（植物学专业论文）质膜质子泵对拟南芥气孔运动影响的信号转导机制初探.pdf

摘要 气孔是植物与外界环境进行气体交换的门户，其开闭调控着光合作用和蒸腾作用， 在植物生命活动中起重要的调节作用。气孔保卫细胞对多种刺激作出反应，接受刺激后 可快速改变离子的运输，保卫细胞体积随之发生变化。保卫细胞已成为研究植物细胞接 受刺激并作出反应的模式系统，保卫细胞内的信号转导过程与气孔运动密切相关。 当保卫细胞受到外部刺激时，可通过细胞质膜上的某些信号分子激活质膜质子泵， 促进h + 外流，造成细胞质膜超极化，引发一系列信号转导过程，使细胞内相应的离子浓 度发生变化，进而导致气孔运动。保卫细胞质膜质子泵在气孔运动过程中发挥重要的调 控作用，这一作用有可能是通过促进细胞内钙离子浓度升高和钙信号的产生实现的。 为了进一步探索细胞质膜质子泵诱导气孔开放过程中的信号转导机制，本文以拟南 芥叶片表皮条为材料，采用表皮条生物分析法，通过药理学实验，结合使用信号转导组 分突变体研究了壳梭孢菌素调节气孔运动可能的信号转导机制。运用水母发光蛋白测钙 技术，研究了质膜质子泵活性调节剂对保卫细胞内钙离子浓度的影响。结果表明，壳梭 孢菌素激活质膜质子泵，促进h + 外流，细胞质膜超极化激活了质膜上对尼群地平敏感的 钙通道；同时质膜上的k + 通道被激活，最终导致气孔开放。水母发光蛋白测钙结果证明 了壳梭孢菌素诱导气孔开放过程中，胞内钙离子浓度显著升高。 细胞# f 、c a m 具有极为广泛的生物学功能，其活性的调节也与诸多因素有关。胞外 c a m 诱导的胞内游离c a 2 + 浓度的升高可能是其调节细胞生长发育的主要方式。在c a m 信 号转导机制中，c a m 激活质膜钙通道，诱导胞外c a 2 + 内流，导致气孔关闭已得到证实。 本文以n a d p h 氧化酶缺失突变体r h d - 2 进行表皮条分析和水母发光蛋白测钙实验，结果 显示，n a d p h 氧化酶催化的活性氧r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 可能参与了c a m 诱导 的气孔关闭。利用外向整流型钾离子通道基因的缺失突变体g o i u 进行的生理实验结果 表明，质膜上和g o r k 突变体相关的通道蛋白( k + o u 通道蛋白) 很可能参与了c a m 的信 号转导，本实验结果进一步丰富了c a m 信号通路的组成。 关键词：拟南芥保卫细胞壳梭孢菌素钙通道钙调素水母发光蛋白 i i l a b s t r a c t s t o m a t ai nt h el e a fe p i d e r m i si sr e s p o n s i b l ef o rr e g u l a t i n ga i re x c h a n g eb e t w e e n p l a n ta n d a t m o s p h e r e g u a r dc e l lr e g u l a t e sp h o t o s y n t h e s i sa n dt r a n s p i r a t i o n ，w h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l e s i np l a n tm e t a b o l i s m e x o g e n o u ss t i m u l ir e g u l a t e ds t o m a t a l m o v e m e n t sr e s u l t i n gf r o mv o l u m e c h a n g e so fg u a r dc e l l s ，w h i c hd e p e n do ni o nt r a n s p o r t a t i o n h e n c e ，s i g n a lt r a n s d u c t i o ni n g u a r dc e l l sh a sa c l o s er e l a t i o nw i t hs t o m a t a lm o v e m e n t 旷一a t p a s ei np l a s m am e m b r a n ec a nb ea c t i v a t e db ye x o g e n o u ss t i m u l it h r o u g hs i g n a l i n g m o l e c u l e si n p l a s m am e m b r a n e t h e na c c e l e r a t e d h + - e f f i u xl e a d sp l a s m am e m b r a n e h y p e r p o l a r i z a t i o na n di o nc o n c e n t r a t i o nc y t o p l a s mc h a n g i n g f i n a l l ys t o m a t a lm o v e m e n t ( o p e n i n go rc l o s i n g ) i si n d u c e d i th a sb e e ns u g g e s e t e dt h a tp r o t o np u m pi sa np o s i t i v e r e g u l a t o rw h i c ha c c o m m o d a t e ss t o m a t a lm o v e m e n tb ye n h a n c i n gc a 2 + c o n c e n t r a t i o n i no r d e rt ov e r i f ys i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yo fp mh + - a t p a s ep a r t i c i p a t e ds t o m a t a l o p e n i n g , a p e r t u r e so fs t o m a t aa n dc y t o s o l i cc 一+ c o n c e n t r a t i o ni ng u a r dc e l l sw a si n v e a t i g a t e d b yu s i n ge p i d e r m a ls t r i pa sm a t e r i a l r e s u l t ss h o w e dt h a ta g o n i s to f 旷一a t p a s e ( f u s i c o c c i n ， f c ) l e a ds t o m a t a lo p e n i n g c a 2 + p e r m e a b l ec h a n n e li np l a s m am e m b r a n ew h i c h w a ss e n s i t i v e t o n i f e d i p i n em a yb ep o s s i b l yi n v o l v e di nf ci n d u c e ds t o m a t a lo p e n i n g k 十c h a n n e l si n p l a s m am e m b r a n ew a sa l s oi n v o l v e di nf ci n d u c e ds t o m a t a lo p e n i n g c y t o s o l i cc a l c i u m c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e da f t e rf cs t i m u l a t i o n ，c a l c i u ms i g n a lm a y p o s s i b l yp a r t i c i p a t e di nf c i n d u c es t o m a t a lm o v e m e n t s e x t r a c e l l u l a rc a mh a sv a r i o u sb i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n di t sa c t i v i t yi sr e g u l a t e db yl o t so f a g e n t s i n c r e a s i n go f c a 2 + bc a nb ei n d u c e db ye x t r a c e l l u l a rc a m i th a sb e e nr e p o r t e d t h a tt h ec a 2 + c h a n n e li nt h ep l a s m am e m b r a n ei sa c t i v a t e db yc a m ，a n dt h e ni n d u c ec a 2 + e f f l u x h e r e ，b yu s i n gn a d p hm u t a n t ，w ed e m o n s t r a t e dt h a tr o si s i n v o l v e di n e x t r a c e l l u l a rc a m ( e x t c a m ) i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e g u a r dc e l lo u t w a r dr e c t i f y i n gk + c h a n n e lg o r ki sa l s oi n v o l v e di ne x t r a c e l l u l a rc a mi n d u c e ds t o m a t a lc l o s i n g k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，g u a r dc e l l ，c a ：+ c h a n n e l s ，f u s i c o c c i n ，e x t c a m ， a p o a e q u o n n i v 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文质膜质子泵对拟南芥气孔运动影响的信号转导机制初探， 是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ：南犏老 ) 戚引玛哆日 指导教师确认( 签名) ： 一舌年岁月e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在年解密后使用本授权书) 论文作者( 签名) ：棚 夕一扩年j - 月卵e l i i j化厂 糖 苏d i )，1叫， 孙矽 签月 ，l ”， j i y 教年导d 群 阶 引言 植物叶片表皮的气孔控制着自身与外界环境气体和水分的交换，在植物生命活动中 发挥作用。因而其运动机制一直是人们普遍关注的问题。近年来由于细胞感应与信号转 导研究的兴起，气孔保卫细胞成为研究植物细胞接受刺激并作出反应的良好模式系统， 这是因为保卫细胞能对多种刺激迅速作出反应；许多植物的表皮可被撕下，用表皮组织 可直接观察保卫细胞的变化；水母发光蛋白测钙技术的应用为钙离子浓度测定提供了更 为可靠的方法，同时膜片钳( p a t c hc l a i l 叩) 技术测定单通道电流成功地运用到保卫细胞 中，大大地推动了气孔运动信号转导途径的研究进程。 ， 植物细胞质膜上存在的质子泵产生的跨膜电势梯度是物质跨膜主动运输过程的主 要动力源。植物细胞受到外部信号刺激时，可通过细胞质膜上的某些信号分子激活质膜 质子泵，促进h + 外流，造成细胞质膜超极化，细胞膜电位的变化可以改变质膜上电压依 赖型离子通道的活性，引发细胞内相应离子浓度的变化。已有实验表明壳梭胞菌素专一 性地激活质膜质子泵，引起保卫细胞 c a 2 + 】。y t 升高，气孔开放。那么质膜质子泵的激活 导致的质膜超极化是否激活了质膜上超极化激活的钙通道呢? 胞内钙的升高是否是通 过质膜钙通道被激活所产生的钙信号引起的呢? 在壳梭胞菌素诱导气孔开放的信号通 路中还存在哪些信号分子呢? 这是本文要研究的一个方面。 多年研究表明，c a m 普遍存在于植物质外体中，具有促进细胞增殖、促进花粉萌发 及花粉管伸长，诱导某些基因表达等多种生物学功能( 马力耕等，1 9 9 7 ；赵鸿娟等，1 9 9 6 ； 马力耕等，2 0 0 0 ) 。最近研究表明，拟南芥保卫细胞外也存在c a m ，胞外c a m 可能是通 过诱导保卫细胞胞质游离钙离子浓度升高，导致微丝骨架的解聚，进而促进气孔的关闭 运动( 肖玉梅等，2 0 0 4 ) 。c h 钮等( 2 0 0 4 ) 通过表皮条生物学分析、激光共聚焦显微技 术和遗传学方法证明，e x t c a m 通过激活异三聚体g 蛋白促进h 2 0 2 的产生和 c a 寸】。y t 的 提高，从而促进气孔关闭。细胞外c a m 调节气孔运动的信号通路为：细胞外c a m 先与 其受体结合，然后激活g 蛋白，g 蛋白打开质膜c a 2 + 通道，使细胞外c a 2 + 进入细胞内； 进入细胞内的c a 2 + 一方面促使细胞内c a 2 + 库释放c a 2 + ，使细胞内c a 2 + 升高，另一方面与 n a d p h 氧化酶结合，导致h 2 0 2 增加；升高的h 2 0 2 进一步打开质膜c a 2 + 通道，使保卫 细胞 c a 2 + 。y t 进一步升高；升高的c a 2 + 可能激活依赖c a 2 + 的蛋白激酶，引起下游反应， 最后引起气孔关闭。 从气孔运动的机理来看，气孔的关闭与k + o u 。通道有着密切的关系。c a m 信号通路 通过一系列信号分子最终诱导气孔关闭，因此我们猜测质膜上的k + o 叭很可能参与了c a m 信号通路。利用外向整流型钾离子通道基因的缺失突变体g o r k ，进一步探讨c a m 信 号通路的转导机制。本文还将就活性氧r o s 参与c a m 信号通路的问题，选用n a d p h 氧化酶缺失突变体砌小2 ，用水母发光蛋白测钙的技术验证r o s 在c a m 信号通路中的 作用。c 制信号的通路是本文另一个方面的研究内容。 2 文献综述 1植物气孔运动过程中的信号转导机制 气孔主要分布于植物的幼嫩枝茎及叶片表面，由一对保卫细胞围绕而成，是植物同 外界进行物质交换的重要门户。气孔的开闭控制着植物的蒸腾作用，光合作用及呼吸作 用等重要生理过程，调节着植物的生长和发育过程。研究气孔运动机理对于了解植物的 抗逆反应、水分的合理利用、作物产量的提高以及植物体内的信号转导过程都具有非常 重要的意义( f a i l 等，2 0 0 4 ) 。气孔的开关运动是植物对环境刺激的快速反应之一，其运 动过程是植物对所处环境条件的变化和内部发育信号的刺激作出的准确而灵敏的反应 ( s d l r o e d e r 等，2 0 0 1 ) 。 1 1 气孔运动机理 传统理论认为气孔开闭由保卫细胞膨压改变所调控。气孔开放是保卫细胞吸收k + 、 各类阴离子及蔗糖等渗透物质引起水分进入保卫细胞并引起细胞体积膨胀的结果；而 k + 及各类阴离子的外流，蔗糖向外转移及苹果酸转化为低渗透势的淀粉，保卫细胞渗透 势降低水分外移体积缩小则引起气孔关闭( b 1 a t t ，1 9 9 9 ；s d o e d e r ，2 0 0 1 ) 。在此过程 中，水通道也参与了气孔的开闭运动( 杨惠敏等，2 0 0 2 ；l i e t a l ，2 0 0 4 ；y a m g 等，2 0 0 4 ) 。 另有研究表明，在日周期( d a i l yc y c l e ) 开始的时间内，主要由k + 维持气孔开放，而后 来当k + 浓度降低时，蔗糖成为维持气孔开放的主要因素( s c l l r o e d e r 等，2 0 0 1 ) 。 保卫细胞膨压可由多种信号调控。现在普遍认为，当气孔保卫细胞质膜上的受体感 受到外界信号( 光、温度、水分、重力、伤害、病原菌毒物、矿物质及气体等) 刺激( k e 锄s 等，1 9 9 3 ) 或植物自身信号( 活性氧、植物激素、植物生长活性物质) 刺激时，这些信 号转换为胞内信息一第二信使( c a 2 + 、口3 、c a m p 等) ( 刘新等，2 0 0 1 ) ，并激活质膜上 的多种离子通道( c a 2 + 、k + 、c 1 。通道等) 和与信号转导相关的酶类( 蛋白激酶、蛋白磷 酸酶) 。此时，保卫细胞膜上的h + a t p a s e 被激活，释放质子，质膜超极化 ( h y p e 印o l 撕z a t i o n ) ，增加膜的负电位，引起h + 外流，进而促使内向k + 通道开启，k + 进 入细胞，c l 也可经c l 转运体( c 1 。o h 或c l - h + ) 进入细胞，这些离子和保卫细胞合成 的苹果酸及有机化合物共同降低保卫细胞的渗透势，保卫细胞吸水膨胀，气孔张开。反 之，保卫细胞释放阴离子或吸收c a 2 + 时，质膜去极化( d 印o l 撕z a t i o n ) ，激活外向k + 通 道和阴离子通道，抑制内向k + 通道活性，k + 、c l 。等离子外流，苹果酸等渗透调节物质 水平下降，保卫细胞失水收缩，气孔关闭。 1 2 影响气孔运动的因素 1 2 1 光诱导的气孔运动 光主要依赖细胞中叶绿素、蓝光m v - a 受体及藻胆素( p h y c o b i l l i n ) 这3 种光受体 的共同作用来调节气孔开闭。气孔对光的反应是两个不同系统的综合效果。一个依赖于 保卫细胞的光合作用，另一个被蓝光所推动。双光试验的结果可以证明气孔对光的反应 是由两个完全不同的系统推动的。在双光实验中，红光持续强的情况下，蓝光在o 5 m i n 内就会引起蚕豆气孔导度( s t o m a t a lc o n d u c t a i l c e ) 的进一步增加，而用闪红光代替蓝光时 此效应则不出现，即表明蓝光可以促进气孔开放。 红光( s 舢，1 9 8 8 ) ，蓝光( a s s m 锄，1 9 9 5 ；s l l i m a z a l 【i ，1 9 8 6 ) 可以激活质膜 上的h + a t p a u s e ，引起一外流，诱导气孔开放。因此有人推测，光诱导气孔开放的机制 是：光激活质膜上的h + a t p 懿e ，引起质膜超极化，驱动k + 通过k + i n 通道进入保卫细 胞；同时阴离子( c l ) 通过质膜上的h + 阴离子同向运输或是阴离子o h 。反向运输进入保 卫细胞( 孙大业等，2 0 0 1 ) 。最近，r o e l f s 锄a 和h e 嘶c h ( 2 0 0 5 ) 的研究表明，光通过蓝光 特异性由光合作用激活辐射依赖途径( p h o t o s ) ，i l t h e t i c a c t i v er a d i a t i o n d 印e n d e n tp a t h w a y ) 促使保卫细胞气孔开放。 1 2 2c 0 2 诱导的气孔关闭 暗条件下，植物呼吸作用释放出的c 0 2 浓度提高，这会刺激气孔关闭。对c 0 2 调节 的气孔运动信号转导机制目前有2 种解释：一种认为高浓度的c 0 2 会引起 c a 2 + 】。y t 升高， 激活s 型阴离子通道和c 叫通道，同时调节r 型阴离子通道促使气孔关闭；另一种认 为c 0 2 可以通过增加胞壁中苹果酸盐的浓度引起气孔关闭( h o 嘶c h ，1 9 9 4 ) ，但是，研 究表明，只有当保卫细胞胞外苹果酸盐的浓度大于2 0 m m 时才能引起气孔关闭，而这一 浓度在正常生理状态下是很难达到的( e s s e r ，1 9 9 7 ) 。此外，外施苹果酸盐可以中和c 0 2 诱导的气孔关闭( c o u s s o n ，2 0 0 0 ) ，因此对c 0 2 通过增加胞壁中苹果酸盐的浓度引起气 孔关闭假说提出了质疑。另外有假说认为c 0 2 受体定位于保卫细胞叶绿体中并通过降低 玉米黄素水平来发挥作用( z h u ，1 9 9 8 ) 。 4 还有实验表明，气孔对c 0 2 的应答部分涉及光合电子转移与叶肉细胞或保卫细胞内 叶绿体含碳量降低之间的平衡( m e s s i n g e r 等，2 0 0 6 ) 。虽然对此尚有争议，但人们还是 普遍认为，卡尔文循环在气孔运动中起到一些作用。目前已有资料证明，在促进和维持 气孔开放过程中，保卫细胞中淀粉降解以及含碳物质从保卫细胞的非原质体输入十分重 要( v a v a s s e u r 和r a 曲a v e i l d r a ，2 0 0 5 ) 。因而研究保卫细胞感受c 0 2 和信号转导，不仅有 利于了解保卫细胞信号转导途径和代谢途径的关系，而且对操纵气体交换及c 0 2 的碳固 定也有意义。 1 2 3a b a 诱导的气孔关闭 a b a 是植物体内极为重要的逆境响应激素，被称为“胁迫激素 ，它既是环境胁迫 信号的诱导产物，又是胁迫信号的传导者，通过它使环境信号迅速级联放大。因此，在 植物根系和叶片对水分的感知、传导和调节等生理过程中，a b a 是核心信号物质，人 们对a b a 在保卫细胞信号转导中作用机理的认识也比对其他刺激因子( 如光、c 0 2 和空 气湿度) 的作用机理认识深刻。研究表明，植物根系在水分亏缺后，能迅速合成和动员 a b a ( c o h e i l 和b r a y ，1 9 9 0 ) ，根系合成的a b a 随蒸腾流传输到叶片，并很快转移到叶片 表皮上的保卫细胞，引起气孔迅速关闭，减少植物水分的散失( s c h u r r 等，1 9 9 2 ) 。a b a 调 节气孔运动的信号传递是多途径的。这个过程涉及到c a 2 + 、鞘氨醇一卜磷酸s l p 、异三 聚体g 蛋白、h 2 0 2 、n o 、胞内p h 、蛋白质磷酸化和去磷酸化反应等。a b a 调节气孔运 动的机理模型如图1 所示。 触狐a 丑嗽印t o r 图1保卫细胞a b a 信号转导模式( 张骁等，2 0 0 1 ) 卜：a c t i v a t i o na n d o rs t i m u l a t i o n ： ：i n h i b i t i o n 5 糟 耋f ， 哦 她 妇 岬 砒 僦 鼠 艘 勖 轴 1 2 4 其它影响气孔运动的因素 湿度降低气孔就会关闭。相对湿度叶片空气压力差或蒸腾作用都能引起环境湿度的 改变。m o t t 等( 1 9 9 8 ) 认为蒸腾作用的加强，减少了保卫细胞可利用的水分，从而降低 了保卫细胞的膨压，使气孔关闭。 生长素能够调节气孔运动，作用效果与植物的种类、生长素的类型和浓度有关( 曹 更生，1 9 9 7 ) 。l 蚣的浓度在1 0 岬o l l 1 0 n l i i l o 儿之间，均可刺激气孔开放；而n a a 浓度 为5 p m o l l 时，即可有效地刺激气孔开放，但当浓度达到0 5 m m o l l 时，则抑制气孔开放。 r a 曲a v e n d r 瘌b h a s k a r ( 1 9 8 7 ) 研究表明，茉莉酸甲酯( m j ) 可以促进开放气孔的 关闭，该过程受保卫细胞胞质碱化和k + 水平升高的介导。崔香环等( 2 0 0 1 ) 、董发才等 ( 2 0 0 2 ) 以拟南芥叶片下表皮为材料对m j 在气孔关闭过程中h 2 0 2 和c a 2 + 的作用研究表 明：h 2 0 2 和c a 2 + 是诱导气孔关闭过程中的中间成分。浓度在1 0 7 到l o 。m o l l 的m j 处理均 能促进拟南芥叶片气孔的关闭，其中1 0 巧m o l l 是最适浓度。 1 3气孔运动调控 1 3 1 气孔的开放 调节保卫细胞质膜质子泵活性可诱导气孔开放。调控质子泵的因素有很多，如植物 激素、红光( s 删，1 9 8 8 ) 、蓝光( a s s m a n n ，1 9 9 5 ) 等。1 4 3 3 蛋白可以直接结合 在质子泵c 末端形成复合体并激活质子泵( j a l l n 等，1 9 9 7 ) 。植物质膜h + a t p 嬲e 在体内 能被壳梭孢菌素所活化( d eb o e rb ，1 9 9 7 ) 。壳梭孢菌素可以稳定1 4 3 3 蛋白与质膜 h + a t p a s e 的结合，进而改变质膜h + a t p 嬲e 构型而使其活性增强( b 砌s g a a r d 等，1 9 9 8 ) 。 p p l p p 2 a 磷酸酶的抑制剂可抑制蓝光依赖的质子泵活性并抑制光诱导的气孔开放。 说明p p l p p 2 磷酸酶在光诱导的气孔开放过程中起促进作用( 鼬n o s h i t a 等，1 9 9 7 ) 。内向 整流钾通道k + i n 在气孔开放过程中使k + 内流，胞外环境酸化可激活保卫细胞k + i n 通道。 p p l p p 2 a 磷酸酶也是k ，i n 通道的正调控因子。其抑制剂抑制k + i n 通道的活性( 1 1 1 i e l 和 b l a t t ，1 9 9 4 ) 。次亚麻油酸( 1 i n o e l e m ca c i d ) 、花生四烯酸( a r a 出d o n i ca c i d ) 可以激活 k + i n 通道并抑制外向钾通道k ，o 吡，从而促进气孔开放( l e e 等，19 9 4 ) 。 1 3 2 气孔的关闭 质膜h + a t p a s e 的活性可被钒酸钠、d c c d ( 二环己碳二亚胺) 、d e s ( 己烯雌酚) 6 和曙红b 等抑制( b r i s k i n ，1 9 9 0 ；s o i l l i i l a r i n 等，1 9 8 5 ) 。钒酸钠是质膜质子泵的专一性抑 制剂，强烈抑制a t p a s e 的水解活性。a b a 抑制蓝光依赖的质子泵的活性。 细胞内可溶性钙抑制k + i n 的活性降低k + 的吸收，在蚕豆保卫细胞中， c a 2 + 。y t 为1p m 时k + i n 通道活性基本被完全抑制( s c h r o e d e r 和h a 酉w a r a ，1 9 8 9 ) 。钙调磷酸酶p p 2 b 是一 类钙依赖的蛋白磷酸酶，其抑制剂可以在胞内钙升高的情况下保持k + i n 通道的活性，这 表明p p 2 b 是k + i n 通道的负调控因子抑制气孔开放( h e y 等，1 9 9 7 ) 。c d p k ( 钙依赖的蛋 白激酶) 可以对拟南芥k + i n 通道家族中的k a t l 进行磷酸化，抑制其介导的钾电流，由此 推断，c d p k 对k + i n 通道有负调控作用( l i 等，1 9 9 8 ) 。在a b a 信号通路中，p l c ( 磷脂 酶c ) 使p 3 ( 肌醇三磷酸) 产生，i p 3 动员细胞内钙到胞质，【c a 2 + 】。y t 升高抑制k + i n 通道活性 诱导气孔关闭。t u c k e r 等( 1 9 9 4 ) 观察漂浮于a b a 溶液的鸭跖草表皮条的气孔运动， 发现在光下，随着外源a b a 浓度增加，气孔开度相应变小，在1 0 母1 0 “m 0 1 l a b a 范 围内，这种效应表现为线性。 1 4 保卫细胞信号转导 细胞信号转导是指偶联各种胞外信号与其相应生理反应之间的一系列分子事件。细 胞信号转导包括信号分子与细胞表面受体结合、跨膜信号转换、胞内信号传递和细胞生 理响应四个环节，植物保卫细胞胞内信号传递通过多个信号转导途径形成的复杂的信号 转导网进行，其中的信号分子及信号转导途径间存在广泛的“交谈 ( c r o s st a l k ) ( 欧阳 五庆，2 0 0 6 ) 。当外部信号作用于保卫细胞时，首先被保卫细胞质膜上的受体所感受， 通过转导，信号转变为保卫细胞生理生化机制接受的内部信息一第二信使( 如c a 2 + ，口3 等) ，并激活多种离子通道和生理生化代谢相关的酶类。 1 4 1 异三聚体g 蛋白偶联信号途径 拟南芥中m 基因g 尉j 突变后，a b a 不能抑制其突变体印a j 保卫细胞内向k + 通 道的活性，不能抑制气孔开放，也不能激活阴离子通道，且这种突变体水分丧失程度远 高于野生型，说明g 0 【亚基在a b a 抑制气孔开放中起着重要作用，同时也为g 蛋白介 导气孔运动过程提供了直接证据( w a n g 等，2 0 0 1 ) 。杨树叶片保卫细胞的实验表明：霍 乱毒素( c t x ，g 蛋白0 【亚基激活物) 能促进气孔关闭，作用强度随c t x 浓度的增加而 增强。伴随着气孔关闭，保卫细胞液泡和细胞质中的k + 、c l 含量都明显下降，而细胞 壁中的k + 、c l 含量增加。这提示g 蛋白可能通过对保卫细胞内k + 、c l 。的调节作用而参 7 与了气孔运动过程( 周晓阳等，2 0 0 4 ) 。c o u r s o l 等( 2 0 0 3 ) 报道a b a 可以刺激保卫细胞 鞘氨醇1 磷酸激酶s l p k 活性进而形成鞘氨醇1 磷酸s 1 p ，s 1 p 既能促进气孔关闭，也 能抑制气孔开张，但即0 c j 突变体保卫细胞对s l p 这种效应同样不敏感。他们同时报道 了s l p 可以阻断野生型保卫细胞k + 流，刺激s 型阴离子通道，然而这些效应在聊j 突 变体保卫细胞中均被削弱，这个结论说明g 蛋白在a b a 信号转导途径中位于s 1 p 的下 游。 胞外钙调素( e x t c 洲) 可以促进蚕豆保卫细胞【c a 2 + c y t 升高以及气孔关闭，该效应可 以被p t x 削弱，但可被霍乱毒素c t x 增强，说明g 蛋白可能介导了e x t c 枞通过调节 蚕豆保卫细胞 c a 2 + 。叭而促进气孔关闭。类似于蚕豆保卫细胞，e x t c a m 同样可以诱导野 生型拟南芥气孔关闭，但即仅j 没有表现出该诱导效应。而在a 亚基过表达拟南芥中， e x t c 捌可以更加迅速诱导气孔关闭。结合药理学实验结果以及遗传学证据表明，g 蛋 白作为保卫细胞响应e x t c a m 的一个正调节子而发挥作用( c h e i l 等，2 0 0 4 ) 。研究还发现 g 蛋白为保卫细胞h 2 0 2 合成所必需。c t x 可以促进蚕豆保卫细胞内h 2 0 2 的生成，并且 c t x 诱导的气孔关闭作用可以被n a d p h 氧化酶抑制剂的黄素类似物d p i ( d i p h e i l y l e l l e i o d o 曲盯n ) 和过氧化氢酶c a t ( c a t a l a s e ) 阻断，印a j 突变体保卫细胞所含h 2 0 2 水平较 野生型更低，并且用e x t c a m 处理不能增加保卫细胞内h 2 0 2 水平，而野生型保卫细胞 在处理5 分钟后h 2 0 2 浓度水平显著增加，说明g 蛋白可能位于h 2 0 2 的上游并促进气孔 关闭。a b a 和细胞外c a m 不能诱导异三聚体( 瓶蛋白亚基缺失突变体印a j j 、g 粥j 2 气孔关闭，而能诱导g a 超表达株系w g 仅、c g 仅气孔快速关闭，说明c 瓶介导了a b a 和 细胞外c a m 诱导气孔关闭的过程( 吕品，2 0 0 5 ) 。 1 4 2r o s 信号通路 日益增多的证据表明，a b a 能够诱导r o s 的产生。在a b a 诱导的拟南芥保卫细 胞气孔关闭过程中，a b a 能够诱导细胞快速产生h 2 0 2 ，用l “ma b a 处理能够使h 2 0 2 的产生量增加3 6 8 ，而5 0 “m a b a 能够使h 2 0 2 增加4 9 ( p e i 等，2 0 0 0 ) 。m u r a t a 等( 2 0 0 1 ) 和z h a i l g 等( 2 0 0 1 ) 也观察到了类似的结果。长时间用a b a 处理也能导致玉米苗和水稻 根中积累r o s ( l i n 和k a o ，2 0 0 1 ；j i a i l g 和z h a n g ，2 0 0 2 ) 。这些结果说明，a b a 诱导 h 2 0 2 产生可能是a b a 信号途径中的重要事件之一。 p u r o h i t 等首先发现0 2 一可促进气孔的关闭，是由于改变了质膜的流动性( p u r o h i t 和 h l m e r ，1 9 9 4 ) ；外源低浓度h 2 0 2 ( 1 0 弓m o l l ) 处理可引起胞内游离c a 2 + 浓度的增加( p r i c e 和t a y l o r ，1 9 9 4 ) ，从而导致气孔关闭。而e g t a 对高浓度h 2 0 2 ( 1 0 巧m o l l ) 引起的气 孔关闭则没有影响。说明在高浓度h 2 0 2 情况下，不是通过c a 2 + 信号系统，而是通过影 响质膜氧化还原状态，或者是膜的生物物理状态促进气孔的关闭；低浓度h 2 0 2 作用下， 则可启动c a 2 + 信号系统。 p e i 等( 2 0 0 0 ) 研究发现h 2 0 2 可通过激活质膜c a 2 + 通道而参与a b a 诱导的气孑l 运动 过程。利用激光扫描共聚焦技术的研究结果表明a b a 可诱导蚕豆气孔保卫细胞h 2 0 2 的产生( 苗雨晨等，2 0 0 0 ；张晓等，2 0 0 1 ) 。k + 通道存在于保卫细胞质膜上，k + 流出和溶 质丧失会引起膨压降低，导致气孔关闭( s c h r o d e r 和f a l l g ，1 9 9 1 ) ? 安国勇等( 2 0 0 0 ) 用膜 片钳全细胞记录技术进一步研究证明了h 2 0 2 之所以能促进气孔关闭，是因为它抑制了 保卫细胞质膜内向k + 通道。近年来，h 2 0 2 作为植物中可能存在的信号分子的研究已倍 受关注，尤其是保卫细胞h 2 0 2 信号分子的研究将为气孔保卫细胞信号转导提供一个新 的模式。 在a b a 诱导下，r o s 的来源一直存在争议。叶绿体、线粒体、过氧化物酶体、质 膜n a d p h 氧化酶、细胞壁过氧化物酶和质外体胺氧化酶等都可产生r o s 。己经证实， a b a 能够通过质膜n a d p h 氧化酶产生r o s 。除n a d p h 氧化酶外，细胞壁n a d h 过 氧化物酶、胺氧化酶以及叶绿体中的光反应也可能在a b a 诱导的r o s 产生中起作用 ( “n 和k a o ，2 0 0 l ；z h 锄g 等，2 0 0 1 ) 。 1 4 3 质膜c a 2 + 通道与气孔运动 p e i 等( 2 0 0 0 ) 在拟南芥保卫细胞质膜上检测到了c a 2 + 通透的通道电流，该电流能被 a b a 和h 2 0 2 激活。a b a 可诱发h 2 0 2 的产生，如果用抑制剂抑制h 2 0 2 的产生，a b a 激活 的c a 2 + 通道电流也会受抑制，这表明h 2 0 2 是a b a 和 c a 2 + 】c y t 升高的中间信使。h 2 0 2 激发 的c a 2 + 通道介导c a 2 + 跨膜内流，并且使 c a 2 + 】。y t 升高，这可能是气孔关闭的重要原因。 k o l l l e r 等( 2 0 0 3 ) 认为p e i 等记录的全细胞c a 2 + 电流和h 锄i l t o n 等记录的单通道c a 2 + 电流 具有相似的特征，这两种c a 2 + 通道都有较强的电压依赖性，电位低于1 0 0m v 时激活， 并且都通透b a 2 + 和c a 2 + 。k 0 h l e r 等( 2 0 0 3 ) 还研究了h 2 0 2 和a b a 对保卫细胞离子通道作 用时的异同之处，h 2 0 2 和a b a 都激活相同的c a 2 + 通道，作用方式也相似，但h 2 0 2 和a b a 对k + 通道作用也有不同，由此他们提出，c a 2 + 通道是h 2 0 2 和a b a 作用的共同位点，而 h 2 0 2 和a b a 的信号途径不同，但最终都调节气孔运动。最近k w a l ( 等( 2 0 0 3 ) 报道，在 n a d p h 氧化酶缺失的突变体保卫细胞中，a b a 诱导的气孔关闭受到减弱，外源h 2 0 2 能 9 够激活n a d p h 氧化酶缺失的突变体保卫细胞的c a 2 + 通道，引发气孔关闭，从而进一步表 明活性氧在a b a 诱发气孔关闭中是有作用的。 除了h 2 0 2 和a b a 可激发质膜c a 2 + 电流外，病原激发子也可激发c a 2 + 电流，而且还会 引起 c a 2 + 】。y t 升高，引发气孔关闭( 2 0 0 2 ) 。在胞外c a 2 + 的参与下，病原激发子可引起胞 质c a 2 + 振荡。加入a b a 可阻止病原激发子引起的胞质c a 2 + 振荡，这与a b a 引发的c a 2 + 振荡不同。u s e n e 群( 2 0 0 2 ) 据此认为，病原激发子和a b a 都能激发c a 2 + 内流，引起 气孔关闭，但两者的c a 2 + 信号途径不同。 a 1 1 e i l 等( 1 9 9 9 ) 和e v a l l s 等( 2 0 0 1 ) 用c a 2 + 指示剂c 锄e l e o n 研究拟南芥保卫细胞胞 内c a 2 + 振荡( c a l c i u mo s c i l l a t i o n ) 信号时发现，胞外c a 2 + 可引发胞内c a 2 + 振荡，导致气孔关 闭；对于拟南芥v - a t p 嬲e 突变体比乃的保卫细胞，胞外c a 2 + 可引起 c a 2 + 】c y t 升高，但不能 促使气孔关闭。灿l e i l 等( 2 0 0 1 ) 进一步研究c a 2 + 振荡和气孔关闭的关系时，提出 c a 2 + 】哪 引发气孔关闭有两种机制：一种是当【c a 2 + c y t 升高时，短期的“钙反应活性 ( c a l c i u m r e a c t i v e ) 很快发生而引起气孔关闭；另一种长期稳态的关闭则认为是由一定频率、间期、 大小、波峰数的c a 2 + 振荡形成的“钙编程( c a l c i u mp r o 黟a m m e ) 。总之，各种刺激会引 发质膜c a 2 + 通道开放，从而引起 c a 2 + 。y t 振荡，进一步调节胞内反应，引发气孔运动。 2植物细胞中的钙及钙通道 2 1植物细胞中的钙 在植物细胞内c a 2 + 呈区域化分布，质膜、液泡膜上都存在跨膜的钙离子电化学梯度。 这种梯度分布在静息状态下是相对稳定的，受到刺激时会发生变化。这种梯度正是钙信 号产生的基础( 孙大业等，2 0 0 1 ) 。 在正常生理条件下， c a 2 + 。y t 维持较低水平，约为1 0 0 2 0 0 姗o l l ( r u d d 等，1 9 9 9 ) 。 质外体浓度比胞质高出2 4 个数量级，这一梯度由a t p 水解释放的自由能维持( 孙大业 等，2 0 0 1 ) 。液泡、内质网、线粒体和叶绿体内都有钙存在，都可称为胞内钙库( b u s h ， 1 9 9 5 ) ，其中液泡是植物细胞内最主要的钙库( s a i l d e r s 等，1 9 9 9 ) ，其游离钙离子水平约 为1 0 3 m o l l ( 孙大业等，2 0 0 1 ) 。 当胞质钙浓度增加时，c a 2 + 可以通过质膜上的钙通道流入胞质，也可通过胞内钙库 的释放进入胞质，胞质钙浓度迅速升高，胞质中c a 2 + 可通过质膜上的c a 2 + a t p a s e 被泵出 细胞外，也可通过液泡膜上的c a 2 + a t p a s e 和h + c a 2 + 反向转运体收回到钙库中去，从而 l o 使细胞质中的c a 2 + 浓度恢复到正常水平( y a n g 等，2 0 0 4 ) 。 2 2 钙信号概述 钙是植物所必需的二价阳离子，在维持细胞壁及细胞膜的稳定性方面起着举足轻重 的作用，同时也对各类无机及有机阴离子进行电荷平衡，特别是在植物细胞信号转导过 程中起着胞内第二信使的作用( m a r s e h n e r ，1 9 9 5 ) 。 钙信号可以广泛地对外界生物或非生物刺激作出反应。可以引起钙变化的刺激有： 红光、a b a 、赤霉素、高盐、干旱、渗透处理、触摸、活性氧、冷刺激和热刺激，病原 物及结瘤因子( s a n d e r s 等，1 9 9 9 ) 。外界刺激大多引起 c a 2 + c y t 升高。外界刺激可以特 异性地引起c a 2 + 浓度的变化， c a c y t 的变化作为胞内信号作出的反应，对不同的刺激作 出不同的反应以引发下游的生理生化反应。这种特异性体现在亚细胞钙信号定位、钙信 号动力学特征及胞内钙浓度的变化幅度等( r u d d 等，2 0 0 1 ) 。在钙信号特异性方面研究 最深入的是钙峰和钙振荡。c a 2 + 通过各类膜上的钙通透性通道从胞外及胞内钙库进入胞 质是细胞内c a 2 + 信号的主要来源( s a n d e r s 等，1 9 9 9 ；w h i t e 和b r o a d l e y ，2 0 0 3 ) 。 2 3植物细胞钙通道 钙通道，也称钙通透性通道，即介导c a 2 + 跨膜流动形成c a 2 + 信号的通道。在植物细 胞质膜及内膜上都发现了钙通道，按其对电压的依赖性可分为去极化激活( d a c c ) 、 超极化激活钙通道( h a c c ) 及非电压依赖型钙