（土壤学专业论文）紫色土硅酸盐细菌遗传多样性及系统发育研究.pdf

四川农业大学硕：i 二学位论文 摘要 以从四川和重庆的紫色土中分离获得的3 8 株硅酸盐细菌为研究材料，采用 r a p d 、b o x p c r 、1 6 sr r n ap c r - r f l p 、代表菌株1 6 sr r n a 序列分析等方法 研究其遗传多样性，确定了其系统发育及分类地位。 r a p d 分析包括了单引物r a p d ，t p p c r 。单引物r a p d 在2 6 相似性水 平上将供试菌株分5 群，其中，群i 、i 和v 均由4 株菌组成，群i i 包括8 个 菌株，来源地比较杂，群i v 最大，由1 8 株硅酸盐细菌和2 株参比菌株曰 m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 19 和b m u c i l a g i n o s u s a s1 2 3 2 组成，占供试紫色土硅酸 细菌的4 7 3 。t p p c r 分群结果与单引物r a p d 相似，在2 3 相似性水平上 将供试菌株分为5 个群，群i 和v 由5 株菌组成；群i i 有8 株菌：群1 1 1 只有2 株菌，群则由1 8 株菌组成，该群菌株与标准菌株b m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 1 9 1 和且m u c i l a g i n o s u sa s l 2 3 2 聚在一起。这表明紫色土硅酸盐细菌存在有较丰富 的遗传多样性。综合分析结果与r a p d 和t p p c r 的聚类结果相似，有1 7 株菌 和标准菌株b m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 1 9 。和a s l 2 3 2 同处在群i 。 b o x p c r 分析中，所有供试菌株在5 4 的相似性水平上供试菌株与参比菌 株分为了4 个群，3 2 株菌株都聚入了群i i 和群i i i ，供试菌株中大部分还是和参 比菌株亲缘较近。在b o x p c r 分析中，k 4 单独聚类，表现出比较大的特异性。 所有供试菌株的1 6 sr r n a p c r r f l p 图谱有2 1 种遗传型。在6 2 相似性水 平处，所有菌株被分为3 个1 6 sr r n a 遗传群，群i 的2 4 株供试菌株与2 株参 比菌株且m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 1 9 1 和a s i 2 3 2 聚在一起，包括1 2 种遗传类型 谱；群i i 由1 0 株供试菌株组成，群i i i 包括3 株菌，这两个群的菌株与b m u c i l a g i n o s u s 亲缘关系较远。 进而，对菌株k 1 8 、k 2 8 、k 3 8 进行了1 6 sr d n a 序列测定，供试菌株k 1 8 与b n o v a l i s 模式菌株l m g 2 1 8 3 7 同源性达到9 9 5 ；k 2 8 与b a c i l l u s m u c u l a g i n o s u s 模式菌株v k p m 7 5 1 9 1 的同源性高达9 9 6 ；而k 3 8 则与蜡质芽孢 杆菌( 口c e r e u s ) 的菌株a t c c l 4 5 7 9 同源性高达9 9 9 。初次发现硅酸盐细菌 在蜡质芽孢杆菌( 口c e r e u s ) 和b n o v a l 括中有分斫j 。 关键词：硅酸盐细菌遗传多样性系统发育 州川农业人学坝i ：学位论文 a b s t r a c t t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f3 8s i l i c a t eb a c t e r i u ms t r a i n si s o l a t e df r o mp u r p l es o i l s i ns i c h u a na n d c h o n g q i n gp r o v i n c e s ，t o g e t h e rw i t ht w or e f e r e n c es t r a i n s ，w e r ea n a l y z e db yr a p d ，b o x - p c r ， 1 6 sr r n ap c r - r f l p , a n dt h ep h y l o g e n yo ft h es i l i c a t eb a c t e r i aw e r ed e t e r m i n e db y1 6 sr r n a s e q u e n c e s t h er e s u l t so fr a p da n a l y s i s ，i n c l u d e ds i n g l ep r i m e rr a p da n dt p - p c r ，i n d i c a t e dt h a ta l lt h e s t r a i n sw e r ed i v i d e di n t o5g r o u p sa tt h es i m i l a r i t yo f 2 6 t h e r ew e r e4s t r a i n si ng r o u pi ，i i ia n d v ，a n d8s t r a i n si ng r o u pi i o f a l lt h ec l u s t e r s ，c l u s t e ri vw a st h eb i g g e s to n e ，w h i c hc o n t a i n e d1 8 s i l i c a t eb a c t e r i af r o mp u r p l es o i la n d2r e f e r e n c es t r a i n s 佃m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 1 9 a n d a s i 2 3 2 ) t h er e s u l to f1 1 p p c ra n a l y s i sw a sf a m i l i a rw i t ht h a to fs i n g l ep r i m e rr a p d 。a n d5 g r o u p sw e r ef o r m e da tt h es i m i l a r i t yo f 2 3 t h e r ew e r e5s t r a i n si ng r o u pi ，8s t r a i n si ng r o u pi i ， 2s t r a i n si ng r o u pi i ia n d5s t r a i n si ng r o u pv i ng r o u pi v , t h e r ew e r ea l s o1 8s t r a i n sw h i c hw e r e g r o u p e dw i t hb m u c i l a g i n o s u sv k p m 7 5 1 9 1a n db m u c i l a g i n o s u sa s i 2 3 2 w h i c hs h o w e dt h a t s i l i c a t eb a c t e r i af r o mp u r p l es o i lw e r ev e r yd i v e r s e i nt h ec o m b i n e da n a l y s i so f t h es i n g l ep r i m e r r a p da n dt p - p c r ，t h er e s u l t sw e r es i m i l a rt ot h a to fs i n g l ep r i m e rr a p da n dt p - p c r ，a n d t h e r ew e r e1 7s t r a i n sg r o u p e dw i t h 厦m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 1 9 1a n d a s l 2 3 2i ng r o u pi o nt h eb a s i so fb o x p c ra n a l y s i s ，a l ls t r a i n sw e r ed i v i d e di n t o4g e n e t i cg r o u p sa tt h es i m i l a r i t y o f5 4 ，a n d3 2s t r a i n sg r o u p e di n t og r o u pi ia n di i i ，a n dm o s ts t r a i n sw e r er e l a t i v et ot h e r e f e r e n c es t r a i n s i n1 6 sr r n ap c r r f l pa n a l y s i s ，t h e r ew e r e21r f l pg e n o t y p e se x i s t e d a tt h el e v e lo f6 2 s i m i l a r i t y , a l ls t r a i n sw e r ed i v i d e di n t ot h r e e1 6 sr r n ag r o u p s ，a n dt h e r ew e r e2 4s t r a i n si ng r o u p i ，w h i c hw a ss i m i l a rt or e f e r e n c es t a i n sb m u c i l a g i n o s u sv k p m7 5 1 9 7a n da s i 2 3 2 t h e r ew e r e 1 0a n d3s t r a i n sf a l li n t og r o u pi ia n dg r o u p1 1 1 ，r e s p e c t i v e ly a n dt h e yw e r ed i s t i n g u i s h e df r o mb m u c i l a g i n o s u s t h e n ，1 6 sr d n ap a r t i a ls e q u e n c eo fs t r a i nk 1 8 ，a n d1 6 sr d n af u l ls e q u e n c eo fk 2 8a n dk 3 8 叫川农业人学颂+ i ：学位论文 w e r e d e t e r m i n e d t h eh o m o l o g y o f t h e l 6 sr d n a p a r ts e q u e n c e sb e t w e e n b n o v a l i sl m g 2 1 8 3 7 1 a n dk 1 8w a s9 9 6 a n dt h ef u l ls e q u e n c e sb e t w e e nb a c i l l u sm u c u l a g i n o s u sv k p m 7 5 1 9 7a n d k 2 8w a s9 9 6 。a n db e t w e e nbc e r e u sa t c c l 4 5 7 9 7a n dk 3 8w a s9 9 9 t h i sw a st h ef i r s tr e p o r t t h a ts i l i c a t eb a c t e r i af r o mp u r p l es o i ld i s t r i b u t e di nb a c i l l u sc e r e u sa n db a c i l l u sb o v a l 括 k e yw o r d s ：s i l i c a t eb a c t e r i a ，g e n e t i cd i v e r s i t y , p h y l o g e n y 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：宙日碑 a 彳年6 月日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：五r 辫 钏签名：伤膨 k 6 年6 月 闩 2 。彳年6 月 1 文献综述 1 1 引言 钾素是植物生长必不可少的营养元素之一，土壤中的钾包括可被植物吸收利用 的有效钾和不能被利用的矿物钾。在我国，在氮磷出现盈余时，钾素亏缺仍是一个 普遍的现象。中国的钾肥生产量只占世界的0 3 4 ，而消耗量占1 4 7 ，2 0 0 0 年中 国农作物所需要吸收的钾肥养分量( 有效成分) 是1 4 0 0 7 万t ，除去有机肥、化肥 和土壤自身提供的有效钾外，钾素亏缺1 6 5 5 万t ，可见我国钾的资源短缺，主要依 赖进口( 谢建昌，2 0 0 3 ) 。随着我国农业生产中有机肥用量减少，化肥用量不断增加， 氮多、磷少、而钾严重不足；复种指数提高；高产耗钏品种推广；耕作制度改革等 己导致我国钾肥供需矛盾日益尖锐，由于长期缺钾导致土壤供钾能力下降，已成为 限制我国农业生产持续稳定发展的主要因素之一( 陈建生等，1 9 9 9 ) ；故以多种形式 补充土壤中的钾素，科学合理施用钾肥已成为农业生产中的主要技术措施之一。 通过土壤中微生物的作用来释放土壤中的矿物钾，是解决这一问题的一种方法。 硅酸盐细菌( s i l i c a t eb a c t e r i u m ) 是土壤中一类革兰氏阴性细菌，它能破坏矿物的品 格结构，释放出固定的钾离子供植物吸收利用( 李元芳，1 9 9 4 ) 。研究硅酸盐细菌，有 利于实现农业、环境和生态可持续利用与发展。 研究硅酸盐细菌的生物多样性，有利于发掘新的硅酸盐细菌资源，丰富和充实 我国的硅酸盐细菌资源库，获得新的硅酸盐细菌基因资源：同时又可进一步研究硅 酸盐细菌的系统发育，揭示硅酸盐细菌遗传进化的本质，同时还可以为农业生产选 育高效解钾菌株。近年来，对硅酸盐细菌的不断发掘研究和现代分子生物学技术的 发展运用，对硅酸盐细菌分类研究有了很大的进展，目前，硅酸盐细菌主要属于芽 孢杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) 、胶质芽孢杆菌( 口m u c i l a g i n o s u s ) 和土壤芽孢杆菌( 且 e d a p h i c u s ) 三个种( 李风汀等，1 9 9 7 ) 。硅酸盐细菌分类系统建立的基础是系统发育。 通过对硅酸盐细菌系统发育的研究，可以揭示硅酸盐细菌及其相关细菌的亲缘关系 和自身的进化过程，从而为确立硅酸盐细菌的分类地位提供科学依据。 1 2 硅酸盐细菌多样性研究进展 1 2 1 生物多样性的概念 生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指生物物种的多样化及其变异的深度及广度，是物种 多样性、遗传多样性和生念多样性三个层次的综合表述。当今的生物多样性是地球 4 6 亿年生物进化的结果，是人类社会赖以尘存和发展的物质基础。微生物是地球上 出现最早的生物，已有4 6 亿年的生命历史( s t a l e ye a l2 0 0 2 ) ，其生物量达到了地 球上总生物量的5 0 左右( w h i t m a ne la 1 1 9 9 8 ) 。正是微生物多样性的存在才使地 球上的其他物种得以生存；尽管微生物个体微小，微生物漫长的进化历史正是微生 物多样性的驱动力( w o e s ee la 1 1 9 9 8 ) ，因此微生物是自然界生物多样性不可缺少 的组分。 与宏观生物所不同的是，绝大多数原核生物的多样性在形态和分化上表现并不 突出，而主要表现在物种和基因水平上( 东秀珠，洪俊华1 9 9 9 ) 。遗传多样性是生 物多样性的重要组成部分，一般在谈及生态系统多样性和物种多样性时已经涉及到 了遗传多样性，因为物种是构成生物群落进而组成生态系统的基本单元，任何物种 都具有独特的基因库和遗传组成，物种多样性已经包含了遗传多样性，故遗传多样 性是生态系统多样性和物种多样性的基础( 施立明等，1 9 9 3 ：葛颂等，1 9 9 4 ) 。由 于自然选择的作用，所有在分子水平上发生的遗传变异累积并随机整合到基因组中， 从而形成了丰富的遗传多样性。这些遗传信息储存在生物个体的基因之中。任何一 个物种或一个生物个体都保存着大量的遗传基因，可被看作是一个基因库( g e n e p 0 0 1 ) 。一个物种所包含的基因越丰富，它对环境的适应能力越强。基因的多样性是 生命进化和物种分化的基础。狭义的遗传多样性主要是指生物种内基因的变化，包 括种内显著不同的种群之间以及同一种群内的遗传变异( 世界资源研究所，1 9 9 2 ) 。 此外，遗传多样性体现在不同水平上：群体( p o p u l a t i o n ) 水平、个体水平、组织与 细胞水平和分子水平。 遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异性的高低。同时，由于个体生命的 有限性决定了有其特定分布格局的群体才是进化的基本单位，因而，遗传多样性主 要表现在遗传变异分布格局和定居群的遗传结构。群体遗传结构上的差异是遗传多 样性的一种重要表现，群体遗传的变异程度和丰富度决定一个物种的进化潜力和抵 御不良环境的能力。种群的遗传多样性既是长期进化的产物，也是其适应和进化的 前提。因此开展遗传多样性的研究不但可以揭示种群的进化历史、起源的时间和方 式，也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料( 夏铭，1 9 9 9 ) 。 生物多样性是人类赖以生存的物质基础，其价值可以从下列两个方面得以了解。 第一，直接价值，从生物多样性的野生和驯化的组分中，人类得到了所需的全部食 品、许多药物和工业原料，同时，它在娱乐和旅游业中也起着重要的作用；第二， 间接价值，间接价值主要与生态系统的功能有关，通常它并不表现在国家核算体制 上，但如果计算出来，它的价值大大超过其消费和生产性的直接价值。生物多样性 的间接价值主要表现在固定太阳能、调节水文学过程、防止水土流失、调节气候、 吸收和分解污染物、贮存营养元素并促进养分循环和维持进化过程等7 个方面。随 着时间的推移，生物多样性的最大价值可能在于为人类提供适应当地和全球变化的 机会。生物多样性的未知潜力为人类的生存与发展显示了不可估量的美好前景( 马克 平等，1 9 9 8 ；陈灵芝等，1 9 9 3 ) 。 近百年来，由于人类活动的加剧，历经数百万年演化而来的生物群落正在受到 破坏。由于生境丧失和片段化、外来种的侵入、生物资源的过度开发、环境污染、 全球气候变化和工业化的农业及林业等引起一些微生物宿主的灭绝也间接地导致了 某些种群的消失和演替。已知有8 的真菌种群处于濒危状态，一些处于特殊生境的真 菌种已被其他物种取代。物种的遗传多样性已经降低，生物多样性所受到的威胁空 前( 陈灵芝，1 9 9 3 ) 。中国是生物多样性特别丰富的国家之一。据统计，中国的生物 多样性居世界第八位，北半球第一位。同时，中国又是生物多样性受到最严重威胁 的国家之一。所以对生物多样性的保护迫在眉睫。 硅酸盐细菌在长期进化过程中，由于受环境等的作用，形成了丰富的生物多样 性特征，通常以表型( p h e n o t y p e ) 和遗传型( g e n o t y p e ) 的多样性来表述。c o l w e l l ( 1 9 7 0 ) 等首次提出了多相分类的概念，从表型、遗传型和系统发育方面综合获取信息，多 种方法相互印证、互为补充，从而较全面地反映硅酸盐细菌的生物多样性特征。因 此多相分类技术被认为是现代细菌分类的重要里程碑之一，也是硅酸盐细菌多样性 研究工作中常常采用的技术手段。 1 2 2 微生物生物多样性研究方法 1 2 2 1 表型多样性研究方法 生理生化特征细菌的传统表型多样性研究主要以形态特征和生理生化特征为依据。 主要研究指标是以形态和结构的特征作为初步特征并广泛结合生理生化特征和其它 非形态特征，如细胞的化学组分、生态条件、血清学反应等著称的综合体。采用的 形态结构和生理生化特征指标一般主要为： ( 1 ) 个体形态和培养特征个体形态特征包括供试菌的大小、形状和排列。它 一般用于宏观分类上。细菌细胞的结构也可以作为细菌分类的依据，如鞭毛的位置 和数目、芽孢的存在及其在细胞内的位置、芽孢的数目、形状、大小、颜色及表面 特征等，都是重要的分类依据。培养特征指的是微生物在培养基上生长所表现的群 体形态和生长状况。对硅酸盐细菌的研究表明，硅酸盐细菌菌体均为杆状，均产生 椭圆至圆形芽胞。培养在硅酸盐琼脂上的硅酸盐细菌是两端钝圆、体积很大的杆菌， 具大粘液状荚膜。在硅酸盐琼脂上芽孢出现得很少，但在淀粉琼脂上培养，第二天 就开始大量形成芽孢，且菌落形态办发生变化，菌落中央部分变混浊，且混浊部分 粘液的稠密度也发生变化，失去了特有的弹性和坚固性，芽孢形成时，杆菌的中央 部分变粗，芽孢椭圆形。在不含氮的硅酸盐琼脂上，硅酸盐细菌形成粘液状凸起的 透明的菌落( 林启美等，2 0 0 2 ；王宇平等，2 0 0 1 ；殷永娴，1 9 9 5 ；李明，2 0 0 2 ；孙德 四，2 0 0 5 ) 。陈廷伟、陈华癸( 1 9 6 0 ，1 9 6 2 ) 进行了形态学研究，结果显示，我国各地 ( 北京、陕西、河北、湖北等) 分离所得硅酸盐细菌在形态上差异不大，皆为大荚膜 杆菌。菌体长杆状，大小为4 - - - 7 # mx l 1 2 # m ( 李元芳，1 9 9 4 ；杜秉海，1 9 9 5 ) ，荚 膜很厚，椭圆形，g + 。该菌在含氮的查贝克琼脂和无氮的阿须贝琼脂上的菌落形态 是光亮的，圆形、凸起，无色半透明( 如同半颗玻璃珠一样) 。在无氮培养基上菌落更 为浓稠而有弹性，在无氮的液体培养基上形成粘稠的菌液，不产生英膜。荚膜的发 生、大小和层次与培养基中营养成分密切相关，营养元素丰富时，该菌不形成明显 的大荚膜，而只有一层薄的粘液层，或是形成菌胶团：而当缺乏营养元素时，特别 是缺乏氮素或可溶性磷时，该菌易形成肥厚的荚膜；在营养元素缺乏而培养时间较 长时，该菌的荚膜不仅厚而且层次亦增多，指出肥大荚膜是鉴别该菌的主要形态特 征。同时发现菌龄较长( 1 个月以上) 的培养体中菌体的畸形变化，在荚膜内的杆菌 伸长，逐渐弯曲成弧形、c 形、甚至s 形的畸形菌。 ( 2 ) 碳、氮源利用通常可以将能否利用多种化合态、氮源作为微生物分类鉴 定的依据，亦包括在糖代谢中产酸或产气等。硅酸盐细菌均能在蔗糖、葡萄糖、麦 芽糖、甘露醇为c 源的培养基上生长；n h 4 + 、n 0 3 为良好n 源，且能在无n 培养 基上生长，有的菌株在利用碳源时还能产酸( 贺积强等，2 0 0 3 ；王平宇等，2 0 0 1 ) 。 ( 3 ) 生长因子最适温度和生长温度范围是鉴定细菌的重要特征，其他生长因 子如好气性、p h 值、耐盐性和抗药性等也可作为分类和鉴定的依据。硅酸盐细菌为 好氧菌，p h 值在7 0 左右菌株生长较好，过氧化氢酶、卵磷脂酶、淀粉水解反应阳 性，v p 反应阴性，接触酶反应阳性，丙酸盐利用阴性，硝酸盐还原阳性，不能生长 在5 的n a c i 溶液中，同时，p h 等对硅酸盐细菌释钾作用也有影响，在p h6 5 8 0 4 范围内，硅酸盐细菌的释钾效能高。( 陈育如等，2 0 0 1 ；林启美等，2 0 0 2 ；王平宇等， 2 0 0 1 ：盛下放等，2 0 0 2 ；李扬等，2 0 0 6 ) ( 4 ) 血清学反应用于细菌分类学的血清学反应大都根据细菌菌体( o 抗原) 、 荚膜或鞭毛( h 抗原) 制成抗血清，并视其是否发生特异性的血清学反应来确定供 试菌与标准参比菌株的亲缘关系及其分类地位。 其它表型特征还包括细胞与细胞壁的化学组成、营养类型、脂肪酸和同工酶组 成等。 数值分类法数值分类法是在植物学家a d a n s o n 于17 5 7 年首先提出的“等权原则”基 础上，由s n e a t h ( s n e a t ha n ds o k a l ，1 9 7 3 ；s n e a t h ，1 9 8 4 ) 重新提出、完善和发展起来 的分类方法。所谓数值分类法，是指在各个分类单元的各个性状以地位相等的前提 下，用计算机和整理统计方法来分析比较供试性状并依既定程序进行聚类分析，处 理细菌的各种特征，求出相似值，以其相似值的大小决定供试菌在分类学中的关系， 并把它们分为各个类群。因而可以对众多菌株进行大量表型数据的比较分析，其优 点在于借助计算机分析，避免了人为分析的主观性，结果较为公正；同时，由于对 各种性状进行量化处理，聚类分析结果以相似性百分比表述，并以相似性8 0 作为 种群划分的标准；分析得出的树状图( d e n d r o g r a m ) 则揭示了同一表观群( p h e n o n ) l 为菌 株的表型一致性，及存在于不同表观群菌株间表型性状的差异性。因此，数值分类 法是现代细菌分类的基本技术之一，广泛用于细菌的表型多样性研究。 在数值分类中，菌株是分类系统的基本单位或称作操作单元o u t ( o p e r a t i o n a l t a x o n o m y u n i t ) 。在收集足够样本数量的基础上测定其分类特征，然后进行特征编码， 使数据符号化后输入计算机。根据相似性公式，用计算机运算出o u t 之间的相似值。 再把相似性很亲密的o u t 在不同的相似性水平上聚类分群。数值分类可以揭示同一 表观群( p h e n o n ) 菌株的表型一致性，以及不同表观群之间性状的差异。它以分析 大量分类特征为基础。对类群的划分客观稳定，有利于对供试菌类群的群面考察和 观察，从而为进一步的分类鉴定积累大量信息。 数值分类法也被应用在硅酸靛细菌多样性和分类研究中。目前，对硅酸盐细菌 的研究见著科学文献的还主要集中在对单个菌株的生理生化研究方面，对多个菌株 进行表型和遗传多样性的分析还比较少，贺积强( 2 0 0 3 ) 曾用这种方法对紫色土硅酸盐 细菌的表型特性进行过研究。而在根瘤菌研究中数值分类法常被用于初步分群。自 从g r a h a m ( 1 9 6 4 ) 首次将数值分类应用于根瘤菌分类研究以来，数值分类法被广泛 应用于根瘤菌的表型多样性研究中，( c h e ne la 1 1 9 8 8 ，1 9 9 1 ，1 9 9 5 ；l i n d s t r o m & l e h t o m a k i1 9 8 8 ；g a oe l 口1 9 9 4 ；l a d h a & s o1 9 9 4 ；n o v i k o v ae la 1 1 9 9 4 ；x ue la 1 1 9 9 5 ； w e ie la l2 0 0 2 ，2 0 0 3 ；t a ne la 1 2 0 0 1 ；y a oe la l 2 0 0 2 ；g a oe ta 1 2 0 0 4 ) 。张小平等人 ( 1 9 9 1 ) 对9 7 株热带豆科木本植物根瘤菌和2 5 株代表菌株的1 1 5 个表型性状进行了聚类 分析，在获得的1 9 个表观群中有1 2 个表观群是由热带木本豆科植物根瘤菌形成的。 该结果充分反映了热带木本豆科植物根瘤菌的表型多样性；刘杰等( 2 0 0 3 ) 对我国 中东部地区紫穗槐、紫荆、紫藤根瘤菌数值分类的结果，供试菌株分成了7 个表观群， 一些根瘤菌具有较强的耐盐( 3 n a c l ) 、耐碱( p i l l l ，o ) 能力，较好地揭示了这些 根瘤菌的表型多样性特征。 数值分类的不足之处在于测试的性状多( 通常为1 0 0 2 0 0 项) ，比较费时费力， 但由于能够定性和定量地反映供试菌生物多样性的程度，并能提供菌株具体的表型 性状鉴定特征，因此，在细菌分类和多样性研究中，数值分类仍被广泛应用。 全细胞可溶蛋白电泳蛋白质在生物物种中作为生命的本质和表现形式，具有丰富的 多样性，并决定着生物种类的性状和功能。因此，蛋白质种类的多态性能明确反映 生物的表型多样性。蛋白质多态性分析依据几十种甚至上百种蛋白质谱带进行分析 从而得到反映菌株差异的大量信息。 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 是分析蛋白质多态性常用的方法，并 广泛地用于细菌的多样性研究和分类鉴定。通过s d s p a g e 电泳，在一定面积的凝 胶上，一定分子量的可溶性蛋白质能很好的分开，经染色后即可见多态性丰富的蛋 白质带谱。在计算机的辅助下，根据对该谱带的分析结果进行供试菌株分型。 s d s p a g e 在根瘤菌的研究中应用的比较多，而硅酸盐细菌中还未有报道。n o e l 和 b i l l ( 1 9 8 0 ) 首次采用s d s p a g e 技术分析了大豆根瘤菌的可溶性全蛋白多态性，发 现不同血清型菌株的蛋白质谱带不一致。为了提高蛋白质分离过程的解析度，现代 蛋白质电泳多数已改用双向( 2 d ) 全蛋白质电泳技术，在计算机的辅助下能提供更 为丰富的信息。全细胞蛋白组分的高度相似性通常可以预测d n a 杂交的范围，但局 限在于它只能区分种或种以下水平的菌株，并且不能提供性状特征的描述。 多位点酶电泳( m e e ) 多位点酶( m u l t i o n l o c u se n z y m e ) 又称为同工酶，不同的生 物类群，同种生物的不同个体以及同一个体的不同组织或生长发育不同阶段都存在 着较为丰富且明显的差异。多位点酶电泳( m u l t i l o c u se n z y m ee l e c t r o p h o r e s i s ，简称 m e e ) 技术将细胞固有的同工酶通过电泳分离，在用酶的特异性底物显色，通过比 较供试酶的电泳迁移率，表现酶谱带型的多念性。自从h u b b y 等( 1 9 6 6 ) 于1 9 6 6 年应用m e e 对果蝇的群体遗传结构进行研究后，此法作为真核生物群体遗传学研究 的标准方法得到推广。s e l a n d e r 等( 1 9 8 6 ) 及国内段广才等( 1 9 9 8 ) 已利用m e e 方 法对多种微生物进行了分类学及群体遗传学研究。宋春花等( 2 0 0 3 ) 采用多位点酶电 泳( m e e ) 法对江西铜鼓县及郑州分离的5 9 株志贺菌散发株进行多位点酶基因分类和 群体遗传学研究。结果表明5 9 株菌共分为4 6 个电泳型( e t s ) ，聚类分析显示4 6 个 e t s 归属于1 0 个克隆系( c l a - - c l j ) 。每个酶基因位点都有一个优势等位基因，提示 在志贺菌进化演变过程中以自然选择为主，不同年代的志贺菌聚在一个亚克隆系内， 推测它们染色体基因是同源的。 全细胞脂肪酸分析脂肪酸主要以脂类和脂多糖的形式分布在细胞膜上，由于其碳 链长度、双键位置和取代基团等的差异而在不同属、种甚至不同的菌株之间表现出 的差异显著。脂肪酸分析目前已成为多相分类中的常规技术之一。此法不仅可以进 行大量菌株的比较分析，而且可以提供菌株的有关描述特征。何琳燕等( 2 0 0 3 ) 对 从南京地区黄棕壤中分离的一株硅酸盐细菌n b t 菌株进行了全细胞脂肪酸分析，结 果表明：n b t 菌株的全细胞脂肪酸种类为硬脂酸c 1 6 小软脂酸c 1 8 ：1 。9 ，和a n t e i s o c 1 5 ， 且c 1 6o c 孙l ( a 9 ) a n t e i s o c 1 5 ，与b m u c i l a g i n o s u s 的脂肪酸含量相似，而c i s ：2f a 9 1 1 ) 的含量也可达1 4 o ，高于b e d a p h i c u s 和b m u c i l a g i n o s u s 的c i s ：2 f a 9 ，的量。 再结合形态结构观察及生理生化实验结果，d n ag + cm 0 1 含量以及d n a - d n a 杂 交和1 6 sr r n a 序列测定，将n b t 菌株归为b e d a p h i c u s 的一个亚种。 1 2 2 2 遗传多样性研究方法 ( 1 ) 随机扩增的多态- 陛d n a 技术( r a p d 技术) 运用随机引物扩增多态性d n a 片段可作为分子标记。这种方法即为r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，随机扩增的多态性d n a ) 。w i l l i a m s 等( 1 9 9 0 ) 用单个人工合成的随机排列的1 0 个碱基作为引物进行各种生物d n a 扩增，用琼脂 糖电泳可以检测到丰富的多态性称为随机扩增多态d n a 。r a p d 原理是：基因组模 板变性解链后，随机引物与模板上的同源序列结合，在低复性温度下( 3 5 3 7 c ) ，如 果引物的结合位点位于两条互补的模板链上，方向相反，长度适合( 2 0 0 5 0 0 0 b p ) ，那 么经过4 0 个循环后就可以合成2 0 0 条新链( t i c h y ，1 9 9 4 ) 。r a p d 所用的系列引物 寡核苷酸序列各不相同，但对于一个特定的引物，在基因组d n a 序列上有其特定的 结合位点。因此如果基因组在这些区域发生d n a 片段的插入，缺失或碱基突变就可 能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使p c r 产物条带增加、减少或发 生分子量的改变。通过对p c r 产物的检测即可测出基因组d n a 在这些区域的多态 性。由于进行r a p d 分析时使用的是一系列引物，虽然对每个引物而言其检测基因 组多态性的区域有限，但是利用一系列引物可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。 因此r a p d 可以对整个基因组d n a 进行多态性检测。另外，r a p d 片段克隆后可作 为r f l p 的分子标记进行作图分析。尽管r a p d 技术诞生的时间很短，但由于其独 特的检测d n a 多态性的方式以及快速、简便的特点，使这个技术已渗透于基因组研 究的各个方面。 虽然r a p d 具有解析度高、信噪比低的特点，但是由于反应条件灵敏，容易出 现假带且结果重复性低。从而降低了信息的可靠性( m a c p h e r s o n ，1 9 9 3 ) 。所以，在 r a p d 分析中，常采用双引物r a p d 法( t w op r i m e r sr a p d s ) ，双引物的引入，使 引物与模板结合的几率增加。同时，引物结合位点的增加，可以提高多态性片段的 数目，扩大可检测的基因组序列的范围，采用较高的复性温度( 4 0 4 c 以上) ，显著降 低假带的产生，使r a p d 重复性大大提高( n e i l a n ，1 9 9 5 ；w o o d b u me t a l ，1 9 9 5 ；h ue t a l , 1 9 9 5 ；焦锋2 0 0 0 ) 。 ( 2 ) 扩增片段长度多态性( a f l p ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是一种检测 d n a 多态性的指纹分析技术。a f l p 的原理是基于对基因组总d n a 双酶切后经p c r 对酶切片段进行选择扩增。具体是基因组d n a 经限制性内切酶双酶切后，形成分子 量大小不等的随机酶切片段，将特定双链接头连接在这些d n a 片段的两端，形成多 个带接头的特异片段作为p c r 扩增的模板。以接头序列及其相连的酶切位点作为特 异片段扩增的引物结合位点。p c r 引物3 末端含有选择核甘酸，选择核甘酸延伸到 酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核甘酸配对的限制性酶切片段被扩 增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。高俊莲等( 1 9 9 9 ) 应用a f l p 技 术对斜茎黄芪根瘤菌遗传多样性进行了分析研究，结果与表型性状数值分析结果一 致。 ( 3 ) r e p p c r 指纹分析 在细菌基因组中，广泛存在着一类如r e p ( r e p e t i v ee x t r a g e n i cp a l i n d r o m i c ，基 因外重复回文因子)( s t e m1 9 8 4 ) 、e r i c ( e n t e r o b a c t e r i a lr e p e t i t i v ei n t e r g e n i c c o n s e n s u s ，肠杆菌基因间重复共有序列) ( s h a r p i e s ，e t a ，1 9 9 0 ；h u l t o n ，e t a l 1 9 9 1 ) 、 b o x ( m a r t i n ，e l a l 1 9 9 2 ) 的短重复序列，他们的分布真实的反映了细菌结构( l o u w s ， e t 口，1 9 9 4 ) ，根据这些短的重复序列的保守性设计出相应的扩增引物。引物长度一 般1 5 2 2 个碱基( v e r s a l o v i c ，e la 1 1 9 9 1 ，1 9 9 4 ) ，可用于同时扩增细菌基因中位于重 复序列之间大小不同的d n a 片段( s c h n e i d e r ，e la l ，1 9 9 6 ) ，扩增片段用琼脂糖凝 胶电泳分离，可产生重复性较好具有种或菌株特异性的d n a 指纹图谱。这些图谱用 适当的软件分析，就可以得到树状图，可以对大量菌株进行多样性研究。l o u w s f j 等 ( 1 9 9 4 ) 采用r e p ，e r j c 和b o x p c r ( 总称r e p p c r ) 对多种植物病原体和假单胞菌 分析了基因组指纹，结果表明，r e p 一，e r i c 和b o x 序列反映了它们的基因组结构， 所以r e p p c r 技术是菌株分类的一种快速简单可重复性的方法，而且可能成为这些重 要植物病原体的诊断工具。 以上介绍的随机扩增的多态性d n a 技术，扩增片段长度多态性，r e p p c r 指纹 分析都是基于基因组水平的指纹图谱技术。 基于特殊基因扩增片段酶切图谱和序列的多态性分析这些特殊基因中研究最多的 是核糖体r n a 基因，即1 6 sr d n a ，2 3 sr d n a ，1 6 s 一2 3 s r d n a 间隔序y 1 ( i n t e r g e n i c s p a c e ri g s ) 分析。不同核糖体r n a 基因的p c r r f l p 分析，在细菌分类中的作用不 同，其中1 6 s r d n ap c r - r f l p 的应用最广泛。 ( 1 ) 1 6 sr d n ap c r - r f l p 技术 1 6 sr d n ap c r r f l p 在遗传多样性研究中被广泛采用。可以快速鉴定细菌，是 一种比较简单的研究遗传多样性和分类的方法( g u r t l e re ta 1 ，1 9 9 1 ；l a g u e r r ee ta 1 ， 1 9 9 4 ) ，如果选择合适的限制性内切酶，可使1 6 sr d n ap c r r f l p 分析结果与序列分 析结果具有很好的一致性( m o y e re ta 1 ，1 9 9 6 ；n i c ke la 1 ，1 9 9 8 ) 。因此1 6 sr d n a p c r - r f l p 分析可以初步反映细菌的系统发育地位。大量研究表明，1 6 sr d n a p c r - r f l f 指纹图谱大多数都具有种的特异性( v a n d a m m eeta l ，1 9 9 6 ) 。目前，1 6 s r d n ap c r r f l p 主要用于种属水平的分类鉴定。 p a c e 等( 1 9 8 6 ) 首次利用r r n a 基因确定环境样品中的微生物，通过对5 sr r n a 基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方法很快被用于微生物多样性研究 领域。由于5 sr r n a 基因相对较小( 约1 2 0 个核苷酸) ，携带信息相对较少，因而 揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下，随后开展的1 6 sr r n a 基因序列( 约 1 5 0 0 个核苷酸) 分析为微生物多样性研究提供了更多信息，且效率更高。 已知细菌的1 6 sr r n a 序列高度保守，它与2 3 s 和5 sr r n a 基因同处于一个r r n 操纵子之中，其排列顺序为5 - 1 6 s 2 3 s 一5 s 一3 。由于1 6 sr r n a 序列变异速度异常缓 慢，其核苷酸序列是分析细菌系统发育关系的“分子钟”。因此1 6 sr r n a r f l p 常用 于细菌的系统发育研究。 目前，1 6 sr r n a 基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究( h e u e r e t a l 1 9 9 7 ) 。1 6 sr r n a 基因序列分析是主要基于已建立的微生物1 6 sr r n a 基因序列数据 库，用以确定细菌的系统发育关系。并使序列探针用于识别未知菌成为可能。 不少学者利用1 6 sr r n a 基因序列分析技术研究了多种环境的微生物多样性， 并得到了一些有意义的结果。如g l o