（法医学专业论文）疑难降解检材dna检验方法研究.pdf

疑难降解检材d n a 检验方法研究 摘要 目的：本论文以陈旧骨骼、牙齿及福尔马林固定石蜡包埋组织中残留的少量 降解的核酸分子作为研究对象，利用多种技术方法，比较并建立适合降解检材的 提取技术方法。并将建立的方法应用于其他案件中常见微量降解的检材；对骨骼、 牙齿、福尔马林固定石蜡包埋组织及其他疑难降解检材中没有得到完整s t r 分 型的，应用m i n i f i l e r t m 试剂盒进行检验，并评估m i n i f i l e r t m 试剂盒在疑难降解 检材s t r 分型中的法医学应用价值。 方法：选取1 0 例已知检验结果的骨骼和牙齿样本，分别用不同脱钙、不同裂 解液、不同纯化的方法进行实验并比较；在此基础上改进并建立骨骼提取的方法； 并应用建立的方法对2 4 例案件中骨胳样本进行检验。 选取1 0 例医院病理科收集的福尔马林固定石蜡包埋组织，经不同的脱蜡温度 和脱蜡时间预处理后提取石蜡包埋人体组织中的d n a 进行复合扩增检验，比较 不同预处理方法对d n a 提取效果的影响；选取经上述预处理后效果最优的一组 分别采用有机法和c h e l e x 1 0 0 法进行提取，比较两种方法的提取效果；将1 0 例石 蜡包埋组织得到的分型结果与相应的血样d n a 进行比对，观察癌组织基因突变 对p c r 反应及结果分析的影响。 对1 3 例其他疑难降解检材，包括现场血迹、毛发、口香糖、烟蒂等采用 m i n i f i l e r t m 与i d e n t i f i l e r t m 试剂盒进行检验，并对两种试剂盒的检测灵敏度进行比 较。 结果：用于比较研究的1 0 例骨骼和牙齿样本经过预脱钙后的检验结果明显优 于未脱钙的结果：o e b 与异硫腈胍裂解液( g u s c n 裂解液) 消化的能力无显著 性差异；使用q t a q u i c ks p i nc o l u m n 纯化柱的检验较m i c r o n c o n l 0 0 有明显优势。 建立了o e b 混合液裂解联合q i a q u i c ks p i nc o l u m n 纯化骨骼样本的方法。案件应 用中的2 4 例骨骼和牙齿样本，其中2 3 例的检验均得到1 2 个以上s t r 基因座的结 果，仍有一例无s t r 分型结果。1 0 例福尔马林固定石蜡包埋组织，室温中时间分 别为2 、1 2 b 时2 次脱蜡与3 7 一次脱蜡1 0 r a i n 组得到的分型图谱没有明显差异， 而3 7 分2 次脱蜡，时间分别为2 、1 2 小时组得到的分型图谱峰高值均好于前两组， 脱蜡均较彻底。1 0 例样本经有机法提取q t aq u i c k 纯化柱纯化组，有9 例均得到完 整s t r 分型结果，仅有1 例得到部分基因座的分型结果：而经c h e l e x 1 0 0 法提取组 无1 例得到s t r 分型结果。癌组织的基因突变会使s t r 分型结果发生改变，本文 1 0 例癌组织石蜡切片发现存在嵌合、等位基因丢失、峰高不均衡等现象。采用 m i n i f i l e i t m 与i d e n t i f i l e r r u i 劫u 盒对1 3 例其他疑难降解检材检验的结果显示：1 3 例其他疑难降解检材采用i d e n t i f i l e r t m 试剂盒的检验，在未定量的情况下经过1 m 、 2p l 、4p l 梯度扩增，1 3 例无1 例获得完整分型，片段长度在2 0 0 3 7 0 b p 范围内的基 因座均有不同程度的等位基因缺失；而采用m i n i f i l e r t m 试剂盒补充检验均获得完 整分型。采用对照样本d n a 9 9 4 7 对m i n i f i l e r t m i 式齐u 盒和l d e n t i f i l e r t m i , 式剂盒灵敏 度检测发现，m i n i f i l e r t m 试剂盒可以达到0 0 1 n g ，而l d e n t i f i l e r t m 试剂盒可以达到 0 0 8 n g 。 结论：本文建立的o e b 混合液裂解联合q t aq u i c ks p i nc o l u m n 纯化骨骼样本 的方法稳定高效，可用于陈旧骨骼及牙齿样本的d n a 检验：在福尔马林固定石 蜡包埋组织d n a 的提取过程中，适当的增加温度、延长脱蜡时间、有机法提取 联合q t aq u i c k 纯化柱纯化的方法均可以提高d n a 的检验成功率；在其他疑难降 解检材的研究中，m i n i f i l e r t m 试剂盒作为i d e n t i f i l e r t m 试剂盒检验之后的补充手段 可以提高降解检材的检验成功率，适合应用于法庭科学实际检案中降解检材的检 验鉴定。 关键词：硬组织；石蜡包埋组织；降解d n a ；d n a 提取方法比较；短串联 重复序列( s t r ，m i n i s t r ) ； a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t ot a k ed e g r a d e dd n ar e m a i n si nt h ea g e db o n e s 、t e e t h 、f o r m a l i n f i x e da n dp a r a f fi ne m b e d d e dt i s s u e s ( f f p e t ) a st h er e s e a r c hs u b j e c t ，a n da d o p t sa n d c o m p a r e sd i f f e r e n tt e c h n i q u e sa n dm e t h o d st of i n das u i t a b l em e t h o df o rd e g r a d e d s a m p l ee x t r a c t i o n i na d d i t i o n ，m e t h o d sf o re x t r a c t i n go t h e rc o m m o nm i c r od e g r a d e d s a m p l e sw i l lb ee s t a b l i s h e da n dt h ea p p l i c a t i o nv a l u eo fm i n i f i l e r t mk i ti ns t r p r o f i l eo fd e g r a d e ds a m p l e sw i l lb ea p p r a i s e d m e t h o d ：1 0s a m p l e sw i t ht e s tr e s l t l t sh a v eb e e ns e l e c t e d ，a n dd e c a l c i f i c a t i o n e f f e c t ，d i g e s t i v ea b i l i t yo fd i f f e r e n tl y s i sb u f f e ra n dd i f f e r e n tp u r i f i c a t i o nm e t h o d so f e a c hs a m p l eh a v eb e e nc o m p a r e dr e s p e c t i v e l y a ne f f e c t i v ee x t r a c t i o nm e t h o df o r o e b l y s i sb u f f e ro r g a n i c a l l ye x t r a c t e dt oa s s o c i a tw i t hq i aq u i c ks p i nc o l u m nh a s b e e ne s t a b l i s h e da tt h i sb a s i s ，a n dt h i sm e t h o dh a sb e e na p p l i e dt o2 4b o n es a m p l e s w es e l e c t e d1 0s a m p l e so ff f p e tf r o mt h eh o s p i t a l s ；t o o kt h es a m p l e sa f t e rd i f f e r e n t p r e t r e a t m e n tf o rm l a l t i p l e x p c rt e s t st o c o m p a r e t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n t p r e t r e a t m e n tm e a s u r e so nd n ae x t r a c t i o n ； s e l e c t e dag r o u po fs a m p l e sa n d e x t r a c t e dd n af r o mt h et w os a m p l e sw i t ht h eo r g a n i cm e t h o da n dc h e l e x 一1 0 0 m e t h o dr e s p e c t i v e l ya n dc o m p a r e dt h er e s i ，t l t sg e n e r a t e db yt h et w om e t h o d sa sw e l l a st h ed n ao ft h et w os a m p l e s ；o b s e r v e dt h er e s p o n s eo fg e n e t i cm u t a t i o no fc a n c e r t i s s u e so np c ra n di n f l u e n c e so nt h er e s u l ta n a l y s i s c o m p a r e dt h et e s t i n gr e s l , t l t so f m i n i f i l e r t ma n di d e n t i f i l e r t mk i t si n1 3g e n e r a l q u a n t i t yb i o l o g i c a ls a m p l e s ， i n c l u d i n gb l o o ds t a i n s ，s p e r ms t a i n s ，t i s s u e s ，b o n e sa n ds oo n m e a n w h i l et h e s e n s i t i v i t yo ft h e s et w ok i t sw e r ea l s oc o m p a r e d r e s u l t ：i t sp r o v e dt h a tt h er e s u l t sw i t hp r e - d e c a l c i f i c a t i o na r eo b v i o u s l yb e t t e r t h a nt h o s ew i t h o u td e c a l c i f i c a t i o n ；t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo fd i g e s t i v e a b i l i t i e sb e t w e e no e ba n ds i l i c a - b a s e dm e t h o dl y s i sb u f f e r ；t h et e s to fu s i n gq t a q u i c ks p i nc o l u m nh a so b v i o u sa d v a n t a g eo v e rm i c r o n c o n1 0 0 a l lo ft h e2 3b o n e s a m p l e sa p p l y i n gt h en e wm e t h o dh a v eb e e ne x a m i n e db yo v e r1 2s t rl o c u s ，f r o m t h e2 3b o n e sa n dt e e t hs a m p l e s ，w ea c q u i r e do v e r1 2s t rg e n e t i cl o c u sr e s p , l t s ；w e t o o k1 0s a m p l e s ，t h ep r o f i l ep a t t e r n so ft h es a m p l eg r o u p st h a tw a sd e w a x e df o r2 t i m e sf o r2a n d1 2h o u r sa tr o o mt e m p e r a t u r eh a v en od i f f e r e n c ef r o mt h a to ft h e 1 0 m i ng r o u pd e w a x e da t3 7 。c ，w h i l et h ep e a kv a l u ei np r o f i l ep a t t e r no ft h es a m p l e d e w a x e d2t i m e sa t3 7 ca r eb e t t e rt h a nt h er e s u l t sa b o v e 2 ，w h i c hm e a n st h a tt h e s a m p l e sd e w a x e d2t i m e sa t3 7 。ca x ed e w a x e dm o r et h o r o u g h l y a f t e rq t aq u i c k p u r i f i e r sa r ee x t r a c t e dw i t ht h eo r g a n i cm e t h o d ，9o ft h e1 0s a m p l e sg o tc o m p l e t es t r r e s u l t sa n do n l y1s a m p l eg o tm e r e l yp a r to ft h eg e n e t i cl o c u sp r o f i l er e s u l t u s i n g c h e l e x 1 0 0m e t h o d ，n o n eo ft h e1 0s a m p l e sg o ts t rp r o f i l er e s u l t s w ea l s o c o n c l u d e dt h a tt h eg e n e t i cm u t a t i o no fc a n c e rt i s s u ew i l la l t e rt h er e s u l to fs t rp r o f i l e ， s i n c ew ef o u n dr e c o m b i n a t i o n ，l o s so fa l l e l e s ，a n du n b a l a n c e dp e a kv a l u ei nt h e1 0 p a r a f f i ns e c t i o ns a m p l e so fc a n c e rt i s s u e ；c o m p a r e dt h et e s t i n g r e s u l t so fm i n i f i l e r k i ta n di d e n t i f i l e r t mk i ti n1 3s a m p l e s c o n c l u s i o n ：w i t hi t ss t a b i l i t ya n de f f i c i e n c yt h i sm e t h o di sa p p l i c a b l et ot h e d n at e s to fs a m p l e s p r o p e r l ya d o p t i n gt h e s em e t h o d s r a i s i n gt e m p e r a t u r e ， p r o l o n g i n gt h et i m eo fd e w a x i n g ，o rc o m b i n i n go r g a n i ce x t r a c t i o n w i t hq t aq u i c k p u r i f i e rm e t h o d c a na l li m p r o v e t h es u c c e s sr a t eo fd n at e s t t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h em i n i f i l e r t mk i tc a nm a r k e d l yi m p r o v et h et y p i n gs u c c e s sr a t eo f d e g r a d e db i o l o g i c a ls a m p l e s ，a n di ss u i t a b l ef o ra n a l y z i n gd i f f i c u l tb i o l o g i c a ls a m p l e s i nf o r e n s i cp r a c t i c e k e y w o r d s ：h a r dt i s s u e s ，f o r m a l i n f i x e da n dp a r a f fi ne m b e d d e dt i s s u e s ( f f p e t ) d e g r a d e dd n a ：c o m p a r a t i v eo fm e t h o d sf o re x t r a c t i o no fd n a ；s h o r t t a n d e mr e p e a t s ( s t r ，m i n i s t r ) 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引 用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其它学位申请的论文或成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： 1 、交回学校授予的学位证书； 2 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报： 3 、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道 歉； 4 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名：邀毫 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位 仍然为山西医科大学。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：友蠡 指导教师签名： 日期：銎翌窆年月芷日 日期：年月二日 ( 本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用) 山西医科大学硕士学位论文 刖茜 1 j o 法医物证检验鉴定经常会面临各种疑难检材。各类案件或事件现场的法医生物检材， 由于所处环境的温度、湿度、光照、化学及微生物等因素，d n a 分子容易断裂而发生降解， 由于分子变小而导致大片段丢失。因此，高度降解检材d n a 的分型，依然是法医物证工作 者面临的难题与挑战。 骨骼、牙齿等坚硬组织细胞间间质主要由胶原质和羟基磷灰石构成。胶原质由细胞分 泌产生，具有较高的变性温度( 超过9 0 。c ) 和良好的热稳定性【1 】。羟基磷灰石具有表面活性， 结构呈细针状，沿胶原纤维的长轴排列，主要以六方体晶体形态和非晶态形式存在。胶原 质与羟基磷灰石通过钙桥连接形成的嵌合结构具有一定的空间效应【2 1 ，弱碱性条件下d n a 片段带负电，在羟基磷灰石晶体表面可以形成化学吸附，这对d n a 的保存相当有利。一方 面致密结构大大减弱了环境因素和微生物对组织结构的破坏作用，延缓了d n a 的降解过 程；另一方面骨骼羟基磷灰石对d n a 片段具有吸附作用，这种作用使d n a 分子保存时间延 长【3 】。关于骨骼、牙齿d n a 的提取方法国内均有报道，不同点主要表现在：1 部分实验室 会对骨骼、牙齿进行脱钙处理，部分无；2 骨骼取材的部位，部分强调骨松质，部分无具 体说明；3 在提取方法上部分使用有机法提取，部分则采用c h e l e x 1 0 0 法提取；4 纯化方 法有不同。本文进行了骨骼牙齿d n a 不同提取方法的比较，最终确立一种最优方法。 在一些刑事案件中从多年存档的常规福尔马林固定石蜡包埋病理标本中提取d n a 可 以解决在短期内难以搜集到大量有用标本进行尸源认定的难题；同时在众多的医疗纠纷案 件中也需要对当事人血液样本与对应的病理组织切片进行同一认定。但在福尔马林固定过 程中，组织经福尔马林固定后d n a 的嘌呤基之间及碱基与组蛋白之间形成了以福尔马林为 介体的甲基桥，造成d n a 交联，这种交联的d n a 在进行石蜡包埋时容易随机降解，因此从 福尔马林固定石蜡包埋组织中提取较大片段d n a 变得很困难，常常出现d n a 降解，不易获 得大分子量d n a 4 。在石蜡组织初始脱蜡过程中，一是用二甲苯脱蜡要彻底；二是用无水 乙醇脱二甲苯一定要彻底，这两步很关键，否则对之后的水浴消化有很大影响，使其不能 完全消化。本文进行了不同的脱蜡温度和时间处理后d n a 提取效果的比较研究，同时比较 不同提取方法的效果。 第二代微卫星短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t s ，s ag ) 分型技术多用于片段1 0 0 - 4 5 0 b p 长度的d n a ，对于严重降解的样品，其d n a 大部分已经断裂降解，片段长度相对很 小，而s t r 基因座扩增成功率与基因座的等位基因长度成反比，即呈现“d n a 降解曲线”， 大片段s t r 基因座扩增灵敏度降低甚至低于检测域值，导致分型失败，相对短s a g 片段可 以相应地提高降解d n a 扩增成功率【5 】。近年来，法医界掀起m i n i s t r 检验腐败检材在个人 识别中运用的研究热潮。m i n i s t r 技术通过设计更靠近重复序列的引物，得到更短的p c r 产物，从而提高降解和微量检材的d n a 分型的成功率。本文使用的a m p f i s t rm i n i f i l e r t m 试剂盒包含的9 个基因座中，除t a m e l o g e n i n 基因座以外，其余基因座在l d e n t i f i l e r t m 试剂 盒中扩增片段均大于2 c h d b p ，尤其是d 7 s 8 2 0 、d 1 8 s 5 1 、d 1 6 s 5 3 9 、c s f l p o 与f g a 中的大 山西医科大学硕士学位论文 部分等位基因扩增片段均大于2 5 0b p 6 。这些大片段的基因座，对普通的常量检材，扩增 效果尚好，但对于腐败降解的检材，尤其含有较多抑制因素的检材，则常不能成功扩增。 而上述这些大片段基因座( 除f g a 基因座中的延伸等位基因以外) 在m i n i f i l e l 刑试剂盒中的 扩增片段范围为7 4 - - - , 2 4 5 b p ，而且大部分基因座的扩增片段均小于2 0 0 b p 7 】。与i d e n t i f i l e r t m 试剂盒相比较，扩增片段长度缩短的范围在3 3 - 2 0 1 b p ，特别是d 2 s 1 3 3 8 、d 1 6 s 5 3 9 、d 1 8 s 5 1 、 c s f l p o 基因座缩短的片断长度均达到1 5 0 b p 以上，因此使得一些已降解为小片段的d n a 分 子能够成功扩增，从而显著提高降解检材的检验成功率。 本文旨在以陈旧骨骼、牙齿及福尔马林固定石蜡包埋组织中残留的少量降解的核酸分 子作为研究对象，利用多种技术方法，比较并建立适合降解检材的提取技术方法。并将此 方法应用于其他案件中常见的微量降解检材；在其他疑难降解检材的研究中，将m i n i f i l e r t m 试剂盒作为l d e n t i f i l e r t m 试剂盒检验之后的补充手段，以提高降解检材的检验成功率。 2 山两医科大学硕士学位论文 第一部分骨骼及牙齿d n a 提取方法的比较与改进 骨骼或牙齿易受保存时间、保存环境等因素的影响而发生降解，使d n a 的提取成为 d n a 检验的难点之一。本文对d n a 提取方法中脱钙效果、裂解液消化能力及纯化方法进行 了对比研究，根据文献报道的d n a 提取方法【8 】，改良建- 立- t 1 种硬组织d n a 提取方法，并 应用于日常检案，提高了骨骼和牙齿d n a 检验的成功率。 1 材料与方法 1 1 材料与试剂： 实验室主要仪器设备：a b9 7 0 0 型d n a 扩增仪、a b3 1 3 0 x l 遗传分析仪、微量移液 器、小型台式离心机、超纯水器、温浴箱、冷冻研磨机、锯、锤、手术刀片。 实验应用主要试剂：骨骼裂解液o e b ( 1 m o l l i r i sp h 8 0 ，5 m o l l n a c i ，0 5 m o l l e d t a p h 8 0 ，双蒸水) 、g u s c n 裂解液( 主要成分为异硫腈胍) 、蛋白酶k 、d t r 、p r o m e g a 公 司的骨骼裂解液l d e n t i f i l e r t m 试剂盒、m i n i f i l e r t m 试剂盒( a b 公司) ；m i c r o c o n1 0 0d n a 纯 化浓缩柱( m i l l i p o r e 公司) ；q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒( q i a g e n 公司) 。 1 2 样本 选取日常检案中已知结果的骨骼及牙齿样本1 0 例( 骨骼详情见表1 ) ；案件中待检骨 骼及牙齿2 7 例，其发现、受害人失踪或死亡的时问分别为0 5 7 年。发现时尸体( 骨) 环 境有水或粪坑中浸泡、土埋、露天或酸性环境放置等。骨骼多数为棕黄色，部分呈黄褐色。 其中多数完整，1 例有被啃咬痕迹，骨松质缺失，另有一例骨松质呈稀糊状。牙齿的牙根 牙冠完整无损，但牙髓缺失。 1 3 样本预处理 骨骼样本预处理：用手术刀片刮除骨骼表面的污垢，锯取骨干中部一小段并刮除骨松 质，乙醚充分脱脂后，加入5 次氯酸钠溶液浸泡3 0 m i n ，经蒸馏水冲洗干净后用无水乙醇 泡洗去除多余水分，置通风橱中挥发无水乙醇，最后在紫外灯下照射2 0 m i n 。采用液氮研 磨机将检材研磨成粉末。 牙齿样本预处理：用手术刀片刮除牙齿表面的污垢，用小锤砸成碎片，加入5 次氯 酸钠溶液浸泡3 0 r a i n ，经蒸馏水冲洗干净后用无水乙醇泡洗去除多余水分，置通风橱中挥 发无水乙醇，最后在紫外灯下照射2 0 r a i n 。采用液氮研磨机将检材研磨成粉末。 1 4d n a 提取 1 4 1 脱钙方法 各样本分别取研磨后的粉末1 9 于1 5 m l 离心管中，加o 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) l m l ，置 摇床预脱钙2 4 h ，期间每1 2 h 更换一次e d t a 。 1 4 2 裂解方法 ( j ) o e b 裂解液法：脱钙后离心去除e d t a ，加入骨骼裂解液o e b ( 1 m o l l t d sp h 8 0 ， 山西医科大学硕士学位论文 5 m o l ln a c i ，0 5 m o l le d t a p h 8 0 ，双蒸水) 6 3 2 1 t l 、2 0 s d s8 0 i t l 、l m o l ld t r3 2 山、 2 0 m g m l 蛋白酶k5 6 r t l ，5 6 。c 温浴消化1 2 h ，补充1 2 氤j 量的蛋白酶k 和d q t ，再消化4 h 以上。 ( 墓) g u s c n 裂解液法：脱钙后离心去除e d t a ，加入g u s c n 裂解液( 主要成分为异硫腈胍) 6 0 0 1 x l 【2 】，l m o l l d t t 6 0 9 l 、2 0 m g m l 蛋白酶k 6 0 9 l ，以后步骤i 同o e b 裂解液法。 1 4 3 提取与纯化方法 消化结束后，1 3 0 0 0 r m i n 离, 巴, 3 m i n ，取上清液用有机法抽提。纯化方法( d q t aq u i c k p c r 法：( 1 ) 将有机法提取后的上清液与q i a q u i c kp c r 纯化试剂盒中的p b i 溶液按体积比 1 ：5 混匀，然后向纯化柱( q i a q u i c ks p i nc o l u m n ) 中加入适量上述混合液，以1 3 0 0 0 r p m 离 , l 二, l m i n ，弃掉下层液体，重复此操作直到混合液全部滤过。( 2 ) 力n 3 0 0 1 t lp b i 溶液离心洗涤 1 次，加已配无水乙醇的p e 洗涤液，离心洗涤2 次，再以1 3 0 0 0 r p m 离一t m m i n ，甩干残余液 体后把纯化柱放置于新的1 5 m l 离心管上，打开盖子室温挥发5 m i n 。0 ) 将e b 沈脱液3 0 9 l 直接加入到纯化柱的硅膜上，6 5 孵育5 r a i n ，1 3 0 0 0 r p m 离一f f 2 m i n ，收集下层液体用于p c r 反应。( g ) m i c r o c o n1 0 0 法：将有机法提取的上清液加入至l j m i c r o c o n1 0 0 纯化柱中，2 5 0 0 r p m 正向离一t l , 2 0 m i n 后，再将纯化柱取出倒置于一个新的离心管中，3 5 0 0 r p m 离。t 二, 1 0 m i n ，纯化 浓缩至1 0 9 l 。 1 5 样本分组及d n a 提取 将1 0 例骨骼及牙齿样本各分为4 组，用于比较脱钙效果，裂解液消化能力及纯化方法。 1 组：样本按1 4 1 方法进行脱钙，o e b 裂解液法进行骨骼裂解，有机法提取d n a ，q 认 q u i c kp c r 法纯化d n a 。 2 组：样本按1 4 1 方法进行脱钙，g u s c n 裂解液法进行骨骼裂解，机法提取d n a ，q 认 q u i c kp c r 法纯化d n a 。 3 组：样本不经脱钙处理，采用o e b 裂解液法进行骨骼裂解，有机法提取d n a ，q i aq u i c k p c r 法纯化d n a 。 4 组：样本按1 4 1 方法进行脱钙，o e b 裂解液法进行骨骼裂解，有机法提取d n a ， m i c r o c o n1 0 0 法纯化d n a 。 1 6 案例应用样本 案例样本：2 4 例涉及骨骼牙齿案件采用1 组方法进行检验。 1 7p c r 扩增 两种方法均采用2 5 9 l 扩增反应体系。i d e n t i f i l e r t m 试剂盒反应体系包括：m i x b u f f e r l 0 5 1 t l ，引物5 5 i _ t i ，金牌t a g 酶0 5 1 d ，模板d n a 采取1 山、2 9 l 、4 9 l 的梯度扩增， 用去离子水补足体系，热循环参数为：9 5 1 1 r a i n ，9 4 1 r a i n ，5 9 l m i n ，7 2 l m i n ，2 8 次循环，6 0 c 6 0 m i n ，4 c 保温。m i n i f i l e r t m 试剂盒反应体系包括：m a s t e r m i x 反应混合液 4 1 t l ，p r i m e rs e t 引物混合液2 1 t l ，模d n a1 2 m ，用去离子水补足体系，热循环参数为： 9 5 l l m i n ，9 4 2 0s ，5 9 2 r a i n ，7 2 l m i n ，3 0 次循环，6 0 4 5 r a i n ，4 c 保温。 1 8 扩增产物的分离与检测 a b3 1 3 0 x l 遗传分析仪检测扩增产物，g e n e m a p p e r l d v 32 软件对结果进行自动分型。 2 结果 21 不同年代的骨骼或牙齿应用两种裂解方法比较结果 本文应用l 组骨骼裂解液o e b 与2 组g u s c n 裂解液的样本分别提取了1 年、2 年、4 年、7 年陈旧骨骼和牙齿样本的d n a 均得到1 2 个以上s t r 基因座的分型结果，经统计学检验，两 组使用方法效果无显著性差异( 见表1 ，图1 1 ，l 一2 ) 。但其中3 、4 、8 号样本使用o e b 裂解 液检出塑座攀璧竺婴跫懋塑出翌至二一、 围i - 1 使用o e b 裂解液消化裂解后的结果 ：二鲨兰兰兰= 蔓 一f l一一7=-1t_一 圈1 - 2 使用异硫腈胍消化裂解后的结果 _ _ - 表i4 组分别檀出基因座数目的比较 2 2 脱钙与否对骨骼或牙齿样本检验结果的影响 未经预脱钙的3 组，仅保存1 年和3 年的样本得到部分基因座的分型结果，其余均未得 到分型结果。( 见表l ，圉2 1 ，2 - 2 ) r 一一一一 嚣 = = ! 三一j ：蔓= 。_ ；= 1 囤2 i 经过脱钙处理后的结果 ! 一 一毒 一一，一 薹一 ! _ 二f ：姜 ：一一 。? 一f ”五二二= 二；二? 二二三二x 二! ! e = 王! j = 旦一 一i k，。，。，。 一_ ，? 竺= 一i f ，。卑：譬虻= j = ! 赞= c = 兰! k 二j l 竺望= j 二二【二：土一 -l_?j ”。1 = = 一= f 一 二厂一 兰三兰二3 1 二二二z ! 二三二至= 三二 一 ? ? p 一。i 3 ；亍i 。i 哥i 2 一 ：f - l 一 田2 五未经过脱钙处理的结果 2 3 不同纯化方法对骨胳或牙齿样本检验结果的影响 使用m i c r o n c o n1 0 0 纯化法的4 组，l o 份样本均未得到$ t r 分型( 见表1 ) 。 2 4 与传统硅珠法比较结果 用1 组结果与刘雅诚等【9 报道的硅珠法所得到的结果进行比较( 检材相同) ，其中2 、3 、 9 、1 0 号样本应用1 组方法提取后分型结果优于硅珠法，6 号样本应用硅珠法仅得到线粒体 测序结果。而1 组方法提取后得到了全部s t r ：舟型结果，9 、1 0 号样本应用硅珠法没有得到 分型结果，而1 组方法提取后得到了部分基因座的分型结果( 见表2 ) 。 表2 两种方法提取1 0 倒骨骼或牙齿d n a 的s t r 分型结果比较 2 5 案侧检测结果 应用1 组方法检验2 4 例案件中的骨骼或牙齿检材，经过梯度扩增其中有2 3 例得到s t r 分型，其中有8 例得到全部基因座分型结果；有1 5 例得到的分型结果仅有2 3 个基囡座 山西医科大学硕士学位论文 缺失，再经m i n i f i l e 一试剂盒补充检验获得全部1 5 个s t r 基因座的分型；1 例未得到分 型结果。 3 讨论 3 1 骨骼d n a 检验部位的选择 硅珠法选取骨松质作为检验部位1 1 0 ，本方法则全部选用骨密质进行检验。这是因为 骨密质是由骨细胞和钙化的细胞外基质组成，细胞外基质中有大量骨盐沉积，占干骨重量 的6 5 ，结构呈板层状( 骨板) ，同一骨板内的纤维相互平行，相邻骨板的纤维则相互垂直 【1 1 ，1 2 】，这种结构形式使密质骨陷窝中的骨细胞得到有效保护，利于抵抗外界环境因素 的影响【1 3 ，1 4 】。牙齿由牙釉质、牙本质、牙骨质3 种钙化的硬组织和牙髓软组织组成。硬 组织大部分由无机盐构成，其含量分别为9 6 、7 0 和5 5 ，主要成分为磷酸钙和碳酸钙。 牙髓腔内的疏松结缔组织，只占牙体积的一小部分，有血管、淋巴管、神经、成纤维细胞 和成牙本质细胞1 1 5 1 。因此牙齿中的d n a 含量非常少，但由于其细胞成分被牙本质形成的 腔壁所包围，d n a 不易被降解。陈旧骨骼和牙齿样本中d n a 含量低，为了增加提取d n a 的总量，适当增加取材量对成功提取d n a 和s t r 分型是必需的。 案件中陈旧骨骼骨松质或干涸或呈棕褐色，松质网状结构中嵌有大量黑色素颗粒，尤 其在碎尸案中提取的断骨、骨片等可能缺乏骨松质，使取材受到一定限制。骨密质结构非 常致密，且具有一定厚度，可通过增加取材量提高d n a 模板量。因此本文方法选用骨密质 作为检材。但案件中有一例土埋足月婴儿骨骼，选取松质骨的检验结果优于密质骨。因婴 儿处于快速生长期，骨骼干骺端的松质骨中含有大量的成骨细胞，故应选取松质骨作为检 验部位。 3 2 脱钙对于骨骼或牙齿d n a 检验的影响 1 0 例样本经过预脱钙后的检测结果明显优于未脱钙结果。因为骨骼富含c a 2 + 、m 9 2 + 成为细胞间相互粘合及细胞与基质问发生粘合的媒介，其坚硬的结构在保护d n a 的同时也 给细胞的裂解带来困难，e d t a 脱钙液可以将骨组织成分中的钙盐与胶原纤维分离，脱钙 后有助于细胞间的分散 1 6 ，1 7 】，使骨粉变得粘稠细腻。此时加入裂解液，促使裂解液更 好的作用于骨细胞，增) ) h d n a 产量。预脱钙后高速离心，可以将溶液中的c a 2 + 弃去，以免 影响后期p c r 扩增的进行f 1 8 1 。 3 3 骨骼裂解液对d n a 提取效果的影响 结果中1 0 例骨骼样本使用o e b 裂解液与使用g u s c n 裂解液经统计学处理后无显著性 差异，二者对骨骼的消化能力相当。因为o e b 混合液中s d s 及e d t a 协同作用，将组蛋白 从d n a 分子上拉开，破坏细胞膜及核膜，利于d n a 的释放；同时e d t a 螯合二价金属离 子使d n a 酶失活，防i i - d n a 发生降解1 1 9 。高浓度的d 盯和蛋白酶k 的加入更有助于骨骼 的裂解，提高d n a 的提取效率1 2 0 。 山西医科大学硕士学位论文 3 4 纯化方法对骨骼d n a 提取效果的影响 结果显示q i aq u i c ks p i nc o l u m n 纯化柱的纯化效果明显优于m i c r o c o n1 0 0 纯化柱。由于 该纯化柱可有效的吸附1 0 0 b p 1 0 k b i 拘d n a 片段，同时在抽提洗涤过程中将盐、蛋白质等杂 质去除，从而得到高质量的d n a 模板【2 1 】。m i c r o c o n1 0 0 纯化柱有一层能截留大分子d n a ， 而允许小分子物质通过的滤过膜，但滤过膜在去除一些抑制物的同时会损失掉降解为小分 子的骨骼d n a ，降低了骨骼检验的成功率。 3 5 试剂盒的补充检验 本文进行检验的骨骼及牙齿样本由于腐败严重，或含有多种未知杂质等扩增抑制物， 虽然经过各种优化方法，采用目前常用的商品化试剂盒检验，仍不能获得完整s t r 分型。 为了排除模板量不够所致，又加大模板量进行梯度扩增，但结果仍无改善，并且平均荧光 信号强度均较低( 约为2 t x ) r f - u ) ，同时还存在大片段等位基因丢失的现象。这都说明d n a 已发生了严重降解。在使用l d e n t i f i l e r t m 试剂盒扩增时，片短大于2 0 0 b p 的基因座无法得到 完整的s t r 分型，使用m i n i f i l e r t m 试剂盒对这些样本进行再次扩增时，由于m i n i s t r 技术 是在普通s t r 基础上使引物结合区更加靠近核心序列，其所包含的与i d e n t i f i l e r t m 试剂盒中 相同基因座的扩增片段范围缩短到7 4 2 4 5 b p 之问，从而作为补充检验可提高了这些样本 d n a 分型的成功率。m i n i f i l e r t m 试剂盒中的扩增片段范围为7 4 2 4 5 b p ，而且大部分基因 座的扩增片段均小于2 0 0 b p ，因此能在一定程度上克服微量、因降解导致的片段小、含扩 增抑制剂等常见难题，非常容易扩增成功，从而显著提高降解检材的检验成功率【2 2 】。 3 6 案例应用 案件中2