到的产物取代度最大为 1 4 0 ，并对其进行了结构表征。 1 2 8 其他反应 壳聚糖能够被氧化剂氧化，氧化反应机理复杂。若氧化剂不同，反应的p h 不同，得到的氧化产物也不同。c 3 o h 能被氧化成羰基；c 6 o h 能被氧化成醛基 或羧基。例如，在壳聚糖的高氯酸盐悬浮液中，c r 0 3 作为氧化剂，可以将c 6 o h 氧化为羧基【3 2 1 。壳聚糖无毒、无副作用，是一类新的天然高分子螯合剂，可以与 金属离子进行螯合，具有更广泛的应用价值和应用领域。 1 3 壳聚糖的抗菌机理简述 早在1 9 7 9 年，a l l a n 等人就报道了壳聚糖具有抗菌效果，并发现壳聚糖对于 各种细菌以及真菌都具有抗菌活性。壳聚糖的抗菌活性主要决定于它的相对分子 质量和脱乙酰度。 。 相对分子质量对壳聚糖的抗菌性能有较大的影响。吴刚等【4 1 】发现对革兰氏阳 性茵金黄色葡萄球菌来说，相对分子质量越小其抗菌率越大；而对于革兰氏阴性 菌大肠杆菌和沙门氏菌来说，抗菌率随着相对分子质量的降低先增大后降低。郑 连英【4 2 】等研究发现，相对分子质量在3 0 万以下时，壳聚糖对金黄色葡萄球菌的 抗菌作用随相对分子质量的减少而减弱，对大肠杆菌的抗菌作用随相对分子质量 的减少而增强。 壳聚糖的抗菌作用随着其脱乙酰度的增大而增强。壳聚糖的脱乙酰化过程， 实际上是其分子链上- n h c o c h 3 逐渐被- 2 取代的过程。酸性条件下，二n h 2 易 与旷结合形成- n h 3 + 正电离子，随着脱乙酰度的增大，壳聚糖分子链上的正电 荷- n h 3 + 也增多，对于细菌的静电引力逐渐增强，更多的细菌被絮凝、聚沉。因 此，细菌的生长繁殖也随之减弱【4 3 1 。 7 中国海洋大学硕士论文 抗菌作用机制可以归纳为以下5 种类型：抑制核酸的合成；抑制蛋白质 的合成；改变细胞膜的通透性；干扰细胞壁的合成；作用于能量代谢系统 和作为抗代谢物【删。 壳聚糖是一种弱碱性聚电解质，通常在酸性条件下才具有抗菌作用；在中性 条件下，几乎没有抗菌性；在p h 值为6 5 时，抗菌作用效果最好。杨冬芝等【4 3 】 发现在酸性条件下，壳聚糖分子中的质子化铵- n h 3 + 具有正电性，能够吸附带有 负电荷的细菌，使其细胞壁和细胞膜上的负电荷分布不均j 干扰了细胞壁的合成， 打破了自然状态下细胞壁合成与溶解的平衡。因此，细胞壁趋向于溶解，细胞膜 不能承受渗透压而破裂，而细胞内的细胞器、细胞质等物质渗出，导致细菌死亡。 壳聚糖的抗菌机制也因菌种的不同而有所不同。对于革兰氏阴性菌，主要是 小分子壳聚糖渗透进入到微生物细胞内，吸附胞内带负电荷的细胞质，引起了絮 凝，扰乱了细胞正常的生理活动，从而影响到细菌生长发育，甚至杀灭细菌；而 对于革兰氏阳性菌，主要是大分子壳聚糖吸附在微生物细胞的表面，可形成一层 高分子膜，阻止物质通过细胞膜进行内外运输，导致细菌死亡【4 5 】。 目前，国内外学者对壳聚糖及其衍生物的抑菌机理研究，尚停留在推测阶段， 没有得出明确的结论。 1 4 壳聚糖衍生物的抗菌活性 针对壳聚糖具有抗菌作用这一重要的特性，人们进行了广泛的研究应用。研 究结果也被广泛地应用到食品和以及纺织等许多领域。但是，由于壳聚糖分子中 的一些氢键作用，使其很难溶于一般的有机溶剂和水中，只能溶解于酸性溶剂中 来显示其抗菌活性。因此，一定程度上限制了它的应用范围f 4 l 】。目前，通过化学 改性( 如酰化、磺化、烷基化、酯化、醚化、羧烷基化、季铵化、席夫碱化等) 发现，壳聚糖衍生物的水溶性范围和抗菌活性均优于壳聚糖。 1 4 1 酰化反应衍生物 尼泊金酯( x , j - 羟基苯甲酸酯) 是一类高效、广谱、低毒的杀菌防腐剂，它的 抗菌作用比苯甲酸和山梨酸及其盐类强。随着尼泊金酯类中r 烷基碳链长度的 增加，其抗菌作用增加、对水溶解度减少且酯溶性增大。 对羟基苯甲酸壳聚糖酯抗菌实验结果发现【删，它对金黄色葡萄球菌和大肠杆 菌的m i c ( 最低抑菌浓度) 值分别达到了0 0 1 和0 0 2 5 ，且对酵母菌和霉 菌都具有很强的抑菌效果。对羟基苯甲酸壳聚糖酯在更大的p h 值( p h - 4 1 0 ) 8 新型壳聚糖衍生物的制备及其抗菌活性研究 范围内呈现出强烈的抑菌活性，比壳聚糖的应用范围更宽。在酸性环境下，对羟 基苯甲酸壳聚糖酯对细菌的抑菌活性优于碱性环境中，且其热稳定性良好。在苹 果汁和肉汁的食品体系中，对羟基苯甲酸壳聚糖酯仍表现出强烈的抑菌活性【4 7 1 。 n 酰化壳聚糖的抗菌实验表明，n 己酰化壳聚糖的抗菌性优于n 乙酰化壳 聚糖和n 丙酰化壳聚糖；低脱乙酰度的n 酰化壳聚糖对生长期细菌的抑制