（水生生物学专业论文）利用pcrdgge研究军曹鱼肠道和水环境的细菌群落.pdf

利用p c r - d g g e 研究 军曹鱼肠道和水环境的细菌群落 专业：水生生物学 硕士生：熊千龄 导师：杨廷宝教授 摘要 采用p c r ( p o l y m c m s ec h a i nr e a c t i o n ) 一d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 和1 6 s r d n a 技术对深圳南澳的军曹鱼从卵到成鱼一年生长过程 中的养殖水体细菌群落和肠道细菌群落的组成进行了研究，聚类分析的结果表 明：水体的细菌群落多样性呈现不规则变化，而军曹鱼前肠和后肠肠道细菌群落 多样性都经历了由低到高再到低的变化过程。军曹鱼卵、苗和咸鱼肠道的细菌以 及水体细菌群落的优势种大部分都明显，多在2 5 种之间。此外，肠道细菌群 落与其养殖水体的细菌群落在组成上有部分相似之处，但肠道样品的细菌群落与 水体细菌有很大差别，前肠与后肠的细菌群落也有差别。聚类图上各簇的排列顺 序基本反映了各样品在时间上和微生境的毗邻次序和它们的相似程度。本研究改 良了肠道细菌总d n a 的提取方法，并发现发光弧菌属和梭状芽孢杆菌属是海水 鱼类肠道细菌群落的优势种。 关键词：p c r - - d g g e ，1 6 s r d n a ，军营鱼，细菌群落，肠道，水环境 s t u d i e so nt h eb a c t e r i a lc o m m u n i t i e si nt h eg u to f r a c h y c e n t r o nc a n a d u m a n di t sl i v i n gw a t e r b ym e a n s o fp c r d g g e m a j o r ：h y d r o b i o l o g y n a m e ：x i o n gq i a n l i n g s u p e r v i s o r ：p r o f y a n gt i n g b a o a b s t r a e t i nt h i ss t u d y , t h r o u g hp c r - d g g ea n d1 6 sr d n at e c h n i q u e ，w ei n v e s t i g a t e dt h e b a c t e r i a lc o m m u n i t i e so fc o b i a sg u ta n di t sc u l t u r es y s t e m s ( i n c l u d i n gb r a c k i s h w a t e ra n dm a r i n ew a t e rs y s t e m ) t h es a m p l e si sc o l l e c t e df r o mt h ez y g o t et ot h e m a t u r e df i s hd u i n gay e a ra tn a n a oo fs h e n z h e n p c r - d g g ea n dc l u s t e r i n ga n a l y s e s i n d i c a t e dt h a tt h ed i v e r s i t yo ft h eb a c t e r i a lc o m m u n i t i e sc h a n g e di naf o r mo ft h e a b n o r m i t y f r o mt h ef o r e g u tt ot h eh i n d g u to ft h ec o b i a , t h ed i v e r s i t yo f t h eb a c t e r i a l c o m m u n i t i e si n c r e a s e da n dt h e md e c r e a s e d t h e r ee x i s t e d2 5d o m i n a n ts p e c i e si n m a n ys a m p l e s ，a n dt h e yv v e r ec o r r e s p o n d i n gt ot h eb r i g h tb a n d si nt h ed g g ef i g u r e s s a m p l e so ft h ep o n dw a t e r , s e aw a t e ra n do fg u th a ds h a r e dc o m p o s i t i o n so fb a c t e r i a l c o m m u n i t i e s ，a l t h o u g hs a m p l e sf r o mt h ew a t e ra n dt h eg u to rf r o mf o r e g u ta n d h i n d g u tw e r ed i s s i m i l a r u p m g aa n a l y s i so ft h es a m p l e sr e v e a l e dt h es a m e c h a r a c t e r sa sd e m o n s t r a t e df r o md g g ef i g u r e t h eo r d e ri nt h ec l u s t e r i n gf i g u r ew a s 船：t h eh i n d g u t ，t h ef o r e g u t ，t h ew a t e r , w h i c hr e f l e c t e dt h eo r i g i n a ls p a t i a lo r d e ro f s a m p l e sa n dt h e i rs i m i l a r i t y t h i ss t u d yi m p r o v e dt h ee x t r a c t i o nm e t h o do f d n a f r o m b a c t e r i ai nf i s hg u ta n dr e v e a l e dt h a tp h o t o b a c t e r i u ms p a n dc l o s t r i d i u ms p w e r et h e d o m i n a n ts p e c i e si nt h eg u to f 肋c 矗弦p 肋伽c a n a d u m k e yw o r d s ：p c r - d g g e ，1 6 s r d n a ，r a c h y c e n t r o nc a n a d u m ，b a c t e r i a lc o m m u n i t i e s ，f i s hg u t ， i n h a b i t e dw a t e r i i 第一章前言 军曹鱼r a c h y c e n t r o nc a n a d u m ( l i n n a e u s ) ，英文名为c o b i a ，俗名鲸龙、海龙鱼、 海鲡鱼等，是一种大型海产肉食性经济鱼类，在我国东南海域均有分布。军曹鱼的病害 少，肉质细嫩，味道鲜美，深受消费者喜爱( 居礼，2 0 0 4 ) 。 水中微生物的生态情况直接影响水产养殖业的发展，包括对军曹鱼的疾病防治及其 生长发育的影响。优良的水质是水产养殖的首要条件，优良水质可保持水中微生物生态 平衡。因此，保持水中微生物生态平衡，使水生动物健康生长，是水产养殖中的重要一环。 肠道是一个大的菌库。军曹鱼的肠道中定居着大量的微生物，并维持着动态平衡。这种 平衡是相对的，会随着水环境条件的改变而改变，水环境中微生物生态平衡失调，会影 响水产动物体的微生态平衡。有些因素可引起肠道菌群的变化，在恢复正常环境条件时 能自动恢复平衡，而有的则不能，从而发生一系列病理现象，导致鱼类疾病。为充分发 挥鱼类肠道菌群的有益作用，限制其不利影响，采取措施调控鱼类肠道的微生物区系至 关重要。因此，近年国内外在水产养殖中有关生态环境，特别是微生物生态环境和水生 动物( 鱼虾等) 体的微生物情况( 微生态环境) 以及由此引起的细菌和病毒性疾病受 到广泛重视( 崔青曼，2 0 0 3 ；薛恒平，1 9 9 7 ) 。 r r n a 是研究细菌进化和亲源关系的重要指标，含量大( 约占细菌r n a 总量的8 0 ) ，因而素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学最常用的分子标记。原核生物的 5 s r r n a 、1 6 s r r n a 和2 3 s r r n a 位于同一操纵子上，其中1 6 s r r n a 为细胞所共有，分子 大小适合操作，其功能同源且最为古老，既含保守序列又含可变序列。保守性反映生物 物种的亲源关系，为系统发育提供线索；高变性则揭示生物物种的特征核酸序列，是种 属鉴定的分子基础，其序列变化与进化距离相对应，在细菌种属分类鉴定中广泛应用。 1 6 s r r n a e l1j 序列分析是一种非培养分析技术，能快速鉴定目前尚不能人工培养的微 生物。若两菌的1 6 s r r n a 质 源性大于9 9 ，且染色体d n a 杂交率大于7 0 ，在基因 水平上则被认为是同一种细菌( 谢珍玉，2 0 0 5 ) 。 变性梯度凝胶电泳法( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) ，因能有效 分析复杂微生物群落及其多样性而广泛用于研究动物肠道与水体微生物区系。用d g g e 技术分析1 6 sr d n a 的多态性可以直接鉴定复杂细菌区系的菌群结构，同时也可以用于 菌种的鉴定，是一种很有用分子标记方法，并己成为海洋细菌分类和鉴定的一个有力工 具( 谢珍玉，2 0 0 5 ) 。 总之，由于1 6 sr r n a 序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定性， 序列分析的重现性极高，随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展，1 6 sr r n a 在海洋 微生物学的研究中起到越来越重要的作用，作为海洋微生物系统分类和有害海洋微生物 分子检测的主要依据已得到广泛认同。随着分子分类的理论和方法的日趋成熟以及微生 物核糖体r n a 数据库的日臻完善，该技术己成为海洋细菌分类和鉴定的一个有力工具， 并有望在分析环境生物多样性、微生物资源调查、揭示污染的生物学效应和环境质量评 价等环境科学研究领域得到广泛的应用( 洪义国等，2 0 0 2 ；乐毅全等，2 0 0 3 ) 。 1 1 军曹鱼的概述 军营鱼为外海凶猛性暧水鱼类。主要摄食鱼类，如金带细鲶、斑柄天竺鲷、细条天 竺鱼、青石斑鱼、三线矾鲈、条尾鲱鲤、日本鲲鱼等，还摄食头足类中的金乌贼，底栖 生物中的短尾类如三疣梭子蟹和虾类等。 养殖中军营鱼的亲鱼一般投喂新鲜鱼虾或冰鲜饵料，并适量添加一些复合维生素。 军曹鱼鱼苗培育中的仔鱼期饵料种类主要有轮虫和桡足类：稚鱼期饵料则应以桡足类为 主；幼鱼期饵料以枝角类和鱼肉浆为主，后期可单独投喂鱼肉浆。目前还没研制出专用 于商品鱼的饵料，所投喂的饵料是青鳞鱼、小公鱼、脂眼鲱等小杂鱼( 居礼等，2 0 0 4 ) 。 军曹鱼分布于印度洋北部沿岸，东至澳大利亚，北至赣鲜、日本及大西洋热带海区， 也就是说，军曹鱼分布在红海、印度、中国、澳大利亚、南沙群岛、日本、朝鲜、南非 及大西洋热带海区等。我国沿岸均产，在中国沿海的北海、三亚、新村、涸洲、昌化、 硇州、汕尾、澳头、海门、南澳、花莲等地可以捕获到其幼鱼和成鱼( 陈毕生等，1 9 9 9 ： 居礼等，2 0 0 4 ) 。 军曹鱼是一种优质海产经济鱼类，不仅肉质鲜嫩，肉色透明、洁白，味道鲜美， 而且对人体具有很高的营养价值和药用保健功能，有“黑三文鱼”的美称。此鱼含有 丰富的不饱和脂肪酸，如脑黄金( d h a ) 和脑白金( e p a ) 等的含量很高，具有降低 人体胆固醇和血压、增强记忆力、保护视力、增强免疫力、抗衰老和防止胆结石等功 用。2 0 0 2 年5 月3 0 日，广东省重大科技项目一一军曹鱼全人工繁殖及规模化育苗技 术项目在湛江获得成功，在全人工繁育方面取得全国首次重大突破。随着军曹鱼全人 2 工育苗的成功，为军曹鱼人工养殖提供了大量健康种苗，军曹鱼海水网箱养殖在我国 长江以南地区发展迅猛，己成为目前近海浮动式网箱和深海网箱养殖的主要品种( 陈 刚等，1 9 9 4 - - 2 0 0 6 ：居礼等，2 0 0 4 ) 。 1 2 军曹鱼肠道细菌和其养殖水体的细菌 在大规模苗种孵化和海洋鱼类的饲养期间，各种各样形式的细菌与生物体间的相互 作用都可能发生，这可能是导致本土微生物区系的形成或者是传染病的第一步。在水产 养殖环境中，细菌很容易在聚集处和宿主间传播，所以更好理解宿主和细菌间的相互作 用对于成功地大规模养殖鱼仔是十分必要的。水产业的进一步发展依赖于预防病原体的 繁殖和传播的微生物控制技术的提高( o l a f s e n ，2 0 0 1 ) 。 1 2 1 大鹏湾海域自然环境质量现状 田1 六一琦罔藉彝蕞嚣泞拭生铮幕样蜡豫示童羽 _ 毽l 翻越尊盘蜷蛐嘲h 如碰地组廖碰哪h 鞠攀- a 撕豫 螂虹撕坶脚- 轴m 骶鼬 图1 大鹏湾的地理位置 f i g u r e1t h eg e o g r a p h i c a lp l a c eo f t h ed a p e n gb a y 大鹏湾是深圳市的重点沿岸增养殖区之一，也是深圳海域的赤潮多发海区。随着海 水养殖业的发展，养殖带来的环境问题越来越引起社会各界的关注，特别是在网箱养鱼 过程中，残余饵料及养殖鱼类的代谢产物对海域环境的影响极大，导致养殖区水体中环 境因子的组成和结构发生很大变化。因此已有科学家对研究大鹏湾南澳近岸海域的生态 环境进行了调查分析： 大鹏湾附近海域目前水质状况良好，除b o d ( 生化需氧量) 和石油类外，其它指 标都符合一类海水水质标准；石油类的超标率分别为4 。近1 0 年来，大鹏湾附近海域p h 和石油类基本保持稳定，活性磷酸盐稍有下降，无机氮则变化不大。总体上讲，近1 0 年来，大鹏湾附近海域水质状况变化不明显。但浮游植物的种类有所减少，生物多样性 亦减少，数量则有增加趋势；浮游动物的变化则不大( 黄小平，2 0 0 4 ；黄毅，2 0 0 5 ； 张汉华，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 军曹鱼的养殖环境要求 目前，军曹鱼的养殖主要是在海水网箱中进行。养殖场地应选择在风浪较小、水流 通畅、水体交换较大、大陆径流较小、水质无污染、泥砂底质、水深1 0 1 5 米，盐度3 0 - - 3 5 、水温1 8 - - 3 2 c 、p h 值7 - - 9 、透明度8 一1 2 米、溶解氧5 毫克每升以上的海域( 居 札等，2 0 0 4 ) 。 1 2 3 军曹鱼的肠道结构 鱼类的肠道在形态学上，区分不出小肠和大肠。直肠是属于后肠。 硬骨鱼类靠延长肠道增加表面积。鱼类的肠道长度常以肠管长和体长之比表示，谓 之比肠长。有人以幽门部至肛门的长度为单位，大多数鱼为1 2 6 单位。肠管的长度随 鱼的种类而不同，它与食性、生长等特性都有关系：军曹鱼为肉食性的鱼类，肠道较短。 鱼类肠壁结构分四层：粘膜层、环肌层、纵行肌层和浆膜层。肠粘膜表面多皱褶， 借以扩大表面积，它和胃一样，在空腹时皱褶较深，摄食后，内充食物，肠管伸展，则 皱褶变浅变少。鱼类肠粘膜一般都是覆盖一层简单的柱状上皮，没有多细胞的腺体( 王 义强等，1 9 9 0 ) 。 4 1 2 4 海洋细菌 海洋细菌细胞无核膜和核仁，d n a 不形成染色体，无细胞器，属于原核生物：不 能进行有丝分裂，以二等分裂为主：个体直径一般在l 岫以下，呈球状、杆状、弧状、 螺旋状或分枝丝状；具有坚韧的细胞壁；能游动的种以鞭毛运动。海洋细菌是海洋微生 物中一大类群，也是海洋微生物学的主要研究对象。 由于近海海水中存在着众多暂时生长在海洋环境中的陆生细菌，因此，严格地说， 海洋细菌是指那些只能在海洋中生长与繁殖的细菌。一般说来，真正海洋细菌具有3 个 基本特征：至少在开始分离和初期培养时要求生长于海水培养基中；生长环境中需要氯 或溴或其中之一元素存在；需要生活于镁含量较高的环境中。另外，许多海洋细菌是嗜 冷或适压生物。 据伯杰细菌鉴定手册( 第8 版) 记载，约有1 8 0 种细菌属于海洋细菌。最常见 的有假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、弧菌属( h b r i o ) 、无色杆菌属( a c h r o m o b a c e r ) 、 黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、螺菌属( s p i r i l l u m ) 、微球菌属( m i c r o c o c u s ) 、八叠球 菌属( s a r c i n a ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 和发光杆菌属 ( p h o t o b a c t e r i u m ) 等。海洋细菌个体较小，在培养基上生长较慢：相对于非海洋细菌， 对糖的分解能力较弱，而对蛋白质分解能力较强；产生色素的较多。一般来说，在海水 中革兰氏阴性杆菌( g 一) 占优势( 有人认为可达9 0 以上) 。在远洋沉积物中，革兰氏 阳性杆菌( g + ) 居多；芽孢杆菌在海水中少见，但在大陆架沉积物中则最为常见；球 菌种类在海水中也较少见；能游动的杆菌和弧菌在海洋中占优势。 细菌比高等动植物对环境有更大的适应性。近海地区由于风浪、潮汐及径流等的运 动和人类及生物的活动使陆源细菌进入近岸海域和远洋水上层中，并适应生存，因此生 活在这些环境中的海洋细菌的生理生态特性与陆生细菌相似。但生活在深海的细菌，因 深海环境具有高盐、高压、低温和低营养等特点，因此其生理、生态特性与陆源细菌迥 然不同。 总地说来，海洋细菌有以下几点特性：嗜盐性，嗜冷性，适压性，低营养性，趋化 性与附着生长，发光性：此外海洋细菌的多态性特点也是常见的，即在同一株细菌的纯 培养中，往往可观察到多种形态的细胞。 海洋细菌在海洋中数量多、分布广，是海洋微生物中最重要的成员。海洋细菌种类 和数量分布与海洋环境密切相关。其数量水平分布特点是：沿岸地区由于营养盐丰富， 数量较多：随着离岸距离增大，细菌密度呈递减趋势；内湾和河口细菌密度最大。在细 菌的垂直分布上，基本是随深度增加密度减少。在外海水域，表层海水中因含有大量的 疏水性物质( 碳氢化合物、脂类等有机物及一些无机物) ，海洋细菌数量相对较多；随 深度增加、水温下降、压力增大，细菌密度逐渐减少，至水一底泥界面处又有所回升。 在许多海区的浅层水中，由于波浪和表面水流的作用破坏了垂直分层现象，使细菌在垂 直分布上没有明显差别。底泥中由于含有相对多的养分，使得其中细菌密度一般较海水 中大，泥土底质中的细菌密度一般高于沙土底质。采用传统培养方法在每毫升近岸海水 中一般可分离出一个细菌菌落。在每克底泥中细菌数量一般在1 0 2 1 0 3 个细菌菌落，有 时超过1 0 5 个；而在每毫克深海海水中，有时却分离不出一个细菌菌落。在每克底泥中 细菌数量一般在1 0 2 1 0 5 个之间，高的可达至l | 1 0 5 个以上；在深达5 米的海底淤泥中也可 发现海洋细菌的踪迹。采用荧光显微计数法所测海水细菌密度比传统培养法的约高 1 0 2 1 0 3 倍，一般1x1 0 6 个m l 。在海洋调查中，有时会发现某水层中的细菌数量剧增， 出现不均匀的微分布现象。这主要是由于海水中有机物质分布不均匀所引起，特别是 由于浮游植物的暴发性生长( 如赤潮) ，释放到海水中可作为营养物质的有机物增多，造 成海洋细菌在某一深度出现一个密度高峰的现象。除有机物质外，季节风、海流、温度 及盐度等环境因素也可造成海洋细菌在某海域形成密集化( 相建海，2 0 0 3 ) 。 总之，不同水环境中微生物群的组成、数量均有差异，即使在同一水域不同季节， 菌群组成及数量亦有变化。然而，在同一水域，相同季节，在不受污染的情况下，水中 微生物群组成和数量有一定规律，并且形成微生物生态平衡。水中主要微生物群以细菌 为主，对水质和水产养殖的影响也较大，研究的也较多。l i s t o n ( 1 9 6 3 ) 研究表明，在 淡水中以气单胞菌、假单胞菌和无色杆菌等为优势菌，海水中以假单胞菌、弧菌、无色 杆菌、黄色杆菌和微球菌等为优势菌。r h i n h e i m e r 等( 1 9 8 0 ) 从海洋水生动物体表分 离蛰j 7 4 3 株细菌，大多为革兰氏阴性无芽胞杆菌，其中假单胞菌、无色杆菌占优势，其 次为微球菌和黄杆菌。a b m a d j i a u ( 1 9 8 6 ) 还报道了弧菌在海水中的动态。水中还存在 光合细菌( 红色假单胞菌、红色螺菌等) 、蛭弧菌、各种芽胞杆菌( 玻璃样芽胞杆菌、 杆状芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌等) 、乳杆菌、硫杆菌、几丁质分解菌等。 除细菌外，还有酵母、放线菌、噬菌体及其他病毒等。随着水环境的污染，水中还会含 有引起人畜疾病的病原微生物，如沙门氏菌、肠道病毒，以及引起鱼虾疾病的嗜水气单 6 胞菌、副溶血弧菌、呼肠弧病毒、对虾杆状病毒等( 薛恒平等，1 9 9 7 ) 。 1 2 5 海洋鱼类消化道中的细菌 动物消化道微生态系统组成包括宿主消化道上皮细胞、食源性非生物成分、消化分 泌物和栖居消化道的微生物。消化道的微生物参与动物的物质代谢，提供动物机体需要 的营养物质和生长刺激因子，与宿主在不同发育阶段形成了动态的生理性组合，构成与 宿主在一定生态空间内的生理统一体，其关系是相互影响、相互作用的，消化道微生态 系统各组分保持一种平衡关系。这种微生态平衡关系一旦破坏，就会影响动物的营养与 生长代谢，导致疾病( 郭兴华，2 0 0 2 ) 。 鱼类消化道较短，呈直线和发夹状，其结构和机能多未分化。摄饵后1 0 1 6 小时， 内容物全部排尽。这些情况不利于专性厌氧菌的充分繁殖，其微生物种群组成也易受到 水环境等因素的影响。但由于鱼类胃肠道的p h 值为2 4 5 ，处于酸性环境，且富含胆汁， 对水环境的许多微生物具有抑制作用，因此形成了与体表和水环境不同的微生物群落。 海水鱼类消化道菌群以弧菌属细菌为主，每克肠内容物约含1 0 4 1 07 个。其次是假 单胞菌属、莫拉氏菌属、不动杆菌属、拟杆菌科的细菌，其含量为1 0 2 1 0 6 个幢。此外， 还有芽孢杆菌属、黄杆菌属、微球菌属、梭状芽孢杆菌属以及c o r y n e f o r m e 属的细菌。 鱼类消化道的兼性厌氧菌一般多于专性厌氧菌。在兼性厌氧菌中，肠杆菌科细菌常见的 是弗氏柠檬酸菌。弧菌属中则以溶藻弧菌，弗氏弧菌和副溶血性弧菌较为多见( 陈奖励 等，1 9 9 3 ) 。 1 2 6 海水养殖中的细菌性鱼病 细菌性疾病在海水鱼类中最为常见而且是危害较大的一类疾病。随着养殖事业的发 展，有关这方面的研究报告也日渐增多。与病毒性疾病不同，病原可以进行人工培养， 在光学显微镜下一般都可看得见，用化学药物可以进行防治。 有些细菌是条件性致病菌，即平时生活于海水中、底泥中或健康的鱼体上，但在鱼 体受伤或环境条件对鱼不利时，就可能侵入鱼体并引起疾病。海水鱼类的致病菌种类主 要有：噬纤维菌科( c y t o p h a g a c e a e ) 、单胞菌科( p s e u d o m o n a d a c e a e ) 、肠杆菌科 ( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 、弧菌科( v i b r i o n a c e a e ) 、链球菌科( s t r e p t o c o c c a c e a e ) 、微球 菌科( m i c r o c o e c a c e a e ) 和丙酸杆菌科( p r o p i o n i b a c t e r i a c e a e ) 等。其中弧菌病是海水鱼 类最常发生的细菌性疾病。弧菌病的病原主要是鳗弧菌( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) ，它是 条件致病菌之一，症状和病理变化随着患病鱼的种类不同而有差别，确诊须用细菌学的 鉴定方法。假单胞菌病在海水鱼类上已发现2 种：荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 和恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 。这种病发生主要是因为密度过大 或投饵过多或环境不清洁造成的( 孟庆显，1 9 9 6 ) 。 1 2 7 军曹鱼的细菌病害 随着上世纪九十年代军曹鱼养殖在中国台湾开始获得成功，网箱养殖军曹鱼的渔民 大量增加，养殖规模扩大带来的负面情况也日益明显。例如2 0 0 2 年，几种疾病的发生造 成了大幅度的减产。由细菌引起的疾病发生在军曹鱼养殖的各个阶段。在仔鱼期就开始 出现问题，这包括由于e p i s t y l i s 、n i t z c h i a 和n e o b e n e d e n i as p 的寄生引起的 s t r e p t o c o c c u s s p 的继发性感染，造成军曹鱼幼鱼失明，因为失明的个体的摄食行为将 大大减慢，身体着色很暗，其经济价值不高。出血性败血病是由p h o t o b a c t e r i u md a m s e l a s u b s p 和p i s c i c i d a 引起，该病在冬季爆发是军曹鱼幼体在网箱养殖中主要的问题之 一，能导致高致死率。成鱼在海水网箱中养殖的另一种细菌病是弧菌病。第一次有记 录的弧菌病爆发是在2 0 0 0 年，那一次产量减少了4 5 。那一次的弧菌病的病原是v i b r i o a l g i n o l y t i c u s ，症状特点是皮肤和骨骼肌出血，并伴随着包含矿v u l n i f i c u s 和矿 p a r a h a e m o l y t i c u s 的继发性感染( l i a o ，2 0 0 4 ) 。此外，还分离出三种主要的细菌病原 ( pd a m s e l as u b s p p i s c i c i d a 、矿a l g i n o l y t i c u s 和s t r e p t o c o c c u ss p ) 并进行了抗体研究 ( l i a o ，2 0 0 4 ：l i n ，2 0 0 5 ) 。 在中国大陆对军曹鱼的病害也有报道，例如2 0 0 3 年7 月湛江海区有军曹鱼因创伤 弧菌( v i b r i ov “l n i f i c u s ) 而大批死亡( 简纪常等，2 0 0 3 ) ；海南i 临高也发生了蜡状芽胞 杆菌引起的军曹鱼大批死亡( 冯斯敏等，2 0 0 0 ) 。 1 2 8 军曹鱼肠道细菌和其养殖水体细菌间的相互关系 在海洋中，任何一种生物的周围存在着其它生物。生物间的相互作用，构成非常复 杂和多样化的关系。概括地讲，海洋细菌问及同其它海洋生物间既包括竞争、捕食关系， 也包括共栖、互利、寄生、偏害和原始合作等共生关系。这种相互联系、相互依赖、相 互制约、相互影响的关系，是在长期进化过程中形成和发展起来的，对增加生态系统的 稳定性具有重要意义。 海洋细菌间存在着非常复杂的关系。如厌氧条件下，海洋光合细菌利用环境中由硫 酸盐还原菌还原硫酸盐所产生硫化氢作为供氢体，以硫酸盐还原菌氧化有机物所产生的 二氧化碳作为碳源，进行光合作用，将二氧化碳还原成细胞物质，同时又将硫化氢氧化 为硫酸盐，生成的硫酸盐及有机碳又可为硫酸盐还原菌所利用。二类细菌共存时均可产 生更多的细胞物质，形成互利关系。亚硝酸盐细菌与硝酸盐细菌的协同作用，可将有机 氮化合物分解后所产生的氨，有效地氧化成硝酸盐；在海洋中这两类细菌往往伴生在一 起，对氮循环具有重要作用。海洋细菌间还广泛存在着拮抗关系。多种海洋细菌( 如假 单胞杆菌、弧菌等) 在其生命活动过程中，能够产生抗菌物质，抑制对其分泌物敏感的 其他细菌，这种现象同细菌相互间的空间和营养竞争密切相关。 海洋动物与海洋细菌间的共生关系也非常普遍。附生于海洋动物体表的细菌能够有 效利用宿主所释放出的营养物质：某些鱼类被细菌附着后，游泳速度获得提高。如虾卵 表面共生的交替单胞菌能够产生抑制病原真菌的化学物质，而在无这种细菌的环境中卵 则容易受到真菌的侵袭。除了共生外，海洋细菌还能生活于海洋动物体内，其相互关系 更加密切。如船蛆能够有效地吸收利用共生于其消化道内细菌固氮及降解纤维素产生的 营养物质；共生于海底热泉附近的动物体内的硫化细菌因能氧化硫化物进行有机物初级 生产，维持了这类动物的生存；某些海洋动物利用其发光器官内发光细菌所发出的光用 于捕食等活动，而发光细菌则可以从动物中获得营养，二者间具有一种互利共生关系。 另外，海洋细菌还可以同海洋动物进行空间竞争，如通过释放拮抗物质，抑制无脊椎动 物幼体在固体表面的附着。 海洋细菌同海洋动物相互关系研究具有重要意义。其中，研究最多的是海洋动物消 化道中细菌的作用。通过溶菌酶作用，海洋动物能够消化吸收所摄入体内的细菌；栖居 于消化道内的细菌能够形成特异的微生物区系( 如弧菌等是海洋动物消化道中常见的细 9 菌) 。它们通过释放胞外酶( 也包括由于动物溶菌作用所释放的酶) 分解动物所吞食的、 难以消化的有机物质，如几丁质等，产生氨基酸、维生素及其他营养物质供动物利用。 实验发现，牡蛎( c r a s s o s t r e av i r g i n i c a ) 在无菌条件下，生长缓慢、变态困难及存活率 很低。除提供营养外，动物肠道内正常细菌群落还能通过分泌抗菌物质等，抑制病原菌 的侵入：或者其正常稳定的细菌群落利用排它性特点排斥病原菌，具有较强的抗干扰能 力。海洋细菌在无脊椎动物幼虫的附着与变态过程中，具有促进及抑制的双重作用，因 此对于水产养殖及海洋防污具有重要意义。目前发现共生于多种海洋动物体内的细菌能 够产生具有应用价值的活性物质。另外，多种细菌能够寄生于海洋动物体内外，常常引 起寄主致病或死亡。如弧菌、气单胞菌( a e r o m o n a s ) 等能够感染鱼、虾、蟹、贝等各 种海水养殖动物，使养殖业遭受严重的经济损失( 相建海，2 0 0 3 ) 。 总之，成功的水产养殖有赖于更好地对养殖生物和养殖体系中生长的细菌群体之间 复杂相互作用的认识，而且微生物的控制和利用在水产养殖中也有很大的潜力。 1 3 军曹鱼细菌的分子分类与鉴定 分类是人类认识客观事物的一种基本方法。对事物的种群划分，是概念发生的起点， 是一切理性思维的前提。有关弧菌分类最权威的工具书当属伯杰氏系统细菌学手册， 它主要是基于各种生化特性与形态特征进行分类的，然而，这种鉴定方法操作烦琐、发 费时间长、工作量大、需要有较强的专业知识的人员才能有效完成，而且，往往难以与 标准株所有的生化反应均一致，进一步增加了弧菌分类鉴定的难度。为了解决以上方法 的不足，一些商用的细菌鉴定系统如b i o l o g 鉴定系统、a p i 鉴定系统、b b lc r y s t a l 半 自动，全自动细菌鉴定系统、r a p i d n fp l u ss y s t e m 细菌快速鉴定系统、m i c r o s c a n 鉴定 系统及v i t e k 全自动化微生物鉴定系统等也应运而生了，它们一般都是基于与已建立 的标准株部分生化反应或抗生素敏感性的数据库比对而得出相应的相似值，根据相似值 的大小确定被检样品的种类，如a p i2 0 e 是利用2 3 种标准的小型生化反应管的测试结 果与用标准株建立的数据库对比而获得相应的相似值( i d e n t i f i c a t i o n ) ，主要用于鉴定肠 杆菌科细菌与不需要特殊营养的革兰氏阴性杆菌，b b lc r y s m le n t e r i c n o n f e r m e n t e r ( e n f ) i d 试剂盒则利用与标准株的3 0 种脱水反应与酶反应的比对，用于鉴定临床 常见的重要的好氧的肠杆菌科细菌，而b i o l o gg n 2 板则是利用9 5 种不同碳源的反应结 0 果来检测氧化酶阳性的革兰氏阴性杆菌。这些半自动或全自动细菌鉴定系统能以标准化 的操作，短时间内完成大量样本的鉴定工作，现也已广泛用于弧菌种的鉴定。例如。有 人( t h o m p s o n 等，2 0 0 3 ) 利用b i 0 1 0 9g n 2m i c r o p l a t e s 与a p i2 0 n es y s t e m 联合使用， 发现了珊瑚p o c i l l o p o r ad a m i c o r n i s 的一种与水温相关的新条件病原菌h b r i o c o r a l l i i l y t i c u s ：，g l e n n 等利用v i t e k 革兰氏阴性菌鉴定板与r a p i d 细菌快速鉴定系统成 功地鉴定出患者血液中分离的创伤弧菌。而且，在方法上也有不少的改进，g y l l e n b e r g 等人( 2 0 0 2 ) 通过利用随机复杂度最小化与累积分析的方法能更效地发现弧菌新种 ( g y l l e n b e r g 等，2 0 0 2 ) 。然而，这些快速、方便的鉴定系统在弧菌的鉴定上往往出现一 些相佐的结果，使得这些鉴定系统都无法独立用于弧菌等海洋细菌的鉴定与分类研究， 也难以直接用于水生动物病原菌的鉴定。比如，c a r o l i n e 等人评估了a p i2 0 e 、b b l c r y s t a l e n f 、m i c r o s c a n n e g i d 2 、m i c r o s c a n r a p i d n e g i d 3 、v i t e k g n i + 与v i t e k i d - g n b 共6 种商用细菌鉴定系统对l o 种常见弧菌病原的鉴定准确率，这1 0 种弧菌分别是溶藻 弧菌( 1 2 株) 、霍乱弧菌( 3 0 株) 、美人鱼弧菌( d a m s e l a e ) ( 1 0 株) 、河流弧菌( 1 0 株) 、弗氏弧菌( 矿f u r n i s s i i ) ( 4 株) 、霍利斯弧菌( 1 0 株) 、梅氏弧菌( 1 4 m e t s c h n i l o v i i ) ( 9 株) 、拟态弧菌( 1 0 株) 、副溶血弧菌( 3 0 株) 及创伤弧菌( 1 0 株) ，结果表明，这 6 种鉴定系统的平均准确率分别为6 3 + 9 、8 0 9 、6 3 1 、7 3 6 、7 3 5 和7 7 7 ，因 此，这些鉴定系统在对弧菌作出结论性鉴定时，必须还要有其它方法的补充说明 ( c a r o l i n e ，2 0 0 3 ) ；p o p o v i c 等人在利用a p i2 0 e 和b b lc r y s t a le n t e r i c n o n f e r m e n t e r ( e n f ) i d 试剂盒签定养殖的海鲤d i e e n t r a r c h u sl a b r a x 体内的常规分离细菌时也指出， a p i2 0 e 虽然是鱼类病原最常用的鉴定系统之一，但它的准确率只有3 7 ，而b b l c n ，s h a le n t e d c n o n f e r m e n t e r ( e n f ) i d 试剂盒的结果更准确些，但这两种鉴定系统在 鱼类病原的鉴定中都有可能出现错误的结果( p o p o v i c ，2 0 0 4 ) 。 如上所述，现有的各种商用细菌鉴定系统都是基于部分生化反应而建立的，在弧菌 的鉴定中都会出现与真实结果相佐的情况。现代遗传学的观点认为：物种是一个具有共 同基因库的、与其他类群有生殖隔离的类群。这个定义把有无基因交流作为划分物种的 主要依据，形态上十分不同的类群，只要能彼此杂交，依然是一个种。对弧菌而言，生 理生化反应属于重要的特征内容，基因组的相似性才是弧菌种的界定最根本、最直接的 特征。因此，弧菌种的鉴定与分类系统研究最有效、最直接的方式应该从弧菌基因组的 研究出发，通过比较基因组的相似性从而确定弧菌的归属。在这个意义上，前人已经发 展了多种基因组的研究方法，如d n a 杂交分析( d n a h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s ) 、限制性 片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t l lp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、随机扩增多 态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l i m o p h i cd n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多态性 ( a m p l i f i e df r a g m e n t - l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 等。前人的研究还表明，有的基因 或基因片段如1 6 sr d n a 是垂直传播的，种内具有高度的保守性，同时它们的可变区域 具有种间差异，为弧菌种属分类提供了更为方便的重要依据。总之，这些分子鉴定与分 类方法可以分为两大类：一类是以基因组为对象的分类研究，另一类是以部分基因或基 因片段为对象的研究。 如上所述，前人的研究表明，在细菌基因组中，某些基因只能亲子间垂直传播，或 者具有进化的保守性与种的特异性，它们可以用于细菌种的鉴定与分类。这些基因及其 研究手段有：核糖体基因与弧菌分类与鉴定，g y r b 、i o x r 基因与弧菌鉴定与分类以及 多基因位点分型与弧菌鉴定与分类等。 1 3 1 核糖体基因与弧菌分类与鉴定 细菌的核糖体基因包括5 s 、1 6 s 和2 3 sr d n a ，它们在进化中的保守性决定了其功 能的稳定性。其中1 6 sr d n a 长度约1 5 0 0 b p ，由1 0 个可变区与1 1 个恒定区组成，它 的序列变化与进化距离相适应，被称为进化分子钟。这种大小合适( 有利于测序工作的 完成) 、易于设计引物的保守性基因片段已广泛用于细菌的种属鉴定与分类，以1 6 s r d n a 序列作为区分细菌的原则已得到普遍承认( c a n a r d 等，1 9 9 2 ) 并且已有多个国际 上通用的数据库，如g e n b a n k ( n a t i o n a li n s t i t u t e s o fh e a l t h ， h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 、e m b l ( e u r o p e a n m o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y 。 h t t p ：w w w e m b l - h e i d e l b e r g d e ) 、d d b j( d n a d a t ab a n ko f j a p a n ， h 郇：，d d b j n i g a c j p ) 、r i b o s o m a l d a t a b a s e p r o j e c t 1 10 a t t p ：r d p e m e m s u e d u i n d e x j s p ) 。研究弧菌1 6 sr d n a 最直接、最准确的方式是其p c r 扩增产物直接测序并 与以上数据库比对，依据同源性的大小确定其种的归类。有人在形态学与生化反应的基 础上，通过1 6 sr r n a 基因测序比对后，确定引起鲍鱼r u d i t a p e sd e c u s s a t u s 大量死亡的 菌种为亮弧菌生物i i 型与溶藻弧菌，从台湾分离的凡纳滨对虾病原之一为溶藻弧菌病 原。( g o m e z - l e o n 等，2 0 0 5 ；l i u 等，2 0 0 4 ) 由于1 6 sr d n a 含有多种核酸内切酶的切 割位点，因此，在1 6 sr d n a 特异性引物的作用下，基因组的p c r 扩增产物可以直接 用于r f l p 分析，如j e n s e n 等利用1 9 个标准株作参照，从1 0 3 个比目鱼h i p p o g l o s s u s h i p p o g l o s s u s 的正常菌群分离株基因组p c r 扩增了约1 5 0 0 b p 的1 6 sr d n a ，所有的扩增 产物用a l u i ，b s t u i ，c f o i 和r s a i 酶切，电泳后得到了2 2 种遗传型的限制性酶切图谱， 结果表明，这种比目鱼的正常茵群主要是弧菌属、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 和气单 胞菌属( a h e r o m o n a s ) 的成员，在这1 0 3 株中，只有9 个株例外，它们是海藻施旺氏 菌( s h e w a n e l l aa l g a ) 、d e l e y am a r i n a 和m a r i n o m o n a sp r o t e a ，最为常见的种为杀鲑鱼 弧菌( s a l m o n i c i d a ) ( j e n s e n ，2 0 0 2 ) 。u r a k a w a 等从日本近海分离了1 3 6 株属弧菌科 的菌种，对其1 6 sr d n a 进行了r f l p 分析并建立了系统树，这些细菌共分为5 大组， 第一组主要是亮弧菌类细菌，第三组主要由弧菌属细菌组成，第四组主要是霍利斯弧菌 类细菌，第二、第五组则由未知的弧菌科细菌组成( u r a k a w a ，1 9 9 9 ) 。以1 6 sr d n a 为 对象，n i l s s o n 和s t r