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脂肪细胞分化的w n t 信号通路中1 1 1 ic r o r n a 表达谱 分析及其功能研究 专业：动物学 博士生：覃丽梅 指导教师：陈瑶生 摘要 猪体内脂肪沉积是一个非常复杂的过程，而脂肪细胞的分化是脂肪形成的第一步， 其分化的分子机制非常复杂，到目前为止尚未完全研究清楚。m i c r o r n a s ( m i r n a s ) 是近 几年来发现的内源性小分子r n a ，长度在2 2 - 2 4 n t 左右，可以降解基因的转录本或影响蛋 白的翻译和表达，在转录后水平负调控基因的表达。近年来发现w n t b - c a t e n i n 信号通 路在脂肪细胞的分化中扮演分子开关( s w i t c h ) 的作用，即脂肪细胞的分化必然伴随着 w n t 信号通路的抑制；相反，w n t 信号通路的激活也伴随着脂肪细胞的分化的抑制。鉴于 在脂肪分化的分子机制研究中同时涉及w n t 信号通路以及m i r n a 的研究非常少，本文利用 小鼠脂肪细胞结合脂肪分化和沉积相关的w n t 信号通路，旨在阐明m i r n a 是如何调控w n t 信 号通路从而影响脂肪细胞的分化机理。 本研究首先建立了关于脂肪细胞分化的两种模型，一种是正常分化的细胞模型，即 用m d i 激素诱导3 t 3 - l i 小鼠前体脂肪细胞使其分化为成熟脂肪细胞，该细胞模型伴随着 中山大学博士学位论文覃丽梅 w n t 途径受到抑制；另一种是抑制分化模型，即先用l i c l 处理3 t 3 一l l 小鼠前体脂肪细胞， 进而用m d i 激素诱导发现细胞分化受到抑制，即l i c l 处理的前体脂肪细胞无法分化为成 熟脂肪细胞，该细胞模型伴随着w n t 途径受到激活。 其次将两种细胞模型下的4 种细胞( 前体脂肪细胞，成熟脂肪细胞，l i c l 处理的前 体脂肪细胞，l i c l 处理后m d i 诱导的未分化的细胞) 和小鼠的m i r n a s 芯片杂交，筛选不 同分化状态下及信号通路的不同状态下表达有差异的m i r n a s 。通过生物信息学软件以及 在线软件工具对m i r n a 的靶基因进行预测，找到两组功能不同的m i r n a s ：第一组是通过 激活l e n t 信号通路，抑制脂肪细胞分化的m i r n a s ，有2 9 个m i r n a ，包括m i r - 3 4 4 ，m i r 一2 7 a n dm i r - 1 8 1 ；第二组是通过抑制w n t 信号通路，促进脂肪细胞分化的m i r n a s ，共1 8 个 m i r n a ，包括m i r 一2 1 0 ，m i r - 1 4 8 a ，m i r - 1 9 4 ，m i r - 3 2 2 等。 最后对部分m i r n a 的功能进行验证，结果发现m i r 一2 0 5 ，m i r 一2 1 0 ，m i r 一3 7 8 可以通 过靶向w n t 通路中的基因，抑制了w n t 信号通路从而促进脂肪细胞的分化；与此相反， m i r - 2 3 a ，m i r - 7 0 9 ，m i r - 2 7 a b 通过靶向w n t 信号通路的抑制因子，从而激活w n t 信号通路 抑制脂肪细胞的分化。 本研究首次结合m i r n a 和w n t 信号通路对脂肪细胞分化的分子机制进行探讨，对脂 肪细胞分化的不同阶段以及w n t 信号通路激活与抑制的不同状态中的m i r n a 进行表达谱 分析，同时对这些差异表达的m i r n a 进行靶基因预测以及靶基因互作的网络分析，并对 m i r n a 的具体功能进行实验验证，不仅为脂肪分化的表达调控提供新的思路，也为猪肉质 的改良的研究提供理论参考。 关键词：m i r n a ；1 j l n t ；脂肪；分化；3 t 3 - l 1 脂肪细胞分化的w n t 信号通路中m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 m i c r o r n a p r o f i l ei n v o l e di nw n t p - c a t e n i ns i g n a l i n g p a t h w a y a n ds t u d yo nt h er o l e si na d i p o g e n e s i s m a jo r ：z o o l o g y n a m e ：q i nl i m e i s u p e r v i s o r ：c h e ny a o s h e n g a bs t r a c t a d i p o g e n e s i si st h ep r o c e s so fp r e a d i p o c y t e sd i f f e r e n t i a t i e di n t om a t u r ea d i p o c y t e s ， w h i c hi sa ni m p o r t a n te v e n td u r i n gl i p i d sf o r m a t i o n ；h o w e v e rt h ed e t a i lm e c h a n i s mi sr e m a i n u n c l e a rs of a r m i c r o r n a s ( m i r n a s ) a r en o n - c o d i n gr n a s2 2 - 2 4 n ti nl e n g t ht h a tr e g u l a t e s d i v e r s eb i o l o g i c a lp r o c e s s e sa tt h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e lb yc o n t r o l l i n gm r n a s t a b i l i t yo r t r a n s l a t i o n m i r n a sa r ev e r yc o n s e r v e da n dr e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o ni nm e t a z o a n sf r o mc e l e g a n st oh u m a n s m a n ys t u d i e sh a v es h o w nt h a tm i r n a sp a r t i c i p a t ei nm u l t i p l em e t a b o l i c p r o c e s s e si n c l u d i n ge n e r g yh o m e o s t a s i s ，s u g a r l i p i dm e t a b o l i s ma n dc e l ld i f f e r e n t i a t i o n t h e c a n o n i c a lw n t i g c a t e n i ns i g n a l i n gp a t h w a y , w h i c ha c t sa sam o l e c u l a rs w i t c hi na d i p o g e n e s i s ， i ss u p p r e s s e dd u r i n gt h ef o r m a t i o no fl i p i dd e p o t s t h ea i mo fo u rs t u d i e sw a st oi d e n t i f y m i r n a st h a tm i g h tb ei n v o l v e di nt h i sr e g u l a t i o nd u r i n ga d i p o g e n e s i s w ef i r s t l yc o n s t r u c t e dt w ot y p e so fc e l lm o d e la c t i v a t i o na n dr e p r e s s i o no fw n t s i g n a l i n g ，a n di n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o np r o f i l eo fm i c r o r n a si nt h ef o u rt y p e so fc e l l s ，i e v 中山大学博士学位论文覃丽梅 p r e a d i p o c y t e s ，m a t u r ea d i p o c y t e s ，l k l l i u mt r e a t e dp r e a d i p o c y t e s ，a n dl i + m d it r e a t e dc e l l s s e c o n d l yw e u s e dam o u s em i c r o a r r a yt oi d e n t i f yd i f f e r e n t l ye x p r e s s e dm i r n s t h eh i g h t h r o u g hm i c r o a r r a yd a t ar e v e a l e d 18m i r n a st h a tm i g h tp r o m o t ea d i p o g e n e s i sb yr e p r e s s i n g w n ts i g n a l i n g ：m i r - 210 ，m i r - 14 8 a , m i r - 19 4 ，m i r - 3 2 2e t c o nt h eo t h e rh a n d ，w ea l s o i d e n t i f i e d2 9m i r n a st h a tm i g h tr e p r e s sa d i p o g e n e s i sb ya c t i v a t i n gw n t s i g n a l i n g ：m i r - 3 4 4 ， m i r - 2 7a n dm i r - 181 t h et a r g e tg e n e so ft h e s em i r n a sw e r ea l s op r e d i c t e dt h r o u g ho n l i n e t o o l s f i n a l l yw ev a l i d a t e dt h et a r g e tg e n e so fm i r - 2 0 5 ，m i r - 210 ，m i r - 3 7 8 ，m i r - 2 3 a ，m i r - 7 0 9 ， m i r - 2 7 a b ，t h er e s u l t ss h o w e dm i r - 2 0 5 ，m i r - 210 ，m i r - 37 8c o u l dp r o m o t ea d i p o g e n e s i sb y r e p e r s s i n g w n ts i g n a l l i n g p a t h w a yt h r o u g ht a r g e t i n gt h e f a c t o r so fw n ts i g n a l l i n g m e a n w h i l e ，m i r - 2 3 a , m i r - 7 0 9 ，m i r - 2 7 a bm i g h tr e p r e s sa d i p o g e n e s i sb ya c t i v a t i n gw n t s i g n a l l i n gp a t h w a yt h r o u g ht a r g e t i n gt h ei n h i b i t o ro fw n ts i g n a l l i n g o u ts t u d ys u g g e s tt h ep r e s e n c eo fm i r n a si nt w oc e l lm o d e l s ，p r o v i d i n gi n s i g h t si n t o w n t p a t h w a y s p e c i f i cm i r n a st h a tc a nb ef u r t h e rc h a r a c t e r i z e df o rt h e i rp o t e n t i a lr o l e si n a d i p o g e n e s i s t oo u rk n o w l e d g e ，o u rs t u d yr e p m s e m st h ef i r s ta t t e m p tt oi n v e s t i g a t et h e m e c h a n i s mo fa d i p o g e n e s i sb yc o m b i n i n gt h er e g u l a t i o no fw n t s i g n a l i n gw i t hm i r n a sa n d o f f e r sad e e p e ri n v e s t i g a t i o ni n t ot h en o v e lm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fa d i p o g e n e s i s k e y w o r d s ：m i r n a , w n t , a d i p o g e n e s i s ，3 t 3 - l 1 中山大学博士学位论文覃丽梅 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。保密的学 位论文在解密后使用本规定。 学位论文作者签名：嘎誓) 晦 日期：x 【3 年6 月i e t 导师签名： 日期：纠啤 脂肪细胞分化的w n t 信号通路中m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 第一章前言 1 1 脂肪细胞分化的研究进展 1 1 1 脂肪细胞分化的特征 细胞分化( c e l l u l a rd i f f e r e n t i a t i o n ) 是指个体发育中，由一个或一种细胞增殖 产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，它是一种持久性的变化， 不仅发生在胚胎发育中，而且贯穿于生物的整个生命过程中，以补充衰老和死亡的细胞， 如多能造血干细胞分化为不同类型的血细胞。分化了的细胞将一直保持分化后的状态， 直到死亡。脂肪细胞分化指不含脂滴的成纤维多能干细胞或前体脂肪细胞定向分化为充 满脂滴的脂肪细胞的过程 1 ，2 。对在动物个体而言，细胞分化的结果是形成白色脂肪 组织( w h i t ea d i p o s et i s s u e ，w a t ) 和褐色脂肪组织( w h i t ea d i p o s et i s s u e ，b a t ) 。白 色脂肪组织的外观呈白色，广泛分布在体内皮下组织和内脏周围，主要功能是将体内过 剩的能量以中性脂肪的形式储存起来，以供机体使用。褐色脂肪组织的外观呈褐色，广 泛分布在肩胛骨间、颈背部、腋窝、纵隔及肾脏周围，其细胞内含有大量的脂肪小滴及 高浓度的线粒体，细胞间含有丰富的毛细血管和大量的交感神经纤维末梢，组成了一个 完整的产热系统。两种脂肪组织在体内的颜色和功能相反，共同维持体内的脂肪代谢的 平衡。而当机体消耗的能量超出摄入的能量时，储存在脂肪细胞内的甘油三酯就会被分 解成自由脂肪酸释放出来，以补充体内其它细胞或组织的生理需求；当摄取的能量大于 消耗时，机体就将多余的能量以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞中，引发脂肪沉积和其 他代谢综合症 3 。 2 0 世纪7 0 年代，g r e e n 和k e h i n d e 从1 7 1 9 天小鼠胚胎的中胚层多能干细胞中分 离培养得到3 t 3 - l 1 和3 t 3 一f 4 4 2 a 细胞株，在诱导后，二者都能特异性地分化成脂肪细胞， 故两种细胞被定义为前脂肪细胞系 4 ，5 。两种细胞系的建立，实现了在实验室模拟体 中山大学博士学位论文! 曜丽梅 内脂肪细胞生成的过程，为我们研究脂肪细胞的分化机制提供一个可操作的模型。脂肪 细胞的分化大致分为以下几个阶段，即细胞生长的停止，细胞形态的改变，脂类合成酶 的表达，腊质的聚集和对胰岛素的敏感性增加。就3 t 3 一l 1 前体脂肪细胞而言，在分化过 程中要经历细胞生长抑制的阶段，即细胞长满达到接触抑制，退出细胞周期，停止有丝 分裂。接着在激素分化诱导剂( 包括3 一异丁基2 一甲基黄嘌呤，地塞米松和胰岛素) 的刺 激下，细胞会再次进入细胞周期进行两轮的细胞分裂，即克隆扩增，然后一系列转录囡 子开始表达，这时候脂肪细胞的表形开始出现，比如纤维状细胞转变为圆球形，胞内出 现脂滴，随后细胞进入脂滴累积的永久性的终端分化状态 6 ，7 ，分化的过程见图卜1 。 尸 ( ：p m 啪m u ”“l e n ：黜磐“( 。 m y o b l a s t 。纂芝参 。滤爹“ ? ；怒旷5 、 。 少“- m e i j p o g e n e s l sa n d i 向i y c e r i a e 卵t h e $ 1 $ e 曩 i d h h 唧i o n i i 图1 i 脂肪细胞分化过程 f i g u r e1 1t h ep r o c e s so f a d i p o g e n e s i s 1 1 2 脂肪细胞的分化过程中的分子事件 脂肪细胞在分化过程中获得不同的形卷学表型的同时也经历了复杂的生物化学变 化，包括各种蛋白质有秩序的出现和三酸甘油酯的积累。利用蛋白双向电泳将分化前、 分化中和分化后的细胞抽提液进行电泳分析，发现在开始分化的5 小时内，至少有1 0 0 种蛋白质的表达情况发生了改变，在达到终端分化时，至少又有2 0 0 种蛋白质的表达发生 改变 8 。这些蛋白质包括以下几种类型：与脂类台成和酯解作用有关的蛋白( 如乙酰 脂肪细胞分化的w n t 信号通路中m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 c o a 羧化酶，激素敏感的酯酶等) ；与激素作用和信号传递有关的蛋白( 如胰岛素受 体，g 蛋白质等) ；与细胞骨架和胞外基质的结构或功能有关的蛋白( 如肌动蛋白，胶 原等) ；具有细胞外生理功能的分泌蛋白质( 如血管紧张素原，i g f - i ，饱食因子等) ； 转录激活因子( 如小鼠p p a r g ，c e b p a ) 9 。脂肪细胞的分化过程很长，可持续至l j l 4 天，在这个过程中，有利于脂肪细胞分化或脂肪细胞所特有的蛋白质增加，抑制脂肪细 胞形成或对脂肪细胞的生理功能不必要的基因表达则被抑制。无数基因的这种有严格时 序的变化大多数发生在转录水平。目前的研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体- g a m m a ( p p a r g ) ，c c 从t 增强子结合蛋白一a l p h a ( c e b p a ) 和脂肪细胞定向分化因子一1 ( a d d 一1 ) 是脂肪细胞分化过程中最重要的转录因子。 1 1 2 1p p a r 家族 过氧化物酶体增殖物激活受体( p p a r s ) 于1 9 9 0 年首次发现，是一类由配体激活的核 转录因子，属于核激素受体超家族成员 1 0 ，包括p p a rq 、p p a r1 3 ( 亦称p p a r6 ) 和p p a r g ( p p a ry ) 。在功能上，p p a r g 的成脂作用最强，p p a rq 的作用较弱，而p p a r1 3 几乎无作 用 11 。小鼠p p a r g 基因位于第6 号染色体e 3 2 f i 位上 1 0 3 。p p a r g 在脂肪细胞分化早期有 少量表达，在脂肪细胞分化的过程中，p p a r g 的表达水平不断升高，到成熟脂肪细胞表达 最高。p p a r g 是目前所知唯一在脂肪组织中高水平表达的转录因子，对脂肪细胞的分化有 非常重要调节作用。研究发现，p p a r g 敲除的小鼠由于细胞分化障碍而死于胚胎期，但 p p a r g 过度表达则导致严重的脂代谢紊乱。p p a r g 可诱导脂肪细胞在体外分化，同时能上 调a p 2 、磷酸烯醇或丙酮酸羧基酶( p e p c k ) 基因的表达，而且其诱导分化的细胞在形态 上与内源性脂肪细胞无任何差异 1 2 。p p a r g 可使3 t 3 成纤维细胞i 为c e b p a 的表达增加， 从而促使其转化为脂肪细胞 1 3 。c e b p a 缺陷的小鼠导致p p a r g 的表达受限，使脂肪细胞 分化受阻碍 1 4 。 1 1 2 2 c e b p 家族 c c a a t 增强子家族( c e b p s ) 是具有激活特定基因d n a 增强子c c a a t 重复序列功能 的转录因子，家族成员均含有一个保守的亮氨酸拉链结构，它的3 个成员c e b pq ，c e b p 3 中山大学博士学位论文覃丽梅 1 3 。c e b p6 可以和p p a r g 协同作用，可调控脂肪细胞的分化。在分化的早期，转录因子 c e b p1 3 和c e b p6 的表达很快增加，随后激活c e b pq 和p p a r g 。有研究表明，c e b pb 和c e b p6 双敲除小鼠棕色脂肪细胞明显减少，但白色脂肪细胞仅轻度减少 1 5 ，但单 独敲除c e b pq 的小鼠，体内的棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞均大大减少，细胞内脂质积 累也急剧下降 1 6 。c e b pq 在3 t 3 l l 前脂肪细胞中过量表达会引起脂肪细胞自动分化， c e b pq 基因敲除的老鼠因为没有脂肪组织，有严重的代谢紊乱，在出生后一周内死亡。 可见在脂肪细胞的分化过程中，c e b pq 的作用非常重要。 1 1 2 2a d d - 1 脂肪细胞定向和分化因子( a d d _ 1 ) 在1 9 8 9 年被发现，又称固醇调节元件结合蛋白 ( s r e b p i ) 。a d d l 基因所编码的蛋白都有三个结构域，一是是氨基末端的转录活化域，包 含“碱性螺旋一环一螺旋一亮氨酸拉链 的核心结构，二是中间的两个跨膜的疏水结构域， 三是羧基末端的调节结构域。a d d i 是脂肪细胞分化过程中一种重要的核转录因子，它能 同p p a r g 启动子结合促进p p a r g 表达，在脂肪分化的过程中，a d d l 不但与p p a r g 和c e b p a 共 同控制脂肪细胞的分化过程，同时还直接参与调节与脂肪酸，甘油三酯和葡萄糖代谢相 关的酶基因的表达 1 7 。 1 1 2 3 抑制脂肪细胞分化的因子 在脂肪细胞分化过程中，一些抑制脂肪细胞分化或对脂肪细胞功能不必需的基因的 转录表达被抑制，如肿瘤坏死因子一q ( t n f q ) 、前脂肪细胞因子- 1 ( p r e f 一1 ) 、c u p 、 w n t 等。t n f - c l 可直接通过抑$ 1 1 c e b pq 和p p a r g 的表达，从而抑制一系列脂肪细胞特异 性基因的表达，对脂肪细胞分化起负性调节作用。p r e f _ 1 在前脂肪细胞上大量表达，在分 化过程中水平逐渐下降，最后在成熟细胞中消失。在3 t 3 - l 1 细胞上过度表达的p r e f _ 1 可 抑$ ! j c e b pa 和p p a r g 的表达，从而抑制分化。另外，c u p 也是一个抑制脂肪细胞分化的因 子，它在分化早期阶段下降，减少其本身与c e b pq 启动子的结合，从而促进c e b pq 的表达，对脂肪细胞早起分化具有重要意义 1 6 。此外维甲酸，巨噬细胞炎症相关蛋 白- 2 ( m r p 一2 ) ，g a t a 等因子均为脂肪细胞分化的负调控因子 1 8 。 4 脂肪细胞分化的w n t 信号通路巾m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 1 2w n t 信号通路在脂肪细胞的分化的中的研究进展 1 2 1w n t 信号通路的起源 w n t 基因在1 9 8 2 年在研究小鼠乳腺肿瘤病毒( m m t v ) 中发现，并命名为i n t l 基因， 后来发现i n t l 基因与果蝇的w i n g l e s s ( w g ) 基因属同源基因( o r t h o l o g o u sg e n e ) ，因而将 二者合称为w n t 基因。随后从线虫到人类的不同器官中陆续发现了很多w n t 同源基因， 其中在人中发现了1 9 个w n t 基因，小鼠中发现1 8 个w n t 基因 1 9 。w n t 基因编码产物为 含有3 5 0 4 0 0 个氨基酸的糖蛋白，约3 9 - 4 6 k d ，所有的w n t 家族成员均含有保守的2 2 - 2 4 个l 一半胱氨酸残基。w n t 是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用 2 0 。w n t 家族胞外蛋白可激活3 条不同的通路：经典w n t 通路( w n t 1 3 - c a t e n i n 通路) ；w n t c a 2 + 通路；细胞平面极性通路( w n t p o l a r i t y 通路) 2 1 。w n t b - c a t e n i n 信号通路是目 前研究的最为深入、对细胞分化起重要作用的一条通路，被成为经典的w n t 通路。w n t 蛋 白既可与自产细胞的膜受体结合发挥白分泌调节作用，也可与邻近细胞( 几个细胞直径) 的膜受体结合发挥旁分泌调节作用 2 2 。此外，众多的胞内蛋白质分子参与w n t 信号的 转导与调节发育过程中，在特定的时间和特定的环境诱导下，某些组织或细胞群体分泌 w n t 蛋白 2 3 2 5 。w n t 基因的功能最初是诱导肿瘤形成，后来许发现其在细胞繁殖、生 物发育过程中发挥着重要作用 2 2 。 1 2 2w n t 信号通路的信号转导 经典w n t 信号转导的分子机制在不同物种中具有极高的保守性：静息状态下，胞内外 都没有w n t 信号，此时胞浆内大部分连环蛋白( b - c a t e n i n ) 被束缚在由细胞膜向胞内伸 出的e 一钙黏着蛋白( e - c a d h e r i n ) 2 6 和细胞骨架蛋白( a c t i n ) 上，小部分b - c a t e n i n 与 糖原合成酶激酶一3b e t a ( g s k 一31 3 ) 、结肠腺瘤样息肉病蛋白( a p c ) 和轴素( a x i n ) 共同形 成的多聚蛋白复合物结合，同时复合体上的g s k - 31 3 能磷酸化游离1 3 - c a t e n i n ，使其通过 泛素一蛋白酶体系统( u p s ) 降解，从而保持胞质内的b c a t e n i n 处于较低的浓度 2 7 。而 出现w n t 信号时，w n t 蛋白与细胞膜上7 次跨膜受体卷曲蛋白( f z d ) 及复合受体低密度脂蛋 s 中山大学博士学位论文覃丽梅 白受体相关蛋l 刍s o ( l r p 5 6 ) 结合 2 8 ，2 9 ，激活细胞内的散乱蛋白( d v l ) ，d v l 激 活后可抑制g s k 一3b 对b c a t e n i n 的磷酸化，从而使b c a t e n i n 在胞质中稳定存在并逐渐 积累，当b c a t e n i n 暴积到一定程度的时候，便可转位到细胞核中，与含有i t m g b o x 的转 录因子l e f i t c f 家族成员结合，激活w n t 信号通路下游基因的转录调控 3 0 - 3 7 ( 图卜2 ) 。 融辫 少瀛猢忠 笥亨、 ! w 獗出坝 !舔 图1 - 2w r i t 信号通路( 曲静息状态和( b ) 激活状态内部分子互作图 f i g u r e1 - 2i r n c t i v e ( a ) a n da c t i v e ( b ) s t a t eo f w n 邶一c a t c n i np a t h w a y 1 2 3 肿信号通路调控脂肪细胞的分化 近十年来，w n t 在脂肪细胞的分化中所扮演的角色越来越受到人们的重视。2 0 0 0 年， r o s s 报道了w n t 信号在维持前体脂肪细胞未分化状态，抑制脂肪形成中起重要作用。 w n t l o b 是第一个报道的w n t 信号通路中抑制脂肪细胞分化的成员 3 8 。w n t l o b 的表达量 在3 t 3 一l 1 前体脂肪细胞生长、融合过程中高表达，在m d i 的诱导后降低，可见w n t 信号 通路在细胞水平抑制脂肪细胞的分化 3 8 ；用w n ti 逆转采病毒表达载体转染3 t 3 一l 1 前 体脂肪细胞，再用i 诱导，可抑制脂肪细胞的分化；在小鼠体内注射转染了w n t l 基因 的3 t 3 一f 4 4 2 a 前体脂肪细胞无法形成脂肪垫，而足成纤维细胞样的细胞簇，而对照细胞 睡 2 日幽口目 脂肪细胞分化的w n t 信号通路中m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 却在数周内形成脂肪垫。在稳定表达w n t - l o b 的小鼠体内，脂肪组织总量下降5 0 ，附睾 和肾周围的脂肪挚总量下降6 0 。此外，与野生型小鼠相比，表达w n t - l o b 的小鼠有较高 的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。可见w n t 信号通路在成体水平也可以抑制脂肪细胞组 织的形成 3 9 。 1 3 m i r n a s 在调控脂肪细胞分化中的研究进展 1 3 1m i r n a 的发现和作用机制 1 9 9 3 年，在线虫体内发现一种不编码蛋白的r n a 1i n 4 ，它可在翻译水平通过抑 制一种核蛋白1 i n 一1 4 的表达而调节了线虫的幼虫发育进程 4 0 。2 0 0 0 年，第二个m i r n a l e t 一7 被发现，其结构与l i n - 4 相似，同样可以调节线虫的发育进程 4 1 。十多年来， 人们应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式发现了很多m i r n a ，根据2 0 0 9 年9 月 m i r b a s e 公布的数据，现已发现的m i r n a 中，人( h o m os a p i e n s ) 有7 2 1 个，小鼠( m u s m u s c u l u s ) 有5 7 9 个，病毒( v i r u s e s ) 有1 7 6 个 4 2 ，4 3 ，这些研究成果大大丰富了人 们对m i r n a 的认识和了解。m i r n a s 不同于编码r n a ，它们具有以下独特的结构和生物特性： 成熟的m i r n a 长度为2 2 2 4n t ：m i r n a 前体具有发夹或折叠的二级结构，不含有大的内 部环状结构和突起，且成熟的m i r n a 应位于发夹结构的颈部：成熟的m i r n a 由d i c e r 加 工而成，伴随d i c e r 功能活性的减少，可以检测到生物体中前体的积聚；成熟m i r n a 的序 列和预测的发夹结构在不同物种间是保守的 4 4 。m i r n a 产生的过程始于一个m i r n a 基因 的p r i m i r n a ( p r i m a r ym i r n a ) 约7 0 一l o o n t 的转录本，p r i - m i r n a 在核内被核糖核酸酶 d r o s h a j j h i 处理而最终成为p r e m i r n a ( p r e c u r s o rm i r n a ，) 随后被核输出蛋白e x p o r t i n 5 转运入胞质，被第二个核糖核酸酶d i c e r 消化为2 2 2 4 n t 的m i r n a ，然后即结合r i s c ( r n a i n d u c e ds il e n c i n gc o m p l e x ) 与靶标m r n a 互补结合发挥生物学作用 4 5 。m i r n a 和靶序列的互补程度决定了靶基因m r n a 的命运，如果它们结合的序列完全互补，则该基 因会在转录水平被抑制，如果结合序列不完全互补，则该基因会在翻译水平被部分抑制 ( 图i - 3 ) 。m i r n a 可以靶向多个基因，多个m i r n a 也可调节同一个基于，形成一种复杂的 调节网络。m i r n a 在多种动植物种起到最基本的生物学作用，不仅调控生物体的生长和发 育过程，而且参与调控多种生理学和病理学过程，如细胞分化、细胞增殖、胰岛素的分 7 中山人学博十学位论文覃丽梅 泌、脂肪代谢以及肿瘤的形成 4 6 图1 3m i r n a s 在体内的形成及参与调控基因表达的过程 f 1 9 i - 3f o r m a t i o no f a n d f u n c t i o n o f m i r n a s i nb o d y 1 3 1m i r n a 参与脂肪细胞的分化过程 近几年来在脂肪细胞分化的研究中，m i r n a 调控作用越来越明显的被人们发现。由 于m i r n a 是一种内源性r n a 它可参与生物体内的代谢过程，包括脂类物质的生化，脂肪 细胞分化以及胰岛素分泌和抵抗等过程。2 0 0 3 年，x u 等年在果蜗( d r o s o p h i l a ) 中发 现m i r1 4 可抑制细胞凋亡同时发现m i r 1 4 可负调控脂肪代谢，即m 1 r 1 4 的缺失导致 了甘油三酯( d a g ) 和甘油二酯( t a g ) 的水平增加 4 7 。2 0 0 4 年，e s a u 等通过微阵列来 分析分化的脂肪细胞中m i r n a 表达，并发现m i r1 4 3 对脂肪细胞分化有促进作用。当用 m i r1 4 3 反义r n a 寡核苷酸转染前体脂肪细胞中，发现脂肪细胞分化的特异基因和甘油三 脂肪细胞分化的w n t 信号通路中m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 酯聚积受抑制。同时，作者通过生物信息学预测i r 一1 4 3 的靶标是e r k 5 ，通过实验表明 m i r - 1 4 3 可能通过靶基因e r k 5 参与脂肪细胞分化 4 8 。四年后，t a k a n a b e 在高能量饲引 发的肥胖小鼠体内发现肠系膜脂肪组织内m i r - 1 4 3 的表达量上调，m i r 一1 4 3 的表达量的上 调伴随着小鼠体重和肠系膜脂肪的增加，这两个报道的结果这提示m i r 一1 4 3 不仅在细胞水 平参与脂肪细胞的分化，而且在成体水平也参与调控脂肪组织的形成和沉积。2 0 0 6 年， k a j i m o t o 等对3 t 3 - l 1 前体脂肪细胞分化中的m i r n a s 进行了表达谱研究，从前体脂肪细 胞和诱导分化的第l 天和第9 天建立的m i r n a 库，用n o r t h e r nb l o t t i n g 方法识别了8 0 个 m i r n a 4 9 。2 0 0 8 年，l i n g 用m i r - 3 7 5 质粒转染3 t 3 一l 1 细胞后，发现脂肪滴的数量比对照 细胞多，这提示m i r - 3 7 5 能促进脂肪细胞的分化r 5 0 。2 0 0 8 年，w a n g 报道了一簇 m i r n a ，m i r _ 1 7 9 2 在脂肪细胞的分化的克隆性增值阶段表达量显著上调，对稳定表达 m i r - 1 7 - 9 2 的3 t 3 - l 1 的细胞进行m d i 诱导，发现甘油三酯的含量增加。此外，作者还发现 m i r - 1 7 - 9 2 在脂肪细胞的分化的克隆性增值阶段可以抑s u r b 2 p 1 3 0 的转录以及蛋白水平 5 1 。2 0 0 9 年，t a n g 通过基因芯片技术发现大鼠脂肪基质细胞( a d s c ) 脂向分化过 程，r n o - m i r - 3 1 ，r n o - m i r - 1 2 5 b - 5 p 和r n o - m i r - 3 2 6 的表达量均在分化后下调，此外，通 过生物信息学分析，这几个m i r n a 是靶向脂肪分化的特异基因，提示这三个m i r n a 参与调 控脂肪细胞的分化 5 2 。2 0 0 9 年l i n 报道了m i r 一2 7 家族成员可抑制脂肪细胞分化的分化 5 3 。同年，k a r b i e n e r 发现m i r 一2 7 b 在人脂肪来源多潜能干细胞( h m a d s ) 向脂肪细胞分 化的过程中表达量大量下调，过表达i n i r - 2 7 b 能降低p p a r g ，c e b p a 的表达，同时甘油三 酯的积累也减弱，p p a r g 的3 u t r 有m i r - 2 7 b 的结合序列，而且该序列高度保守，这表明 m i r - 2 7 b 是h m a d s 分化的负调节因子，其靶点是p p a r g 5 4 3 。2 0 1 0 年，k i m 发现m i r 一2 7 a 在 肥胖小鼠中脂肪组织的含量低于正常小鼠，而且在基质血管细胞中的表达量比脂肪组织 高。在3 t 3 - l 1 细胞中转染m i r - 2 7 a 后，脂肪细胞的分化受抑制，脂肪细胞分化特异基因 p p a r g 的表达量也降低，这些结果提示m i r 一2 7 a 可以通过靶向p p a r g 抑制脂肪细胞的分化， 对治疗代谢失调导致的肥胖有临床意义 5 5 。虽然m i r n a 在细胞增殖、凋亡、个体发育、 以及肿瘤的发生发展等发面发挥着重要的作用，同时m i r n a 在脂肪细胞的分化发面也起 了举足轻重的作用，但是m i r n a 是通过何种方式引起脂肪细胞分化改变的，以及有多少 m i r n a 与脂肪细胞分化有关，目前还不十分清楚，有待进一步研究 5 6 。 9 中山大学博士学位论文 覃丽梅 1 3 研究目标、内容与意义 w n t 信号途径作为分子开关能调控脂肪细胞分化，内源性m i r n a 也参与脂肪细胞的 分化，但是目前关于二者互作共同调控脂肪细胞分化的报道很少，本项工作的目的就是 找到在脂肪细胞分化的过程中调控w n t 信号通路的m i r n a ，并对其具体功能进行研究，为 了解脂肪细胞分化的分子机制，改善猪肉质提供一个新的思路。 脂肪细胞分化的w n t 信号通路中m i c r o r n a 表达谱分析及其功能研究 第二章脂肪细胞分化模型构建及m ir n a s 表达谱分析 高通量m i r n a s 表达谱分析起源于基因芯片技术，是分子生物学与微电子技术、高分 子化学合成技术、激光技术、信息科学技术和计算机技术等学科交叉融合而成的一项新 技术，是伴随着人类基因组计划的实施而发展起来的前沿生物技术 5 7 。它将大量的基 因探针有序地、高密度地排列在一块1 - 2 c m 大小的玻片或胶片上，形成可与目的分子相 互作用的固相表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进 行分析 5 8 。它最显著的特点是高通量、高集成、微型化、多样化和自动化。早在上世 纪8 0 年代，人们就根据计算机半导体芯片制作技术将晶体管集成在芯片上，并由此联想 到将寡核苷酸分子也集成在芯片上的最初设想 5 9 。1 9 9 5 年s c h e n a 在( n a t u r e ) ) 上第 一次发表关于基因芯片文章 6 0 。1 9 9 6 年，他们在硅片表明涂上一种光敏材料，利用光 蚀刻技术，在光引导下原位合成多肽链，随后又将多肽链改进成d n a 阵列，就在同年年 底，第一块d n a 芯片诞生 6 1 。短短十年时间，基因芯片技术发生了巨大的变化，同时 该技术已显示出了巨大的科研价值 6 2 。本章利用3 t 3 - l 1 小鼠前体脂肪细胞，使用鸡 尾酒法诱导前体脂肪细胞分化构建抑制w n t 信号通路的细胞模型，同时使用氯化锂 ( l i c l ，l i t h i u m ) 处理前体脂肪细胞构建激活w n t 信号通路的细胞模型，将两个模型的四 种细胞包括三个生物学重复共1 2 个样品与小鼠m i r n a 芯片杂交，筛选出一系列潜在调控 w n t 途径进而调控脂肪细胞分化的m ir n a s 。 2 1 材料和方法 2 1 1 实验材料 1 细胞系 1 1 中山大学博士学位论文 覃丽梅 3 t 3 一l 1 小鼠前体脂肪细胞购于美国a t c c ，c a t a l o gn o ：c l 一1 7 3 t m ，l o t n u m b e r ：5 7 7 1 2 5 9 9 。 2 试剂 d