（基础兽医学专业论文）家猫卵巢组织的超低温冷冻保存研究.pdf

捅费 本试验通过两步法、经典法、玻璃冷冻法溶液v s l 和玻璃冷冻法溶液d a p 2 1 3 四 种处理冷冻保存了5 0 只家猫的卵巢皮质薄片。通过对新鲜和冷冻复苏后的卵巢组织 进行组织学观察、电镜观察，分离冷冻后卵巢组织的卵泡进行体外培养并检测培养液 中雌激素水平，从而检验猫科动物卵巢组织在超低温冷冻后是否保存活性，进而选择 一种较为适合猫科动物卵巢组织保存的冷冻方法。 组织学切片显示，四种冷冻处理以玻璃化冷冻法溶液v s i 处理组对卵巢组织、卵 泡正常形态造成的损伤较小。电镜观察可见在冷冻保存后卵母细胞的超微结构如：透 明带、微绒毛、微管和皮质颗粒等受到了不同程度的破坏。 使用酶法结合机械法分离卵泡，平均每只家猫可获得卵泡3 3 7 8 个。用台盼兰死 活染色计算卵泡存活率，两步法、经典法、玻璃冷冻法溶液v s l 和玻璃冷冻法溶液 d a p 2 1 3 四种处理得到的卵泡存活率分别为3 4 5 ，4 0 0 ，5 3 4 和4 7 2 。 经过四种处理冷冻保存的卵巢组织，复苏后分离得到的直径为1 0 0 2 1 0 9 m 的卵 泡3 3 3 个用于体外培养，四种处理后分离的卵泡均保持了继续生长的能力，其中有一 个卵母细胞经体外培养发育并排出第一极体。经两步法、经典法、玻璃冷冻法溶液 v s l 和玻璃冷冻法溶液d a p 2 1 3 冷冻保存后分离得到的卵泡培养4 d 时卵泡退化率为 8 6 8 8 、6 5 6 3 、6 8 4 5 和5 6 8 6 ，四种方法间差异不显著；存活卵泡直径与其开 始培养时相比增长幅度分别为6 7 5 1 a m 、7 3 3 9 m 、8 4 5 9 m 和6 6 8 9 m ，四种方法问差异 不显著。本试验用酶联法测定卵泡体外培养液中1 71 3 e 2 水平，所有样本均有阳性反 应，其中测得三个样本中1 7 b - e 2 含量分别为5 8 8 2p g 5 0 p 、2 9 5 1p g 5 0 9 l 和1 2 9 9 p g 5 0 9 l 。表明四种方法冷冻后的颗粒细胞均具有活性，保持了分泌雌激素的功能。 通过对冷冻后卵巢组织活性的检验，四种方法冷冻保存后的卵巢组织均具有活 性。其中玻璃冷冻法溶液v s l 组冷冻效果较好。 关键词：家猫卵巢组织超低温冷冻卵泡直径雌二醇 标注：本研究由成都大熊猫繁育研究基金会赞助 c r y o p r e s e r v a t i o no fd o m e s t i cc a to v a r i e st i s s u e s w e ij u a n ( f o u n d a t i o nv e t e r i n a r yn e d i c i n e ) d i r e c t e db y ： a s s o c i a t ep r o m ah e n g d o n g a s s o c i a t ep r o h o ur o n g t h e r ea r em i l l i o n so ff o l l i c l e si nt h eo v a r yo fd o m e s t i cc a t b u tal a n en u m b e ro f t h e mu n d e r g oa t r e s i ad u r i n gt h e i rp r e a n t r a ls t a g e ，w h i c hl e a d st oas e r i o u sw a s t eo fg e n e t i c a n d b r e e d i n gr e s o u r c e s t o r i n g m a m m a l i a no v a r i e st i s s u e sw i t h c r y o p r e s e r v a t i o n t e c h n o l o g yc a ne f f e c t i v e l ys o l v et h i sp r o b l e m i ta l s oo f f e r sa ne f f e c t i v em e t h o dt or e t r i e v a l a n du t i l i z e st h e s el a t e n t g e n e t i ca n db r e e d i n gr e s o u r c e so f s o m ee n d a n g e r e ds p e c i e s t h eo b j e c t i v eo ft h i sp a p e rw a st of i n dam e t h o dt os t o r em a m m a l i a no v a r i e st i s s u e s w i t hc r y o p r e s e r v a t i o nt e c h n o l o g y , a sw e l la st od os o m eb a s i cr e s e a r c hf o rp r e s e r v i n gt h e g e n e t i ca n db r e e d i n gr e s o u r c e so fs o m ee n d a n g e r e ds p e c i e s ，s u c h a st h ew i l df e l i da n dt h e g i a n tp a n d a i nt h i sr e s e a r c h ，t h eo v a r i e st i s s u e so fd o m e s t i cc a t sw e r ed e a l tw i t h4d i f f e r e n tk i n d s o f m e t h o d sa n dc r y o p r o t e c t o r s t h em e t h o do f v i t r i f i c a t i o nc o u l ds a v en a t u r a lf o l l i c l e sw i t h f e w e rt r a u m a s a f t e rc r y o p r e s e r v a t i o n ，t h eu l t r a s t r u c t u r e so fs o m ef o l l i c l e sw e r ed e s t r o y e d t h ea v e r a g en u m b e ro fp r e a n t r a lf o l l i c l e s ，c o l l e c t e db yc o m b i n i n ge n z y m ed i g e s t i o n m e t h o dw i t hm e c h a n i c a lt r e a t m e n t sm e t h o d ，w a s3 3 7 8p e rd o m e s t i cc a t t h em e t h o do f v i t r i f i c a t i o nc o u l dk e e ph i g h e rl i v a b i l i t yo ff o l l i c l e sa f t e rc r y o p r e s e r v a t i o nb yj u d g i n gt h e r e s u l to fv i g o r - d y e a l lt h ef o l l i c l e sp r o c e s s e db yt h e s e4d i f f e r e n tk i n d so ff r e e z i n gm e t h o d sp r e s e r v e d t h eg r o w t ha b i l i t yi nv i t r oc u l t u r e o n eo ft h e s ef o l l i c l e sp r o d u c e di t sf i r s tp o l a r d u r i n g c u l t u r ep e r i o d ，t h ed i a m e t e r so ft h ef o l l i c l e sp r o c e s s e db yt h e s e4d i f f e r e n tk i n d so f f r e e z i n gm e t h o d si n c r e a s e dr e s p e c t i v e l yb y6 7 5 p m ，7 3 3 1 t i n ，8 4 5 1 t ma n d6 6 8 p m t h e r e w a sn oo b v i o u sd i f f e r e n c eb e t w e e nt h e m ( p 0 0 5 ) t h ed e g e n e r a t i o nr a t e so fo o c y t e sw e r e r e s p e c t i v e l y8 6 8 8 ，6 5 6 3 ，6 8 4 5 a n d5 6 8 6 ，w i t h o ms i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) e i t h e r t h ea m o u n t so fe s t r a d i o ic o n t a i n e di nt h eu s e dc u l t u r em e d i u mw e r em e n s u r a t e d w i t he l i s am e t h o d a l lt h et e s tr e s u l t sw e r ep o s i t i v e w eg a i n e d3s e t so fd a t a ： 5 8 8 2 p g 5 0 p l 2 9 51p g 5 0 “la n d1 2 9 9p g 5 0 “l t h eo v a r i e st i s s u e sr e s e r v et h ea b i l i t yo f i n c r e t i o na n de x c r e t i n ge s t r a d i 0 1 t h er e s u l t sp r o v et h a ta f t e rc r y o p r e s e r v a t i o nt h eo v a r i e st i s s u e so fd o m e s t i cc a ts t i l l r e s e r v e dt h e i rv i t a l i t y k e y w o r d s ：d o m e s t i cc a t ；o v a r i e st i s s u e s ；c r y o p r e s e r v a t i o n ；d i a m e t e ro f f o l l i c l e ；e s t r a d i o l s p o n s o r e db yc h e n g d ur e s e a r c hf o u n do f g i a n tp a n d a b r e e d i n g 本研究由 成都大熊猫繁育研究基金会 提供资助 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：氮- - 4 矽0 4 年6 月；驴日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：翘贿 皂：陟 肋“年占月毒。日 年月 日 1 前言 1 1 卵巢组织冷冻保存的研究价值和意义 哺乳动物出生前卵巢中存在着数以万计的原始卵泡，但出生后绝大多数的原始卵 泡在卵泡发育的不同阶段中发生闭锁，只有极少数的原始卵泡能发育成熟并最终排 卵。以牛为例，在牛出生时卵巢中有大约1 5 0 ，0 0 0 个原始卵泡，估算其排卵数不会超 过3 0 0 个，其繁育能力的利用是极其有限的。若成年动物发生死亡，其遗传和繁育 资源就得不到利用，将造成更大的浪费。在大熊猫等珍稀野生动物成体的意外死亡后， 如何抢救和保存其遗传和繁育资源也是一个值得研究的问题。 目前比较可行的方法是将这些珍稀动物的生殖腺体和生殖细胞冷冻保存起来。组 织的低温保存是指将活的生物体组织通过特殊的方法冷却至低温( 一般为一1 9 6 。c ) ，并 长期保存，待需要时可将冷冻组织按特殊的方法加热至正常温度，仍可获得具有活性 的生物体组织“1 。冷冻保存成熟的卵母细胞存在一些技术难点。成熟卵母细胞的纺锤 体对温度的变化敏感。低温保护剂和降温过程会增加纺锤体的解聚，进而造成染色体 丢失或不均等分裂，诱发单性尘殖，增加非整倍体发生率”1 。卵母细胞的细胞骨架在 冷冻过程中也会遭到破坏，导致细胞器发生明显改变。这些情况均导致冷冻后的卵母 细胞无法正常受精。即使运用胞浆内精子注射技术( i c s i ) 能使受精率能提高到5 0 6 4 ，仍约有8 8 2 1 的受精卵发育异常，多倍体染色体和异倍体染色体发生率明 显增加。因此i g s i 虽然提高了受精率，但仍不能解决冷冻损伤的问题。再加上妊娠 和生育的概率，卵子冷冻技术总的成功率只有1 左右。由于目前无法获得大量的卵 母细胞，也无法克服卵母细胞冷冻、复苏的技术瓶颈，因此在保存大熊猫等珍惜野生 动物繁育资源的问题上，人们只能寻找一种新的途径，借助于冻存卵巢组织，复苏后 分离卵巢组织上卵泡进行体外成熟和受精的方法来达到保存其遗传和繁育资源的目 的。 本研究的目的是以家猫为实验动物模型建立冷冻动物卵巢组织的方法，为保护其 他珍稀濒危野生动物如野生猫科动物以及大熊猫的遗传繁育资源开展基础性研究。进 一步可通过超低温冷冻保存这些珍稀野生动物的卵巢组织薄片有效地保存其遗传和 繁育资源，为保存物种的多样性提供一条途径。 1 2 卵巢组织冷冻保存研究概况 1 2 1 冷冻卵巢研究的发展 1 9 4 8 年伦敦a u d r e ys m i t h s 实验室首次发现冷冻保护剂甘油，使冷冻移植技 术有了突破性进展。该实验室将甘油作为冷冻保护剂，在一7 9 冷冻兔卵巢，复苏后 植入去势的受体兔，研究发现部分卵巢组织存活并产生了雌激素，使阴道上皮发生了 角质化“1 。1 9 6 0 年p a r r o t 以甘油作为冷冻保护剂，以一7 9 c 冷冻大块的卵巢组织，把 复苏小鼠卵巢组织进行同位移植，产生讵常幼仔。 在此后的3 0 年里在这个领域内没有获得更多的成果。直到2 0 世纪9 0 年代，人 们认识到这项技术在生殖医学领域的巨大发展潜力，才又重新关注这项技术。 1 9 9 4 年g o s d e n 将新鲜及冷冻后的卵巢皮质切片移植给6 只切除卵巢的绵羊使其 生育能力得到恢复，有2 只羊怀孕，产下2 只健康子代羊。其中一只为冷冻后卵巢组 织正常排卵产生的后代。同时几乎所有移植组织块均有正常卵泡发育，由此证实了 冷冻卵巢组织可保存大型哺乳动物的卵巢生育力。此后，g o s d e n 对自体冷冻移植卵 巢组织动物的动情周期进行了研究，发现冷冻移植组除血清促性腺激素( 如f s h ) 和a 抑制素水平低外，动情周期及内分泌指标与对照组无区别，血清中雌二醇和黄体酮水 平也正常，由此证实了冷冻后的卵巢组织能恢复生理功能。 s a l l e ( 1 9 9 8 ) 使用二甲基亚砜( d m s o ) 作为保护剂冷冻绵羊卵巢组织，进行自 体移植，各级卵泡无损伤“1 。g u n a s e n a ( 1 9 9 7 ) 和a u b a r d ( 1 9 9 8 ) 报道用d m s o 或乙 二醇作为保护剂冷冻小鼠”1 和w i s t a r 大鼠。1 卵巢组织后，白体移植均得到幼仔。g o o k ( 2 0 0 1 ) 等用甘油和蔗糖冷冻人类卵巢组织，异种移植至s c i d 小鼠肾脏被膜下，2 0 周后组织学观察到冷冻后的原始卵泡发育到有腔卵泡。1 。 l i u ( 2 0 0 1 ) 等人将冷冻后的新生小鼠卵巢组织移植给同系的受体小鼠，在原始 卵泡发育至腔前卵泡阶段时从移植物中分离出来，在体外用f s h 孵育，用h c g 诱导成 熟“”“。结果显示有7 0 以上的胚泡期卵母细胞分裂并释放极体，5 5 4 的达到成熟 中期( m i i ) 。在此后的受精实验中，人工受精的m i i 期的卵母细胞中有7 5 4 发育至 二细胞期，在随后孵育的6 9 个胚胎中有7 9 7 最终发育至晚期桑椹胚。 1 2 2 冷冻方法 根据冷却步骤可将冷冻方法分为慢速冷冻和快速冷冻两大类。 慢速冷冻法又称为两步法，是将细胞用冷冻保护剂平衡后分两步由室温降至一1 9 6 2 。第一步慢速冷却至中间的某一温度，第二步将其直接投入液氮。该法冷冻鼠卵巢 组织得到了很好的结果“2 “，一般有7 5 8 0 的鼠在冷冻后自体移植卵巢组织恢复了 动情周期，组织学检查可见移植物中有卵泡发育“”“”“。慢速冷冻在造成组织细胞受 损的温度区域停留时间较长，可能严重损害对低温敏感的卵母细胞。且该方法需程序 冷冻仪来控制降温速度，过程繁琐。 快速冷冻的特点和优点就在于快速通过了对卵母细胞造成最大损伤的温度区域， 减小卵母细胞的损伤。 1 9 3 7 年，l u y e t 指出玻璃化方法可作为冰冻保存生物体的一种途径。他认为，生 命可归结于“原子和其他一些生命单元的专门而异常的排列”，并且“轻微的排列位 置的扰动就会破坏平衡从而导致死亡”，而冰冻死亡的原因就是结冰时破坏了这种特 殊的排列。玻璃化低温保存方法是指液体转变为非晶态( 玻璃态) 的固化过程。玻璃 化低温保存方法和常见的液体转变为晶体或部分结晶的固体冷冻过程不同，玻璃态固 体分子之阳j 与液相分子问无明显变化，而般的晶体分子之间的关系和液态相差甚 远。玻璃化比冻结固化方法引起的结果变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。 使溶液玻璃化有两种途径：一是极大地提高冷却速率，二是增加溶液浓度。1 9 7 8 年，s k a e r 和f r a n k s 提出在骤冷条件下可使细胞外实现玻璃化。将样品快速的投入 液氮，其降温速率一般只有1 0 5k s ，达不到将其玻璃化所需的冷却速率( 1 0 7k s ) 。 1 9 8 1 年，f a h y 首先明确地提出，用高浓度的低温保护剂溶液可在较慢的冷却速率以 及高压条件下实现完全的玻璃化。以后又发现了一些“玻璃化溶液”，使细胞、组织 乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。1 9 8 5 年，r a l l 和f a h y 用玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功“”。此后，人们利用这些溶液又实现了人 体细胞n 8 1 、单核白细胞、鼠胰岛、鼠胚胎和牛胚胎等的低温保存，进而开展了玻璃化 冷冻卵巢组织和卵母细胞的研究m ”3 。 1 2 3 冷冻保护剂 冷冻保护剂是一种能和水分子形成强大结合力的化学物质。它与水结合使冰晶不 能产生，降低了盐和其他溶质浓度过高造成的毒性。到目前为止，人们发现了数十种 抗冻剂，按其是否能渗透到细胞内可将抗冻剂分为渗透性和非渗透性两种。 常用的渗透型抗冻剂有甘油、d m 8 0 、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。渗透型抗冻剂 多数为低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水和作用，使溶液的粘性增加， 从而弱化水的结晶过程，达到保护目的。加入渗透型抗冻剂后冲淡了溶液中溶质浓度， 细胞摄入盐量减少，由抗冻剂替代。抗冻剂改变了胞内过冷状态，使胞内压接近胞外 压，降低细胞脱水皱缩程度和速度。抗冻剂进出细胞容易，能缓解水浴复温时渗透性 肿胀引起的损伤。 冷冻组织在甘油中渗透性低，而在组织中心的卵泡不能防御冷冻损害而导致卵细 胞内形成冰晶，从而导致细胞死亡。二甲基亚砜能快速渗透组织从而保护卵母细胞。 另外有实验表明在冷冻前用1 5 m o l l 丙二醇处理组织，虽会降低卵母细胞在体外的 成熟率，但并不改变染色体数目和纺锤体的结构。因此常用二甲基亚砜和丙二醇作为 冷冻保护剂。 常用的非渗透型抗冻剂有蔗糖、白蛋白、聚乙二醇等。这类物质能溶于水，但不 能进入细胞，主要是通过改变渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作用又称为 细胞外保护剂。非渗透性抗冻剂在慢速冷冻时可降低胞外溶液的溶质浓度，减少阳离 子进入细胞的数量，快速冷冻时，使细胞完成脱水缓解胞内结冰。 1 2 4 其他影响冷冻效果的因素 ( 1 ) 植冰温度t r a d 等研究发现，植冰温度从一8 1 2 提高至一4 5 c ，使复苏2 4 h 后卵泡复活率从3 2 升至9 3 。“。 ( 2 ) 组织切片的厚度厚度超过l m m 的卵巢皮质切片在冷冻保护剂中渗透效果 差。因此卵巢组织必须分割成l m m 见方的小块，以确保冷冻保护剂渗透充分，冷冻后 组织能够存活。 ( 3 ) 平衡温度卵巢组织在室温下接触冷冻保护剂，可以减少冷冻保护剂对细 胞的刺激，使渗透型冷冻保护剂迅速进入细胞内m 1 ，达到保护组织的目的。 1 2 5 冷冻卵巢组织的应用 冷冻卵巢有4 种应用途径：异种移植，异位自体移植，原位自体移植，卵泡的体 外成熟培养。 ( 1 ) 异种移植即异种问移植。有报道将冷冻的人类和猴子的卵巢组织异种移 植在免疫缺陷小鼠的肾脏被膜下，移植组织均有活力。”。”。”。异种移植可能会引起 免疫排斥反应，移植物随时可能失去功能。 ( 2 ) 异位自体移植即将冷冻后的卵巢组织移植至自体原位以外的位置。有报 道小鼠单侧卵巢自体皮下移植，移植卵巢能够发育并分泌激素，但移植卵巢发育较原 位卵巢差。移植位点应为移植组织提供存活的优良条件，而且便于监测卵泡成熟和便 于取卵，如肾脏被膜下、背最长肌肌膜下、腹部皮下组织、网膜和隐静脉管壁等。 ( 3 ) 原位自体移植即将冷冻后的卵巢组织移植至卵巢原来的位置。若子宫和 输卵管的功能正常，冷冻卵巢可能恢复生育力。但移植物需要很长时f j 才血管化，因 此通过调节刺激血管生长的因子能提高移植存活率。 由于受到移植受体的限制，冷冻后移植卵巢组织在保护大熊猫等珍稀野生动物的 遗传和繁育资源方面目前实际意义不大。冷冻卵巢组织的另一应用是将卵巢组织中的 卵母细胞分离出来并用于体外成熟培养，进而进行体外受精和胚胎移植得到活的后 代，保护其繁育资源。 ( 4 ) 卵泡的体外成熟培养运用机械分离与酶解相结合的方法可从冷冻卵巢组 织中分离出卵泡。如果这些卵泡经过冷冻和分离后没有损伤结构，能够在体外生长发 育，通过卵母细胞的体外培养，进一步使用体外受精( i nv i t r of e r t i li z a t i o n ，i v f ) 技术就可以得到能够供母体移植的胚胎，进而获得活的后代。 1 3 卵泡体外培养体系 卵泡的发育是一个连续的过程，可依据形态学特征划分其发育阶段。腔前卵泡也 称为无腔卵泡，是指卵泡发生过程中卵泡腔出现之前的处于各发育阶段的卵泡。本文 的腔前卵泡包括原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡。 1 3 1 卯泡体外成熟培养研究概况 1 8 7 8 年德国科学家s c h e n k s l 首次将兔和豚鼠排卵前的卵母细胞和附睾精子放 入相应的子宫液中进行培养，发现卵丘细胞分散，第二极体排出，进一步培养有卵裂 发生“。1 9 3 9 年，p i n c u s 和s a u n d e r s 首先报道了从人的卵泡中获得的卵母细胞在合 适的培养液中，能自发进行减数分裂和成熟。e p p i g ( 1 9 7 7 ) 用酶法分离了小鼠腔前 卵泡”，培养其卵母细胞一颗粒细胞复合体，卵母细胞表现出明显的生长。e p p i g 等 ( 1 9 8 9 ) 取得突破性进展，他们分离1 2f 3 龄小鼠卵母细胞一颗粒细胞复合体体外培 养l o 天，8 7 的卵母细胞发生泡破裂( g v b ) ，7 9 的卵母细胞产生清晰可见的极体， 经体外受精和移植产生7 只正常仔鼠。“。 n u t t i n c k 等( 1 9 9 3 ) 将牛的腔前卵泡与放射性成纤维细胞单层共同培养7 天， 卵泡直径增加5 3 0 t j j n ”“。证明牛腔前卵泡能在体外生长发育。h i r a o 等( 1 9 9 4 ) 体 外培养猪大腔前卵泡卵母细胞达到成熟，生发泡破裂( g v b ) ，产生第一极体“。将成 熟卵母细胞受精，发现有3 枚卵母细胞被精子穿入，但未能形成原核。这在家畜上首 次体外培养腔前卵泡生长到排卵前大小并获得成熟分裂能力，而且实现了精子穿入。 在国内许多研究者研究了山羊、猪、牛等动物腔前和有腔卵泡的体外培养叭“聃瑚”。 为了拯救濒危野生动物，抢救物种资源，一些学者开展了猫科动物腔前卵泡的体 外培养研究。1 9 9 3 年j e w g e n o w 等研究了激素对家猫次级卵泡体外培养的影响啪1 。1 9 9 6 年又研究了肽类生长因子对家猫小腔前卵泡体外生长发育的影响“；还进行了野生 猫科动物( 狮、猎豹和虎) 的腔前卵泡的分离”，并与家猫腔前卵泡进行了超微结构 特征的比较。w o o d 等( 1 9 9 7 ) 则将家猫腔前卵泡和有腔卵泡卵母细胞复合体进行体外 培养，观察其体外发育闭锁情况并与体内发育闭锁进行了比较“”。将家猫卵泡在盐溶 液中冷藏( 4 ) 4 8 h 后发现闭锁退化的卵母细胞数减少。j e w g e n o w 等( 1 9 9 8 ) 研究 了防冻保护剂对家猫小腔前卵泡发育的影响“。 1 3 2 腔前卵泡体外培养影响因子 腔前卵泡体外成熟培养体系常使用d m e m 和t c m l 9 9 作为基础培养液。d m e m 培养 液在维持家猫卵泡在体外培养过程中的卵泡形态上要优于t c m l 9 9 。卵母细胞的体外 成熟与培养体系有强相关性，培养体系的研究在卵泡体外成熟培养上就显得极其重 要。目前卵母细胞的体外成熟培养体系的研究应用基本上就是在体外模拟一个卵母细 胞体内成熟环境，参照卵母细胞体内环境在基础培养液中添加成分以期促进卵母细胞 体外成熟。 ( 1 ) 卵泡液 卵泡液是卵母细胞发育的微环境。卵泡液中的成分是卵泡液影响卵母细胞成熟的 主要因素。在猪、牛、鼠卵泡液中已成功分离出卵母细胞减数分裂抑制剂，牛卵泡液 中又分离出一种可溶性依赖蛋白激酶( c a m p d e p e n dk i n a s e ) ，在其高度磷酸化时能 保持减数分裂静止，这证明了卵泡液对卵母细胞减数分裂具有抑制作用。卵泡液中还 存在一种能使牛卵母细胞处于发生泡期的、高浓度的蛋白质因子。因而在体外培养液 中添加卵泡液能使卵母细胞保持减数分裂静止。添加适当浓度卵泡液有利于卵母细胞 体外成熟。 ( 2 ) 颗粒细胞 卵巢卵泡中的卵母细胞和周围上皮形成颗粒一卵母细胞复合体( c o c ) ，卵母细胞 与它周围的颗粒细胞间的联系对卵母细胞成熟产生重要影响。卵母细胞膜的微绒毛深 入透明带甚至穿过透明带与外部颗粒细胞相连。颗粒细胞的突起也深入透明带中。微 绒毛与颗粒细胞的突起在透明带内形成连接，为卵母细胞和颗粒细胞之间的物质信息 交流提供途径。颗粒细胞通过这种耦联营养卵母细胞，其合成的一些生长因子也通过 这种耦联调节卵母细胞发育。颗粒细胞能抑制卵母细胞核成熟的小分子c a m p 等通过 细胞连接运转至卵母细胞中，阻止卵母细胞恢复减数分裂。有研究发现颗粒细胞对卵 母细胞体外成熟的这种影响与其浓度有关，低浓度的颗粒细胞( 1 5 1 0 8 m 1 ) 能促 进卵母细胞成熟分裂的启动，浓度高时( 5 0 1 0 0 1 0 8 m 1 ) 则抑制。在实际应用中 在卵泡培养密度小于5 0 枚m l 时，常将卵母细胞和单层颗粒细胞共培养，或者是培 养颗粒一卵母细胞复合体( c o c ) 。 ( 3 ) 血清 血清对腔前卵泡生长的影响主要是其中含有一些卵泡正常生长和分化所需的额 外因子，这些因子可以抑止或促进细胞问的粘着。在培养体系中添加血清可能减少颗 粒细胞和卵泡膜细胞对卵母细胞减数分裂恢复的抑制作用，从而促进卵丘细胞层扩散 和卵母细胞发育成熟。另外有报道认为血清中含有某种成分能与卵丘细胞一起防止透 明带变硬，促进受精。另外也有研究者通过牛血清白蛋白来提高卵母细胞体外成熟受 精和早期胚胎发育。e p p i g 等认为，除人胎血清外，胎牛血清、犊牛血清、新生牛血 清和鼠血清都能促进卵母细胞体外成熟“。b a t c h e r 等( 1 9 9 6 ) 认为同源血清或牛血 清白蛋白( b s a ) 比f c s 能更好的促进负鼠腔前卵泡的生长发育。q v i s t 等( 1 9 9 0 ) 也认为，小鼠同源血清的运用比f c s 对于小鼠卵母细胞的生长更有利，但b s a 仅可诱 导颗粒细胞的增殖而不能维持卵泡的结构，而f c s 可促进腔前卵泡的生长。w o o d 等 ( 1 9 9 5 ) “”和j o h n s t o n ( 1 9 9 1 ) “”等认为家猫有腔卵泡和卵母细胞培养在含有f c s 的培养液中，卵母细胞的成熟可被明显阻止在生发泡破裂期，而使细胞质充分发育成 熟。j e w g e n o w ( 1 9 9 8 ) 试验表明在添加f c s 的系统中正常腔前卵泡率为3 8 1 ，而添 加b s a 正常卵泡率提高到了5 8 6 ，说明培养液中添加b s a 对家猫腔前卵泡体外培养 更有利。曾长军( 2 0 0 1 ) 将b s a 和f c 8 相比较7 1 的结果显示，f c s 似乎更能促进家猫 腔前卵泡的生长，卵泡的闭锁退化率也比b s a 组为低，但两者之间没有显著的差异。 ( 4 ) 促性腺激素 有研究者认为在无血清条件下往基础培养液中添加促性腺激素( f s h 、l h ) 能提 高卵母细胞的成熟率、受精率及发育率。他们认为l h 可能引起卵丘变化，有利于精 子通过卵丘细胞间隙到达透明带。l h 还可能增强卵母细胞的存活力，提高卵母细胞 7 受精率。也有研究者认为l h 通过调节营养环境，引起卵丘细胞代谢变化，并通过放 射冠与卵母细胞间裂隙联接传递到卵质膜，改变卵母细胞线粒体葡萄糖的氧化。l h 还通过除去成熟分裂抑制因子，对卵母细胞发挥作用。f s h 可能诱导卵丘扩散，暂时 性的抑制发生泡破碎( g v b ) ，改变第一次成熟分裂的时间，促进胞质成熟。 ( 5 ) 丙酮酸钠、次黄嘌呤 j e w g e n o w ( 1 9 9 8 ) 研究表明，添加丙酮酸钠、次黄嘌呤蛆及谷氨酸盐可增加培养 系统中正常卵泡率。s a h a 等( 2 0 0 0 ) 在体外培养牛4 0 1 0 0 1 m 腔前卵泡过程中也添 加了谷氨酸盐和丙酮酸钠“。丙酮酸钠、次黄嘌呤等是作为卵泡发育的能量添加剂， 可刺激卵泡从静止到体外增殖和生长的代谢转变。次黄嘌啉可维持卵母细胞处于g v 期，抑止g v b 和卵母细胞核成熟。 ( 6 ) 皮质醇 皮质醇可促进细胞的增殖和粘着，但在某些情况下，如细胞密度较高时，皮质醇 可能是细胞抑制荆，并能诱导细胞分化。j e w g e n o w ( 1 9 9 3 ) 认为添加皮质醇可降低家 猫卵泡的闭锁，并增加卵泡的直径。曾长军( 2 0 0 1 ) 发现，添加4 0 n g m l 皮质醇后。 家猫腔前卵泡在体外培养过程中直径的增幅比未添加皮质醇组要低“”，但可以降低卵 泡的闭锁退化率，差异并不显著( p o 0 5 ) 。皮质醇能够降低卵泡在发育过程中的退 化率，但其促进卵泡生长的作用还不确定。 ( 7 ) 表皮生长因子 e g f 能够调节卵泡细胞的生长和分化，还能够抑制雌二醇的产生。在体外，表皮 生长因子( e g f ) 能促进对猪、兔和人的卵泡、卵泡细胞分裂。但高浓度( l o n g m 1 ) 的e g f 可能会增加卵泡的闭锁“”。 ( 8 ) 其他影响因素 卵泡的体外培养还受到其他一些因素的影响，如：卵泡直径、卵泡状态、培养成 熟时间等。卵泡直径的增加与减数分裂能力的提高似乎成正相关，大卵泡比小卵泡的 体外生长发育能力更强。不同动物成熟培养时间不同。如：牛、绵羊和山羊卵母细胞 的培养时间一般为2 4 2 6 h ，猪一般为4 2 4 8 h 。卵母细胞离体操作的时间和温度、 卵母细胞的获取方式等也对卵母细胞体外成熟产生影响。 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 试验动物 本试验选用年龄1 2 岁，体重2 3 k g 的成年雌性家猫，系购自成都市郊区的地 方品种。试验于春、秋家猫发情季节进行。 2 1 2 试验主要仪器与试剂 ( 1 ) 主要仪器 1 电子天平d e n v e ri n s t r u m e n t 产品，型号m - 1 2 0 ，感量i 1 0 0 0 0 9 2 酸度计d e n v e ri n s t r u m e n t 产品。型号m o d e l5 0p h i o n c o n d u c t i v i t ym e t e r 3 微型离心机s a n y t om i c r oc e n t a u r 4 普通显微镜o l y m p u s 5c 砚培养箱f o r m as c i e n t i f i ci n c 6 倒簧显微镜o l y m p u si x l o 74 5 0 u m 网筛浙江上虞市道墟化验仪器设备厂 8 中3 5 m m 培养皿f a i c o n1 0 0 7 9 实体显微镜o l y m p u ss z h i or e s e r v e ds t e r e o l o 酶标仪m u l t i s k a nm c c 3 4 7m t xl a bs y s t e m si n c 11 程序冷冻仪f o r m a s c i e n t i f i c8 0 2 5 1 2 透射电镜h i t a c h ih - 6 0 0 ( 2 ) 主要试剂 1d m e m 液体h y qc a t l 2 4 3 0 0 5 4l o t l l 3 6 7 9 7 2 矿物油s i g m am 1 8 4 0 ，c a t 4 1 5 0 0 0 3 4l o t l 0 1 2 2 9 9 3b s ab mn o t t h b i o 4h e g fr o c h em o l e c u l a rb i o c h e m i c a l s 5c o l l a g e n a s evs i g m a 北方同正公司分装 6 丙酮酸钠g i b c o b r lc a tl1 8 4 0 0 3 01 0 t 8 0 9 6 3 6 3 7 次黄嘌呤s i g m ah 9 6 3 6l o t l 7 h 0 6 1 8 9 8 台盼兰g i b c o b r lc a t l 5 2 5 0 - - 0 6 1 l o t 2 5 k 1 5 6 3 9 氯化可的松：s i g m al o t 7 9 h 1 4 0 5h - 4 0 0 1 1 0l h 宁波第二激素厂，批号：2 0 0 2 11 1 5 1 1f s h 宁波第二激素厂，批号：2 0 0 3 0 1 0 2 1 2 二甲基亚砜( d m s 0 ) g i b c ol o t l l 7 h 3 6 0 2 1 3f c sh y c l o n e g i b c oc a t s h 3 0 0 8 8 0 2l o t a k b l l 4 2 0 1 4l ，2 一丙二醇( p r o h ) 天津瑞金特化学品有限公司 1 5h y z s es i g m ah 3 5 0 6 1 6 乙酰胺( d t )成都科龙化学品有限公司 1 7 聚乙二醇( p e g 。) 天津光复精细化工研究所 1 8h e p e ss i g m ah - - 3 3 7 5l o t 8 8 h 5 4 4 6 1 9o r c e i ns i g m a0 7 3 8 0l o t 3 7 h 1 4 0 9 2 1 3 溶液配制 ( 1 ) 冷冻保护荆 1 ) 两步法及经典方法冷冻保护剂 1 5 m o l ld m s o + 1 0 ( v v ) f c s + p b s 缓冲溶液 2 ) 玻璃法v s l 冷冻保护剂 2 0 5 ( w v ) d m s o + 1 5 5 ( w v ) d t + 1 0 ( w v ) p r o h + 6 ( w v ) p e g s o o + i o ( v v ) f c s + p b s 缓冲溶液( p h 8 0 ) 3 ) 玻璃法d a p 2 1 3 冷冻保护荆 2 0m o l ld m s o + 1 o m o l ld t + 3 o m o l lp r o h + p b s 缓冲溶液 ( 2 ) 培养基 1 ) 基础培养体系 d m e m + o 5 b s a + 0 2 3 n m o l 丙酮酸钠+ 2 0 m m o ih e p e s + 5 0 n g m le g f + 4 0 n g m l 氢化可的松+ 2 m m 0 1 次黄嘌呤 2 ) 成熟体系 d m e m + 0 5 b s a + 0 2 3 n m o l 丙酮酸钠+ 2 0 m m o lh e p e s + 5 0 n g m le g f + 4 0 n g m l 氢化可的松+ l o i u m lf s h + 2 0 1 u m ll h 3 ) o 1 x 胶原蛋白酶液 i o 称取胶原蛋白酶粉末l o o m g ，先用少量无血清d m e m 调成糊状，再补足l o o m l ，混 匀，用0 2 l p m 微孔滤膜过滤除菌，分装成5 m l ，一2 0 保存。 2 2 试验方法 试验选用5 0 只年龄l 2 岁，体重2 3 k g 的成年雌性家猫随机分成四组，手术 法摘取卵巢后将卵巢皮质分割成i m m 见方的薄片，按下列四种处理进行冷冻。 组别方法冷冻保护剂 1 组 两步法 1 5 m o l ld m s o + i o ( v v ) f c s - - p b s 缓冲溶液 2 组经典法1 5 m o l ld m s o + i o ( v v ) f c s k p b s 缓冲溶液 3 组玻璃化冷冻法 v s l 4 组玻璃化冷冻法 d a p ：。 在冷冻的卵巢组织在复苏后，检验卵巢组织的活性，评判冷冻方法的优劣。检验 卵巢组织冷冻效果的方法有很多，本试验采用复苏冷冻后的卵巢组织块进行组织学切 片观察和电镜观察，以检测卵泡组织结构的变化和超微结构的损伤；进一步分离出复 苏后卵巢组织中的卵泡，将卵泡进行死活染色检验冷冻后卵泡的存活率；将卵泡进行 体外培养检验冷冻后卵泡的发育情况，并检验培养液中雌二醇的含量以判断颗粒细胞 的分泌激素能力的恢复。 2 2 1 卵巢组织薄片的冷冻复保存与苏 ( 1 ) 卵巢组织的获取 家猫卵巢位于腹腔背部肾脏后，约在第3 4 腰椎下，长约i c m 宽约0 3 0 5 c m 。 用手术法获取家猫卵巢。家猫手术前8 h 禁食，可少量饮水。所有家猫采用注射氯胺 酮麻醉，参考计量7 0 p g k g 。将家猫全身麻醉后仰卧保定于手术台上，术部剪毛剃毛 消毒，自脐孔后i c m 沿腹中线剪开皮肤约4 c m ，用镊子夹起肌肉层，在切口中点的腹 白线上剪- d , 口，将镊子或有钩探针从切口伸入后，用手术剪沿镊子或有钩探针剪开 腹直肌和腹膜。将弯嘴手术钳沿腹壁伸入腹腔轻轻翻转勾出子宫角，沿切口轻轻拉出 后卵巢随之自切口而出。用镊子在卵巢系膜上距卵巢3 c m 处穿透卵巢系膜，并用缝线 在卵巢与输卵管之间、卵巢与子宫角之间分别做双线结扎，在两结扎线间剪断，卵巢 即被摘除。摘除卵巢后将腹膜和腹直肌一起做连续缝合，皮肤做结节缝合。皮肤消毒 包扎以防母猫舔切口皮肤，术后7 d 拆除缝线。 手术法摘取卵巢后，将卵巢置于新鲜配置的3 7 的生理盐水( 内含青霉素2 0 0 i u m l ，链霉素2 0 0m g m 1 ) 用保温桶立即运回实验室。在无菌间内超净工作台上将 卵巢用生理盐水冲洗干净，除去其表面结缔组织和脂肪组织，再在生理盐水中冲洗 2 3 次。除去表面明显的黄体，沿卵巢门切开去掉髓质，再将其用生理盐水冲洗2 3 次，吸去表面液体，置于表面皿内。用眼科剪将组织剪成i m m 见方的组织块。 ( 2 ) 冷冻方法 1 ) 两步冷冻法 将已经剪成i m m 见方的组织块置于含3 m l 冷冻保护剂的冷冻管中，在室温下平衡 l o m i n ，将冷冻管放入程序降温仪中以l 。c m i n 的速度从2 5 降n t o ，以0 5 c m i n 的速度从1 0 降到一7 ，在一7 植冰，植冰后平衡5 m i n ，以0 5 c m i n 的速度降至- 5 5 ，取出冷冻管立即投入液氮保存。 2 ) 经典方法 将已经剪成i m m 见方的组织块置于内含3 m l 冷冻保护剂的冷冻管中，置于冰上 2 0 m i n 达o c ，放入程序冷冻