（病理学与病理生理学专业论文）胰岛素抵抗大鼠存活时间与klotho表达关系的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：兰垃壮 e t期： w fo 歹z 彳 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：墓盔玉尹一导师签名： 目录 中文摘要1 英文摘要4 符号说明8 前言9丑看 材料与方法1 1 结果2 3 讨论2 5 结论3 0 附录3 1 参考文献4 0 综j 苤4 7 致 谢5 6 攻读硕士期间发表的学术论文5 7 a c k n o w l e d g e m e n t 5 6 p u b l i c a t i o n s 5 7 山东大学硕士学位论文 胰岛素抵抗大鼠存活时间与k j o t h o 表达关系的研究 研究生冯复利 导师李瑞峰教授 中文摘要 目的： 通过链脲佐菌素( s t z ) 诱导当日出生的w i s t a r 大鼠建立胰岛素抵抗( i r ) 模型， 探讨胰岛素抵抗大鼠k l o t h o 的表达变化与存活时间的关系以及川芎嗪( t m p ) 与氨 基胍( a g ) 治疗的干预作用。 方法： 1 实验动物及分组：出生当h w i s t a r 大鼠，腹腔注射s t z ( 9 0 m g k g ) 复制i r 模型 ( am o d e l o fn o n i n s u l i n - d e p e n d e n td i a b e t e si n d u c e db yn e o n a t a ls t r e p t o z o t o c i n , n o s t z ) 。正常伺养至8 周龄，空腹血糖7 o m o l l 或糖耐量试验餐后l 小时血 糖1 1 1 m o l l 者选入本研究。设立正常对照组( c n 组) 、胰岛素抵抗组( i r 组) 及川芎嗪+ 氨基胍( t m p + a g 组) 治疗组。记录各组大鼠存活时间。 2 空腹血糖( f p g ) 、空腹胰岛素( f i n s ) 和糖化血清蛋白( g s p ) 检测：分别于造 模第8 周、2 4 周和3 2 周断尾取空腹血，检测f p g ，留取血清检测f i n s 和g s p ，根据 公式( f f g f i n s ) 2 2 5 计算胰岛素抵抗指数( i r i ) 。采用果糖胺法检测各组g s p 含量。 3 生化指标检测：于造模3 2 周，摘眼球取血，离心留取血清，全自动生化分析 仪测定血清中总胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 、尿素氮( b u n ) 和肌酐( c r ) 。 留取肝、肾、脑等标本。 4 实时定量r t p c r ：分别检测肾组织晚期糖基化终末产物受体( r a g e ) 、i g f 一1 r 和k l o t h om r n a ，脑组织i g f - i r 和k l o t h om r n a ，肝组织i g f - i rm r n a 的表达水平。 5 w e s t e r nb l o t ：检测肾和脑组织k l o t h o 蛋白、晚期糖基化终末产物受体( r a g e ) 及i g f 一1 r 表达，肝组织晚期糖基化终末产物受体( r a g e ) 及i g f 一1 r 的表达 6 免疫组织化学染色：观察肾组织k l o t h o 蛋白、磷酸化的胰岛素样生长因子1 受体( i g f - 1 r ) 蛋白表达。 结果： 1 各组动物3 2 周龄存活率：i r 组为3 5 ( 7 2 0 ) ，t m p + a g 组8 5 ( 1 7 2 0 ) ，c n 组为 山东大学硕士学位论文 1 0 0 ( 2 0 2 0 ) 。i r 组存活率明显低于c n 组( p 0 0 5 ) ，t m p + a g 组存活率均 明显高于i r 组( p 0 0 5 ) 。 2 f p g 、f i n s 和g s p 检测结果：8 周龄时，模型组f p g 、f i n s 、i r i 和g s p 含量 均高于c n 组( j p 0 0 5 ) 。用药8 周( 1 6 周龄) 时，t m p + a g 组f p g 、f i n s 、i r i 和g s p 均低于i r 组( 尺o 0 5 ) ，高于c n 组( 以0 0 5 ) ；用药2 4 周( 3 2 周龄) ， t m p + a g 组f p g 和f i n s 较i r 组进一步降低( 尺0 0 5 ) ，f i n s 和i r i 仍高于c n 组；t m p + a g 组与c n 组间g s p 差异无统计学意义。 3 生化指标检测结果：各组血清t g 、t c 和c r 差异无统计学意义，t m p + a g 组 的b u n 较i r 组明显下降( p o 0 5 ) 。 4 实时定量r t - p c r 结果： ( 1 ) 肾组织r a g em r n a 表达：i r 组显著高于c n 组( j p ( o 0 5 ) 。t m p + a g 组明显 低于i r 组( 尺0 0 5 ) ，与c n 组差异无统计学意义。 ( 2 ) i g f - 1 rm r n a 表达：i r 组脑、肝、外周血淋巴细胞较c n 组明显降低( p o 0 5 ) 。 t m p + a g 组脑、肝组织较i r 组明显升高( j p ( 0 0 5 ) ，外周血淋巴细胞较i r 组降 低( p o 0 5 ) ；c n 组、i r 组和t m p + a g 组间肾组织表达均无明显差异。 ( 3 ) k l o t h om r n a 表达：i r 组肾、脑、外周血淋巴细胞较c n 组明显降低( p 0 0 5 ) 。 t m p + a g 组肾、脑组织较i r 组明显升高( p o 0 5 ) ，与c n 组比较无统计学差异。t m p + a g 组外周血淋巴细胞与i r 组差异无统计学意义。 5 w e s t e r nb l o t 结果： ( 1 ) 肾组织r a g e 蛋白表达：i r 组显著高于c n 组( 尺0 0 5 ) 。t m p + a g 组明显 低于i r 组( p 0 0 5 ) ，与c n 组差异无统计学意义 ( 2 ) i g f - i r 蛋白表达：i r 组脑、肝、肾较c n 组明显降低( 以o 0 5 ) 。t m p + a g 组脑、肝、肾组织较i r 组明显升高( 尺o 0 5 ) 。 ( 3 ) k l o t h o 蛋白表达：i r 组肾组织表达较c n 组明显降低( p o 0 5 ) ；t m p + a g 组较i r 组明显升高( 尺o 0 5 ) ，与c n 组比较无统计学差异。脑组织未检测到该蛋 白表达。 6 免疫组化结果： ( 1 ) k l o t h o 蛋白表达：i r 组肾组织k l o t h o 蛋白表达( 阳性细胞胞浆被染成棕黄色， 见图3 ) 较c n 组明显降低( p ，o 0 5 ) ，t m p + a g 组较i r 组表达明显增加( 尸 0 0 5 ) ，和 2 山东大学硕士学位论文 c n 组之间差异无统计学意义( 胗0 0 5 ) ， ( 2 ) i g f 一1 r 蛋白表达：i r 组肾脏远曲小管和集合小管i g f - 1 r 蛋白表达较c n 组 减少( j p 0 0 5 ) ；t m p + a g 组较i r 组增加，与c n 组间差异无统计学意义。 结论： 1 s t z 可以诱导出生当日w i s t a r 大鼠产生胰岛素抵抗。该胰岛素抵抗大鼠f p g 、 f i n s 、i r i 和g s p 随时间延长而升高，其存活时间明显缩短。 2 该i r 大鼠肾组织k l o t h om r n a 和蛋白表达下调，r a g em r n a 和蛋白表达上调；应 用t m p + a g 治疗可使大鼠肾组织k l o t h o m r n a 和蛋白表达上调，r a g em r n a 和蛋白表 达下调，并使大鼠存活时间明显延长。 3 1 3 v i p + a g 延长i r 大鼠存活时间作用与调控i r 大鼠多器官组织的i n s i g f 1 信号 系统功能的平衡有关。提示正常生命的维持需要i n s i g f 1 信号系统功能的相对稳 定。 关键词tk l o t h o ；胰岛素抵抗；氨基胍；川芎嗪；存活时间 3 t h ei n s u l i n r e s i s t a n tm o d e lo fn e w b o r nw i s t a r r a t s w a s d u p l i c a t e d w i t h s t r e p t o z o c i n ( 9 0 m g k g ) t h er a t sw e r er a i s e df o r8w e e k s ，a n dt h o s ew h o s ef a s t i n g p l a s m ag l u c o s eh i g h e rt h a no re q u a lt o7 0 m m o l lo rw h o s e2h o u r sp o s t p r a n d i a l b l o o dg l u c o s eh i g h e rt h a no re q u a lt o1 1 1m m o l li ng l u c o s et o l e r a n c et e s tw e r e s e l e c t e d r a t sw e r ed i v i d e di n t o4 g r o u p sr a n d o m l y ：n o r m a lc o n t r o l ( c n ) g r o u p ，i n s u l i n r e s i s t a n t ( i r )g r o u p ， a n d t h ec o m b i n a t i o no f t e t r a m e t h y l p y r a z i n e a n d a m i n o g u a n i d i n e ( t m p + a g ) g r o u p 2 t h em e a s u r e m e n to ff a s t i n gb l o o dg l u c o s e ( f p o ) 、f a s t i n gi n s u l i n ( f i n s ) a n d g l u e o s y l a t e ds e 九l 瑚p r o t e i n ( g s p ) m e a s u r e m e n t f p g 、f i n sa n dg s pw e r ed e t e c t e di n8 t h , 2 4t h , 3 2t h w e e k sa f t e rt r e a t m e n t f r o mt h e t a i lv e i n , i n s u l i nr e s i s t a n c ei n d e x ( i r i ) w a sc o u n tb yc a l c u l a t i o nf o r m u l ao ff p g f i n s 2 2 5 3 m e a s u r e m e n to fb l o o db i o c h e m i c a li n d e x a tt h ee n do ft h ee x p e r i m e n t ，t h es e r u n lt o t a lc h o l e s t e r o l ( t c ) ，t r i g l y c e r i d e ( t g ) ，b l o o d u r e an i t r o g e n ( b u n ) ，c r e a t i n i n e ( c ow e r ed e t e c t e d 4 r e a l t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) 1 1 1 ee x p r e s s i o no fk l o t h oa n di g f - 1rm r n aw c i em e a s u r e db yr t p c ri nk i d n e y a n db r i a n ；t h ee x p r e s s i o no fa d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t sr e c e p t o r s ( r a g e ) a n d 4 1 s u r v i v a lr a t eo fe a c hg r o u p a tt h ee n d o ft h ee x p e r i m e n t , t h es u r v i v a lr a t ei ni rg r o u p ，肿+ a gg r o u pa n dc n g r o u pw e r e3 5 ，8 5 a n d10 0 r e s p e c t i v e l y t h es u r v i v a lr a t ei ni rg r o u pw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti nt h ec ng r o u p ( 尸 o 0 5 ) ，ms u r v i v a lr a t ei nt m p + a g g r o u pw e r eh i g h e rt h a ni rg r o u p ( p 0 0 5 ) 2 f p g 、f i n sa n dg s p 7 胁f p g ，f i n s ，i r ia n dg s pi nm o d a lg r o u p sw e r eh i g h e rt h a nc ng r o u pa tt h ea g e o f8w e e k s ( p 0 0 5 ) ；t h ei n d e xa b o v ei nt m p + a gg r o u pw e r el o w e rt h a ni rg r o u p a tt h ea g eo f1 6w e e k s ( p 0 0 5 ) ，h i g h e rt h a nc n g r o u p ( p o 0 5 ) ；a t t h ea g eo f 3 2 w e e k s ，1 1 l ef p ga n df i n si n 咖+ a gg r o u pw e r em o r ed e c r e a s e dc o m p a r e d 晰廿l i rg r o u pa tt h ea g eo f 2 4w e e k s ( p 0 0 5 ) ，t h ef p gh a dn os i g n i f i c a n c ec o m p a r e d 哳mc ng r o u p ，f i n sa n di r ii n 盯p + a gg r o u pw e r eh i g h e rt h a nc n g r o u p ( p 0 0 5 ) ，t h e r ew a s n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei ng s pl e v e l sb e t w e e n 咖+ a g g r o u pa n dc ng r o u p 3 b l o o db i o c h e m i c a li n d e xr e s u l t 1 1 1 ed i f f e r e n c e so f s e r u mt g ，t ca n dc ra m o n gg r o u p sw e r ei n s i g n i f i c a n t ，t h eb u n i i l 聊十a g g r o u pw a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d t oi rg r o u p 4 i 汀- p c ra n a l y s e s ( 1 ) n er e n a le x p r e s s i o no fr a g em r n a r e a l - t i m er t - p c ra m p l i f i c a t i o nr e v e a l e das i g n i f i c a n t l yi n c r e a s ei ni rg r o u pr a g e 5 山东大学硕士学位论文 m r n a c o m p a r e d t ot h ec o n t r o lg r o u pm r n al e v e l ( p 0 0 5 ) t h et r e a t e di rr a t sh a d s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s ew h e nc o m p a r e dw i t ht h ei rg r o u p ( 尸 0 0 5 ) ，t h e r ew e r en o d i f f e r e n c e so b s e r v e db e t w e e nc o n t r o la n dt r e a t e di ra n i m a l s ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fi g f ir m r n a t h ee x p r e s s i o no fi g f - 1rm r n ai nb r a i n ，h e p a t i ct i s s u e s i ni rg r o u pw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nc n g r o u p ( 0 0 5 ) , w h i c hw a si n c r e a s e di nb r a i n a n dh e p a t i c t i s s u e so f t m p + a gg r o u pt h a nt h a to f l rg r o u p ( p 0 0 5 ) n os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e s i nt h ee x p r e s s i o no fi g f 一1rm r n ai nr e n a lt i s s u e so fc ng r o u pa n d 田m p + a g g r o u pw e r ef o u n d ( 3 ) t h ee x p r e s s i o no fk l o t h om r n a r e a l - t i m er t - p c rd e m o n s t r a t e das i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nr e n a la n db r a i nk i o t h o g e n ee x p r e s s i o nb e t w e e n t h ec o n t r o la n di rg r o u p s ，as i g n i f i c a n t l yd e c r e a s ei nt h ei r g r o u pw h e nc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( p o 01 ) t h e r ew e r e a l s oas i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h ei ra n di n 田m p + a gi rg r o u p ，a b o u ta3 - f o l di n c r e a s ei n t m p + a gg r o u p ( p 0 0 1 ) 5 w e s t e r nb l o ta n a l y s i s ( 1 ) t h er e n a lr a g ep r o t e i ne x p r e s s i o n w e s t e r nb l o ta n a l y s i so fr a g er e v e a l e das i m i l a rt r e n dw i t hr t - p c r , i nw h i c h r a g ep r o t e i ne x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di ni rg r o u pw h e nc o m p a r e d 丽mt h ec o n t r o lg r o u p ( 尸 o 0 5 ) ；t h e1 m p + a gg r o u ps h o w e dad e c r e a s ea s c o m p a r e d 晰t l lt h ei rg r o u p 伊 o 0 5 ) ( 2 ) t h ei g f - 1rp r o t e i ne x p r e s s i o n t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fl g f - 1ri nb r a i n ，h e p a t i ca n dk i d n e yt i s s u e si ni rg r o u pw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nc ng r o u p ( p 0 0 5 ) , w h i c hw a s i n c r e a s e di nt m p + a gg r o u p t h a ni rg r o u p ( 尸 o 0 5 ) ( 3 ) t h ek l o t h op r o t e i ne x p r e s s i o n w e s t e r nb l o ta n a l y s i so fe x p r e s s i o no fr e n a lk i o t h or e v e a l e dt h a tk i o t h op r o t e i n e x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di ni rg r o u pw h e nc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l g r o u p 妒 0 0 5 ) ；t h et m p + a gg r o u ps h o w e dad e c r e a s ea sc o m p a r e dw i t ht h ei r g r o u p 俨如0 5 ) t h e o t h op r o t e i ne x p r e s s i o ni nb r a i nt i s s u ed i dn o td e t e c t 6 山东大学硕士学位论文 6 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( 1 ) t h ek l o t h op r o t e i ne x p r e s s i o n t h ek l o t h oe x p r e s s i o nf r o mi rg r o u pw a sd e c e a s e dc o m p a r e d 、析t l lc ng r o u p ( p 0 0 5 ) ，w h i c hw a si n c r e a s e di nt m p + a gg r o u pc o m p a r e dt oi rg r o u p ( p 0 0 5 ) ( 2 ) t h ei g f 1rp r o t e i ne x p r e s s i o n t h ee x p r e s s i o no fi g f - 1ri nt h ed i s t a lc o n v o l u t e dr e n a lt u b u l ea n dc o l l e c t i n gd u c ti n i rg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nc ng r o u p ( p 0 0 5 ) ，i g f 1r e x p r e s s i o ni n t m p + a gg r o u pw a sh i g h e rt h a ni rg r o u p ( p o 0 5 ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt m p + a g g r o u pa n dc ng r o u p c o n c l u s i o n s ： 1 t h ei n s u l i nr e s i s t a n tm o d a lo fn e w b o r nw a se s t a b l i s h e dw i t hs t r e p t o z o t o c i n i n t r a p e f i t o n e a l l y t h el e v e lo f f p g 、f i n s 、i r ia n dg s pw e r ei n c r e a s e d 、析t ht h et i m e g o i n go n m e a n w h i l et h es u r v i v a lr a t ew a sd e c r e a s e d 2 r e n a lk l o t h om r n aa n dp r o t e i n e x p r e s s i o nw e r ed e c r e a s e d i ni rr a t s ， o v e r e x p r e s s i o no ft h er a g e m r n aa n dp r o t e i nw a sa l s on o t e di nt h ek i d n e y sf r o m i rr a t s ，a n dh i g hm o r t a l i t y ，c o m p a r e d 、) ，i t l lt h ec o n t r o lg r o u p o u rr e s u l ta l s os u g g e s e d t h a tt m p + a gt r e a t e dm t sh a v ed e c r e a s e de x p r e s s i o no fr a g e ，a n di n c r e a s e d e x p r e s s i o no fk l o t h o a n dt h em o r t a l i t yr a t ew a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h er a g eh a v eb e e nn e g a t i v e l yl i n k e dt ol o n g e v i t y , y e tk l o t h oh a sa n o p p o s i t er o l e t h ee x a c tm e c h a n i s mn e e d st ob ef u r t h e re x p l o r e d 3 i tw a sf o u n dt h a tt h em e c h a n i s mo ft m p + a gf o rt h ep r o l o n g a t i o no fs u r v i v a l p e r i o dw a sd i r e c t l yr e l a t e d 、析n 1r e g u l a t i n gt h eb a l a n c eo ft h ei n s i g f ls i g n a ls y s t e m f u n c t i o n si nm u l t i p l eo r g a n si ni rr a t s t om a i n t a i nn o r m a ll i f ef u n c t i o n sn e e d st h e r e l a t i v es t a b i l i t yo ft h ei n s i g f ls i g n a ls y s t e m k e yw o r d ：k l o t h o ；i n s u l i nr e s i s t a n t ； a m i n o g u a n i d i n e ；t e t r a m e t h y l p y r a z i n e ： s u r v i v a lt i m e 7 山东大学硕士学位论文 符号说明 英文缩写英文全称中文全称 a g a m i n o g u a n i d i n e氨基胍 a g e sa d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t s晚期糖基化终末产物 d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 f i n s f a s t m g i n s u l i n空腹胰岛素 f p g f a s t i n gp l a s m ag l u c o s e 空腹血糖 g h g r o w t hh o r m o n e 生长激素 g s p g l u c o s y l a t e ds e r u l np r o t e i n 糖化血清蛋白 h e h e m a t o x y l i n - e o s i n 苏木素一伊红 i g f 1 i n s u l i nl i k eg r o w t hf a c t o r - 1 胰岛素样生长因子一l i g f 1 ri n s u l i nl i k eg r o w t hf a c t o r - ir e c e p t o r胰岛素样生长因子一l 受 体 i n s i g f 1i n s u l i n i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r - i胰岛素胰岛素样生长因 子一1 i ri n s u l i nr e s i s t a n t胰岛素抵抗 i r ii n s u l i nr e s i s t a n c ei n d e x胰岛素抵抗指数 r a g ea d v a n c e dg l y c a t i o ne n dp r o d u c t sr e c e p t o r s 晚期糖基化终末产物 受体 r t - p c rr e a l t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 荧光实时定量逆转录多聚酶链反应 s o d s u p e ro x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 s p s ss t a t i s t i c a lp a c k a g ef o rs o c i a ls c i e n c e s社会科学统计软件包 s t z s t r e p t o z o t o c i n 链脲佐菌素 t ct o t a lc h o l e s t e r o l总胆固醇 t g t r i g l y c e r i d e 甘油三酯 t m p t e t r a m e t h y l p y r a z i n e 川芎嗪 8 山东大学硕士学位论文 刖罱 k l o t h o 基因是k u r o - o 等在1 9 9 7 年研究自发性高血压时，发现的一种与衰老 密切相关的基因，该基因主要在肾脏和脑脉络膜中表达。k l o t h o 基因在小鼠中 表达缺失，会出现类似于人类衰老的各种表型，如动脉硬化、骨质疏松、肺气肿、 寿命缩短、皮肤萎缩、不育症、运动失调等乜吲。特别是寿命明显缩短，在8 - 9 周龄即死亡，平均寿命6 0 7 天【l 】。研究表明，长期高血压、糖尿病、肾衰竭等应 急状态下，肾组织中k l o t h o m r n a 表达可出现下调呻j 们。 研究表明3 ，k l o t h o 基因缺陷小鼠体内的氧化应激明显增高，5 周龄小鼠的海 马中脂类和d n a 的过氧化水平明显高于正常小鼠，同时胞内的凋亡分子b a x 表达 升高，而抗凋亡分子b c l - 2 和b c l x l 则表达下降；7 n 龄时，k l o t h o 基因缺陷小鼠 中检测到大量凋亡细胞，表明k l o t h o 蛋白缺陷将导致细胞凋亡增加，而使用抗氧 化剂处理小鼠则明显减轻了氧化应激，延缓衰老的出现。k l o t h o 蛋白可能通过与 细胞膜表面尚未鉴定的特定受体结合而启动胞内的信号转导，该信号传递可以抑 制胰岛素和胰岛素样生长因子l ( i g f - i ) 的胞内信号传递，k l 对胰岛素i g f - i 的抑 制作用可能主要是通过对蛋白激酶b ( a k t ) 的抑制完成的n 2 13 1 钔。k l o t h o 蛋白抑制 胰岛素和胰岛素样生长因子i ( i g f - i ) 的胞内信号传递可能是延长小鼠寿命的一 种重要的方式。但u n g e r 等推测这种抗衰老的机制也可能是通过降低胰岛素的作 用，减少细胞内对糖的利用，而增加对脂类物质的利用，这种代谢特点可以减少 细胞内脂类的积累及积累后造成的细胞毒害n 明。y a m a m o t o 等的研究发现n 6 1 ， k l o t h o 蛋白也可能通过特定的信号通路激活特异性转录因子f o x o ，该因子可以直 接与镁依赖的超氧化物歧化酶的启动子结合，使其表达上调，超氧化物歧化酶可 将有害的超氧化物转化为毒性较弱的过氧化氢而减轻危害。 研究还表明，在大多数生物中胰岛素信号通路( i n s u l i ns i g n a lp a t h w a y ，i n s ) 处于寿命遗传控制的核心地位n 7 1 ，并且这个信号通路从酵母到人在进化上具有高 度保守性n 副，增加胰岛素信号的作用，可以加速衰老，而减少则可以延长生物体 的寿命n9 巩2 。胰岛素信号传导的信号分子必需通过其受体才可以传递下去，因 此胰岛素受体( i n s u l i nr e c e p t o r ，i n r ) 或者胰岛素样生长因子受体( i n s u l i n - - l i k eg r o w t hf a c t o rt y p e1r e c e p t o r ，i g f l r ) 突变也影响着生物体的寿命。 本实验设计建立链脲佐菌素( s t r e p t o z o t o ci n ，s t z ) 诱导的胰岛素抵抗大鼠模型， 9 山东大学硕士学位论文 通过氨基胍联合川芎嗪治疗胰岛素抵抗大鼠，观察动物的存活时间，检测肾组织 中k l o t h o 的表达，初步探讨k l o t h o 表达水平与动物存活时间的关系。 l o 山东大学硕士学位论文 1 材料与方法 1 1 材料 1 实验动物：出生当日的w i s t a r 大鼠1 0 0 只，体重约6 克，山东大学实验动物 中心提供。 2 试剂与药物 1 ) h a r r i s 苏木素染液：甲液：苏木素l g ，无水酒精l o m l ；乙液：硫酸铝钾2 0 9 ， 蒸馏水2 0 0 m l ；分别加温溶解后混匀，继续加热煮沸，离火后其不沸腾时加 入0 5 9 黄色氧化汞，用玻璃棒搅拌至溶液呈深紫色，立即将容器置冷水中 迅速冷却后过滤，用前加冰醋酸4 m i 。 2 ) p a s 染液：5 高碘酸溶液：高碘酸0 5 9 ，蒸馏水l o o m l ；希夫试剂：l m o l l h c il o m l ，碱性品红0 5 9 ，偏重亚硫酸钠0 5 9 ，活性碳1 9 ，蒸馏水l o o m l 。 3 ) 兔抗山羊k l o t h o 多克隆抗体：产品编号s c - - 2 2 2 2 0 ，美国s a n t ac r u z 公司生产。 4 ) 山羊抗兔磷酸化i g f - 1 r 多克隆抗体：产品编号# 3 0 2 1 ，英国c e l ls i g n a l i n g 公司生产。 5 ) 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔i g g ：产品编号：z m 2 3 0 4 ，购自北京中杉金桥 生物技术有限公司。 6 ) 辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊i g g ：产品编号：z m 2 3 0 6 ，购自北京中杉金桥 生物技术有限公司。 7 ) 焦碳酸二乙酯( d e p c ) ：购自美国a m e r e s c o 公司。 8 ) t r i z o l 试剂：产品编号：1 5 5 9 6 一0 2 6 ，购自美国i n v i t r o g e n 公司。 9 ) 逆转录试剂盒：产品编号：d r r 0 3 7 a ，购自日本t a k a r a 生物工程有限公司。 1 0 ) 荧光定量p c r 试剂盒：产品编号：d r r 0 4 1 a ，购自日本t a k a r a 生物工程有限公 司。 1 1 ) r t - p c r 引物：由上海博尚生物工程有限公司设计合成。 1 2 ) r t - p c r 相关缓冲液 配置方法：( i ) 5 0 x t a e ( 5 0 x t r i s - 7 , 酸电泳缓冲液) ：称取2 4 2 9t r i s ，5 7 1 i i l l 冰乙酸，l o o m l0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) 加入去离子水定容至1 0 0 0 m l 。 2 琼脂糖( 含有0 5 p g m ke b ) 称取2 9 琼脂糖，加入l x t a el o o m l ，微波炉 加热两分钟煮沸，冷却至6 0 。c 时加入e b ，使e b 终浓度为0 5 p g m l 。 山东大学硕士学位论文 l o x m o p s 5 0 m m o l l 醋酸钠，l o m m o l lp h 8 0e d t a ，0 2 m o l lp h 5 5 7 0 m o p s ，d e p 配置，高压灭菌后无色或微黄，室温保存。 r n a 样品缓冲液5 0 去离子甲酰胺，1 m o p s ，2 0 ( v v ) 甲醛，2 0 ( v v ) 甘油，少许溴酚蓝和二甲苯蓝。 1 3 ) 链脲佐菌素( s t r e p t o z o t o c i n ，s t z ) ：美国s i g m a 公司产品。 1 4 ) 氨基胍盐酸盐( a m i n o g u a n i d i n e ，a g ) ：上海达瑞精细化学品有限公司。 1 5 ) 盐酸川芎嗪( t e t r a m e t h y l p y r a z i n e ，t m p ) ：天津药业集团新郑股份有限公司。 1 6 ) o n et o u c h 血糖仪：美国强生l i f e s c a n 公司产品。 1 7 ) 0 1 d e p c 水：取1 o m l d e p c 原液( 焦碳酸二乙脂，s i g m a 公司产品) 加入1 0 0 0 m