（分析化学专业论文）重金属离子的微生物污染生态化学研究.pdf

郄豫大学礤士学位论文。 摘要 本论文包括三部分：第一部分为“鱼旦董耋邀生物的生物学特征和重金属研究 状况”；第二部分为“食用菌的培养生态化学研究”；第三部分为“食用菌中重金属 复合污染物的生态效应研究”。 第一部分： 研究了食用菌类微生物的生物学特性，并从六个方面( 营养条件、温度、湿度、 酸碱度、光照、空气) 说明了食用菌生长发育所需的外界条件。( 食用菌中的重金属 研究虽然取得了部分进展，但全面、系统的研究方法和分析技术尚不健全，尤其是 食用菌对重金属元素的耐性与适应性、食用菌的富集特性和食用菌对重金属复合污 染物的生态效应研究不足。y 第二部分： 通过一系列的培养生态试验，初步筛选出了适宜平菇、香菇、金针菇、杨树菇、 草菇、双孢蘑菇、木耳、凤尾菇、灵芝和巴话蘑菇等1 0 种食用菌的母种培养基配方 和原( 栽培) 种的培养基配方。利用原子吸收分光度计测定了l o 多种食用菌中的c u 、 z n 、p b 、c d 重金属含量，发现不同食用菌的富集重金属特性不同。f 不同培养料配方 栽培平菇、香菇、金针菇和木耳时，其富集锌能力各不相同，表吩了培养料的组成 和特性与食用菌富锌能力密切相关，并且不同食用菌在相似栽培环境中富集锌能力 各不相同。在利用土壤、牛粪栽培巴西蘑菇时，发现菇中的镉主要来自于土壤、牛 粪等辅料，说明了辅料在一定程度上决定了巴西蘑菇的富镉特性，在人工栽培时， 最好用尿素、硫酸铵等氮源代替牛粪，以深层土作为覆土来降低菇中的镉含量。利 用氨基酸自动分析仪测定平菇、香菇、草菇和蘑菇冲的氮基酸含量，探讨了结氨基 酸含量对于食用菌对重金属的富集性能的影响。y 第三部分： 研究重金属复合污染物对平菇生态效应的影响，分析了菌丝生长速度和抗杂性， 平菇的生物量，重金属离子的生物有效性，平菇对重金属的吸收与富集，重金属毒 性的差异和重金属离子的分配和迁移，综合分析了重金属的交互作用对平菇的生态 效应。 f 应用原子吸收分光光度计和氨基酸自动分析仪测定平菇，发现重金属和氨基酸 在菌盖中的含量明显高于菌柄。菌盖中锌随着铜、铅、镉的加入而减少，表现为拮 抗作用：但当其他重金属元素存在时，平菇吸收富集铜、铅、镉皆表现为协同作用。 与单元素污染相比，复合污染条件下菌盖中锌和铜的分配量减少，而铅和镉的分配 量增加；菌柄正好相反。复合污染后平菇的菌盖和菌柄中的氨基酸含量发生变化， 且重金属属迁移能力为镉 锌 铜 铅。y 一， 关键词t 重金属，食用菌，生态化学，吸收与富集，复合污染 vv 部豫大学硕士学位论文 a b s t r c t t h e r ea r et h r e ep a r t si nt h i sp a p e r t h ef i r s tp a r ti st h e r e s e a r c h a b o u t h e a v vm e t a l s ( h m s ) a n db i o l o g i c a lc h a r a c t e ro fe d i b l ef u n g i ：t h es e c o n dp a r t i se c 0 1 0 9 i c a lc h e m i s t r yd u r i n gt h ec u l t i v a t i o n o fe d i b l ef u n g i ：t h et h i r dp a r t i st h a te c o l o g i c a le f f e c to fc o m b i n e dp o l l u t i o nf o rh m si n p l e u r o t u so s t r e o t u s t h ef i r s tp a r th a sm a i n l t ys t u d i e do nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r o fe d i b l ef u n g i ， e x d l a i n e dt h ed e v e l o p m e n t c o n d i t i o no fe d i b l ef u n g i f r o ms i xa s p e c t s ( n u t r i t i o n a lr e q u i r e m n e t ，t e m p e r a t u r er a n g e ，p h ，m o l s t u r er e q i r e m e n t ，t h e e n v i r o n m e n tc o n d i t i o na n dt h el i g h t i n gc o n d i t i o n ) s t u d yo nh m sh a sa l r e a d y d e v e l o p e di n t h er a n g eo fy i e l do fe d i b l ef u n g i i t i s i n a d e q u a t e o nt h e r e s i s t a n c ea n da d a p t a t i o no fe d i b l ef u n g it oh m s ，e n r i c h m e n t sc h a r a c t e ra n d e c o l o g i c a le f f e c t o fc o m p o u n dp o l l u t i o nf o rh m si ne d i b l ef u n g i t h es e c o n dp a r th a sf i r s ts e l e c t e dt h eb e s tf o r m u l ao fm o t h e ra n ds t o c kc u l t u r em e d i u m w h i c ha d a p tt op e u r o t u so s t r e a t u & l e n t i n n se d o d e s f 1 m u l i n av e l u t i p e s , a g r o c y b e c y l i n d r a c e a , v o l v a r i e l l av o l v a c e a a g a r i c u sb i s p o r u & a u r i c u l a r i aa u r i c u a , 融e a t o t u s m e m b r a n c e n & g a n o d e r n al u c i d i u ma n da g a r i c u sb 2 a z e i t h er e s u l t ss h o wt h a ti t i sd i f f e r e n tf o re d i b l ef u n g it oa b s o r p ta n da c c u m u l a t e 肌sf r o ma n a l y i so fad o z e ne d i b l ef u n g i s t h ee x p l a n a t i o nc o u l dr e s ti nt h ed i f f e r e n e c o l o g i c a lc h a r a c t e ra n dm a t a b l o l i cr e s p o n s e st o 删s w h e np e u r o t u so s t r e a t u & l e n t i n u s e d o d e s , f l a m m u l i n av e l u t i p e s , d g r o c y b ec y l n d r a c e aw e r ec u l t i r a t e dw i t hf i f t hf o r m u l a o fs u b s t a t e t h es t u d yi n v e s t i g a t e dt h es i t u a t i o no fc dp o l l u t i o ni nf o u rm a i np r o d u c i n g a r e a si nh e n a np r o v i n c ew h e na h a u i c u sb l a z e iw a sa r t i f i c i a l l yc u l t i v a t e dw i t hc a t t l e m a n u r e ，s t r a wa n ds o i l a m o n gt h ed i f f e r e n tm a i nm a t e u i a lt e s t e d ，s o i la n dc a t t l em a n u r e m a i n l yp r o v i d e dc da c c u m u l a t e db yd g a r i c u sb i a z e l t h ea b i l i t yt oa b s o r p t i o na n d a c c u m u l a t i o no fe d i b l ef u n g ii sr e l a t e dt oa m i n o a c i di n d e x t h et h i r dp a r ts t u d i e de c o l o g i c a le f f e c to fc o m b i n e dp o l l u t i o nf o rh m s i np l e a r o t u so s t r e a t u s , m e a s u r e dt h e1 i n g t ha n da n t i w e e d - m o u l d sa b i l i t yo f h y p h a e ，b i o m a s so fp e a r o t u so s t r e a t u & b i o v a i l a b i l i t yo fh m s ，h m se n r i c h m e n t ， t h ev a r i e t yo fh m st o x i c i t ya n dt h et r a n s f o r m a t i o na m dr e d i s t r i b u t i o na b i l i t y o fh m s t h ee c o l o g i c a ld f f e c to fh m so np e a r o t u so s t r e a t u si sr e v i e w e d h m sm e n t i o n e da b o v ew e r eh a r m f u lt ot h eg r o w t ha n dy i e l do fp 1 e u r o t u s o s t r e a t u & b u tc dc o u l de n h a n c eb i l l o g i c a le f f i c i e n c y a m o n g 咖st e s t e d c d w a sh i g h l ya c c u m u l a t e dw h i l ep bw a ss l o w 1 l m si np i l e u sw a sh i g h e rt h a ns t i p e w h e n c u ，p b ，c d ，c o n c e n t r a t i o n a r e 1 0 0 ，3 0 0 ，1 5 m g k g r e s p e c t i v e l y 。z n c o n c e n t r a t i o nd e c r e a s e si n p i l e u s w h e no t h e rm f sw e r ea d d e d c u ，p b ，c d ，c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i o ni ny e u r o t u so s t r e a t u & t h et r a n s f o r m a t i o n a n dd i s t r i b u t i o ni s h i g h e rt h a ns i n g l ee l e m e n t ，c d z n c u p b k e y 霄o r d s ：h e a v ym e t a l s ，e d i b l ef u n g i ，e c o l o g i c a lc h e m i s t r y ，a b s o r p t i o n a n da c c u m u l a t i o n ，c o m p o u n dp o l l u t i o n n 郑纳大学碗士学位论文 第一章食用菌类微生物的生物学特征和研究状况 食用菌是指可供人类食用的大型真菌，包括平菇、香菇、蘑菇、草菇、金针菇、 木耳、银耳、鸡腿菇、猴头菇等。食用菌类是世界性的健康食品( h e a l t hf o o d ) 或 功能食品( f u n c t i o nf o o d ) ，不仅以富含蛋白质、维生素类而为世人所重，富含生理活 性物质，如高分子多糖体( p o l v s a c c h a r i d e ) 、天然有机锗( n 0 g e r m a n i u m ) 、c a m p 、 三萜类化合物等，对于维护人体健康有着极其重要的利用价值。重金属作为食用菌 营养成分之一，多与菌体中的蛋白质、氨基酸、多糖等结合，对其生长发育具有重 要意义。低浓度的z n ( 1 0 0 p p m 下) 有益于食用菌的生长发育；低浓度的c u ( 1 0 p p m 以下) 可提高平菇产量，朵型增大。食用菌对重金属有不同程度的富集作用，栽培 料中重金属含量又各不相同，应注意控制重金属的添加浓度和具体方式与时机，确 保食用菌的安全食用。研究重金属在食用菌中的富集行为对于健康发展食用菌产业 有着极其重要的作用。 1 1 食用菌类微生物的生物学特征 食用菌是异养生物，具有一般生物所共有的生命活动规律，需要从外界环境中 不断吸收营养物质并加以利用，从中获得生命活动所需要的能量及合成细胞的物质， 同时排出废物。这就要求创造满足食用菌菌丝生长和子实体生长发育所需的营养、 温度、湿度、光照、通气、酸碱度等条件【l 3 j 。 一、营养：碳源、氮源、无机盐和生长素等。 二、温度：不同的食用菌在不同的生育阶段，都有不同的最适生长温度和最高最 低的极限温度。常见食用菌的温度范围见表1 1 ： 表1 1 几种常见食用菌对温度的要求( ) 三、水分和湿度 水在食用菌细胞中以两种形式存在：自由水和结合水。水分是新陈代谢、吸收 营养必不可少的基本物质，主要来源于培养基。基质的水分含量直接影响菌丝重金 属子实体的形成和发育，适合食用菌生长的含水量通常在6 0 左右。 湿度是指空气相对湿度，也就是空气中水蒸气的百分数。不周的食用菌在不同 阶段对空气相对湿度的要求也有所不同见表1 2 。 香菇 金针菇 杨树菇 草菇 蘑菇 木耳 风尾菇 灵芝 巴西蘑菇 四、酸碱度：食用菌所处的酸碱环境，会影响菌体细胞内的酶活性，细胞膜的 渗透性，以及对金属离子的吸收能力。培养基的酸碱度决定了溶液中的金属离子状 态，如镁、锌、铜、铁等金属离子，在呈碱性时，易生成不溶性盐，不能被菌丝吸 收利用；反之，在酸性培养基中，会抑制硫氨素合成酶的活性，从而影响菌丝生长。 大多数食用菌( 除草菇外) 喜欢在偏酸的环境中生活。适合菌丝生长的p h 值在3 8 ， 以6 6 5 为宜，p h 值大于7 时，生长受阻；p h 值大于9 时，几乎完全停止生长。不同 种类的食用菌对p h 值的要求不同( 见表1 3 ) 。表中所列最适p h 值，并非配制培养基 时的p h 值。 表1 3几种常见食用菌对酸碱度的要求 五、氧和二氧化碳 食用菌不能进行光合作用，靠氧化作用分解糖类，吸收氧气，呼出c 0 2 。故栽培 2 黔 如 鲇 鳄 如 ：2 叫 弧 洛 洛 睁 洛 睁 踞 弧 加 加 加 加 舳 为 加 缸 雏 缸 缸 协 他 缸 缸 弛 加 ：会 竹 加 加 醯 似 钞 裕 舡 舡 缸 似 舡 珏 辜曩薯誓薰馨喜纂誓茎霎莩备塞晷墓娄暴轰了舅爨罗票篙嚣荛羹昌耗；薹主誊堡 蓑鬟蓍嘉冀震籍翥譬曩籍! 蒜黧星豢：j 。魏淼宴翟嚣备未 纂翟凳萎裹鬟勰；嚣嚣燃端錾磊菰器茹 平菇等属于二氧化碳敏感菌；香菇、木耳、金针菇等属二氧化磺抵抗孽；寸辈孽蟹 赢形威阶段具有“趋氧性”，而一定浓度的二氧化碳通过调节氧和二氧化碳浓度的措 六、光照： 食用菌不同于一般的绿色植物，没有叶绿素，不能进行光合作用，因此，不需 要直射光，但生长环境保持一定的散射光。光照对菌丝体生长有光毒作用，对子实 体分化促进作用，对子实体形态发育的生物学效应等说明食用菌的生长发育与光照 密切相关，而且不同的生长阶段对光的要求及的影响也不相同。只有少数种类，如 蘑菇等，可在完全黑暗的条件下完成其生活史。不同食用菌对光照强度的需要是有 区别的( 见表1 4 ) 表l _ 4 几种常见食用菌生长发育对散射光的需要 注：“”表示需要散射光 “+ 表示在黑暗处能形成子实体，但无散射光时，子实体生长畸形 “+ + ”表示在一定散射光子实体才能形成，暗处不形成子实体。 1 2 食用菌中重金属的研究 食用菌产业作为近年来发展迅速的新兴产业，以其投入小、见效快、效益高， 在农业生产中已显示出强大的生命力。人工栽培的主要原料转向农副产品及工业废 料。由于栽培原料的来源不同，重金属含量也有很大差异。某些金属元素的离子( 如 锌、铜等) 在浓度低至毫微克分子时，作为营养性阳离子，是食用菌生长必需的微 量元素。当浓度高至微克分子或毫克分子离子浓度时，对食用菌细胞生长、发育造 成毒害；但某些金属元素的离子( 如c d 、a g 、h g 等) ，即使很低的浓度，也会对食用 菌细胞产生很强的毒性。在上述情况下，单靠调节阳、阴离子转运系统的转运蛋白 的合成和活性，是不能降低这些有毒重金属离子在细胞内的浓度而达到解毒效果的。 一些食用菌具有富集重金属和耐受高浓度重金属的能力，与其子实体中含有一些金 部妈大学硕士学位论文 。一 曩籍鑫箬亨蛋查薯蓄毒；氐芋差叁复篙龛篓磊銮霍鬈吾赛雪霞差喜慕薹嵩皇墅訾凳移和储存，另一方面降低了这些金属元素的毒性，使菌体司以在两浓度阴里金j 禹兀 素环境中生存。抗性食用菌在污染环境中繁衍，通常是由于基因改变或生理适应 某些高等担子菌具有富集一些重金属的能力，在哈蟆菌中，钒的含量平均可达 1 6 0 8 毫克1 0 0 克干菇，大多存在菌褶，成熟后被转移到孢子内。某些生长速度快， 子实体产量高的食用菌，还会随着料的分解、吸收与运转而使一些有害的重金属被 富集到子实体内。就某一特定科、属、种的食用菌来说，某矿物质成分及其含量是 相对稳定的，但会随生长环境，特别是作为培养基的矿物质组成有重要影响，有些 地方菌株或栽培产品的矿物质成分产生较大变化，都与这些因素有关。 我国卫生部规定食用菌中的p b 含量的标准：干品不高于2 o m g k g 一，鲜品不高 于1 0m g k g 一，罐头不高于1 0m g k g 。由于p b 在食用菌中的分布比较均一， p b 的过量摄入可能引起贫血、肾功能衰竭、神经系统长期受损，并可能导致突变、癌 变【4 】。所以，我们必须加强对食用菌中p b 含量的检测，加强对食用菌富集p b 机理的研 究，确保食用菌成品质量合格。 我国对食用菌中c d 的限量无明确的规定，但参照其它食品中c d 的限量，比如蔬 菜( 0 0 5m g k g - ) ，肉鱼( o 1t i l g k 9 1 ) ，可以看出对食品c d 的限量要求是 很严格的。c d 是仅次于黄曲霉素和a s 的优先研究的食品污染物。低浓度的c d 刺激蘑 菇的菌丝生长1 5 】。食用菌子实层中的c d 含量高于其它部位，这可能因为子实体中功能 部位含有较多的c d 结合蛋白。但是食用菌中的c d 含量并不能作为环境中c d 污染的标 志，如蘑菇属样品中的高含量c d 并非污染引起，而是品种的特异性。 食用菌对重金属的响应受许多生物和非生物因子的影响，影响食用菌敏感性的 主要生物因子包括生物学特性、存在形式、生理年龄、组织形态、营养状态、生理 适应和遗传适应等，而非生物因子主要有重金属性质和环境因素。受污染地带的真 菌显示有对重金属毒害的耐受性。真菌菌盖在其自然中累积了高浓度重金属离子， 有效地起着过滤器的作用，保护树木不受重金属的毒害。 同植物相比，食用菌中的重金属含量较高，食用菌富集重金属的现象取决于两 方面的因素：一是环境因素，如空气污染、培养料和覆土牛粪等辅料的重金属含量、 粉尘、酸碱度、有机质等等：二是食用菌的内在因索，比如菌丝体和子实体的组织 结构、形态特征、降解有机能力、生长发育特性等等。这些因素都直接或间接地影 响了食用菌对不同重金属的富集能力和富集途径，决定了重金属在食用菌中的存在 形式，分布位置、含量和种类。 目前还无法清楚知道食用菌能够适应多大的毒物压力及如何适应不利环境的压 迫。由于复合污染比单一污染效应更接近环境实际情况，随着人们对单一污染了解 的深入，随着环境污染愈来愈依赖复合污染物的解释，复合污染的研究必将有更大 的发展。随着复合污染研究领域的进一步拓宽，随着分析测试技术、急性毒性试验、 长效应试验和蓄积试验等研究方法的逐步引入，开展食用菌的重金属作用生态化学 研究有着十分重大的现实意义。 1 3 食用菌中的重金一来源特征 1 3 1 水食用菌的各个生育阶段都离不开水，而我国随着现代工业的迅速发 展，废水、废气、废渣的大量排放，含重金属离子的农药、化肥、除草剂等的大量 使用，致使水环境质量日趋恶化，m i c h e l o td 等利用电感耦合等离子体原子发射光 谱分析法国巴黎地区9 2 种食用菌1 5 种金属元素的含量，发现同一品种的食用菌在 4 郑娲大学礤士学位论文 某些元素含量上因产地不同而有一定差异，在环境污染很少的地带，食用菌中的重 金属元素主要来自于水体或土壤”。 1 3 2 培养料一般是由木屑、秸杆、农作物副产品等组成的，由于木本植物对重 金属有一定的吸收积累，转化和降解作用，使积累的重金属污染物不会短期内释 放到环境中，可经过木屑进入培养料，间接通过食物链对人体造成伤害，重金属在 作物体内的分布呈现根、茎、叶、子实的规律陋1 ，在小麦、玉米和水稻子实中浓度 又各不相同“，这些原料都将最终影响到培养料中的重金属含量。 s t i j i v et 等研究了h g 在1 0 种食用菌中的吸收情况，发现其中8 种食用菌中 h g 的含量高于培养料中的h g 含量【l o l 。b r e s s a g 等研究了h g 在糙皮侧耳 ( p i e “r o t u so s t r e a t u s ) 中的富集情况，发现在含有h g 的人工堆料上栽培糙皮侧耳， 其对h g 的富集系数可达6 5 - - 1 4 0 ，最高含量可达2 1 2 m g k g - l ，但当培养料中h g 含量大于0 2 m g k g 1 时，影响糙皮侧耳的生长发育，而在无h g 污染的培养料上， 子实体中h g 含量极低，不存在富集现象l 。施巧琴等发现，在培养料中添加 5 0 r a g k g - l h g 时，食用菌子实体中h g 含量是培养料中不添加h g 所得子实体中h g 含量的1 0 0 多倍，而相似条件下，c d 含量是培养料中不添加c d 所得子实体中c d 含量的2 0 0 多倍【l2 l 。雷敬敷的研究结果表明，在培养料严重污染时，香菇、木耳对 p b 的最大累积量可达1 5 0 2 0 0 m g k g 1 ，而双孢蘑菇对p b 的累积量可达3 0 m g k g l m l ， 由此可见，培养料中重金属的含一显著影响了食用菌产品中的重金属含量，有关食 用菌富集吸收重金属元素的途径和机理有待于进一步的研究。 1 4 食用菌富集重金属元素的特性 不同的食用菌富集重金属的能力和途径存在一定差异，李开本等检测到姬松茸 ( d g a r i c u sb l a z e y ) 予实体中c d 的含量高达4 o 一6 8 m g g - 1 ，而对照的蘑菇含量为 0 5 7 5 m g g - 1 ，认为是姬松茸富集c d 的生物学特性所致，与栽培采用的培养料及覆土 材料无关岬】，草腐菌，特别是蘑菇属( a g a r i c u s ) 真菌对c u ，c d ，a g 有明显的亲和性； 而在森林地带生长的木腐菌则有明显的富集c r ，s e 和p b 的趋势【6 】，g a r c i ama 等 采集了1 3 种( 7 种木腐菌和6 种草腐菌) 9 5 个野生食用菌样品，测试p b 含量，发现食 用菌的种类、生长环境、子实体的形态及交通污染状况等因素对其富集p b 能力都具 有一定的影响，所有样品中p b 的平均含量为l m g k g 。1 干重，但在相同环境条件下，草 腐菌的p b 含量普遍高于木腐菌，其中鸡腿蘑和高大环柄菇( m a c r o p i o t ap r o c e r a ) 中 p b 含量相对较高【l ”，孙希雯研究金针菇富锌条件时发现，金针菇比白木耳的富集z n 能力强，可能由于z n 与蛋白质结合时主要是与柠檬酸基、半胱氨酸基、组氨酸基相 结合，而含有这3 种氨基酸基因的金针菇比白木耳高6 】田娟等发现金针菇在加入锌 的基质内生长时，子实体对锌有很强的富集作用；当基质含锌量达到一定水平后， 富锌效果减弱，其中以含锌量为8 0 0 r a g k g 。的水拌料，金针菇的富集作用最强，子实 体含锌量比对照提高1 4 5 【l ”钟恒发现草菇中锌含量大小为：菌盖 菌托 菌柄 “”，随着子实体由蛋期到成熟期菌托和菌柄中的锌向菌盖转移。锌较少与蛋白质结 合，较多与可溶性糖和游离态氨基酸等结合，或呈游离态存在。 1 5 本课题研究的内容和意义 我国是食用菌生产大国，产量居世界之冠，出1 ：3 量是世界第一。随着国内外消 费者营养、保健意识的提高，食用菌的市场将日益增长。由于许多国家把食用菌中 郑浦大学硕士学位论文 的铜、锌、铅、镉的含量作为进口食品检验的主要内容之一，为了进一步发展食用 菌生产，保障人民身体健康，开拓外贸市场，有必要研究和了解影响食用菌富集重 金属的环境因素和限制条件，掌握重金属在食用菌中的分析测试方法，尤其是重金 属复合污染物对食用菌生长发育的影响、复合污染物的交互作用及生态效应。不同 食用菌对重金属有不同的富集作用，通过了解培养基、土壤、空气、水等对富集系 数的影响，可制定相应的消除食用菌对重金属富集的措施，食用菌中的重金属生态 化学是极具潜力的研究领域，不仅可以发展起来一种主要用于清除重金属污染的白 色生态技术，而且这方面的研究成果，将为人类更好地利用食用菌资源做出更大的 贡献，使食用菌这种高蛋白、高营养的功能性保健食品更好地为人类服务。 食用菌对金属的富集能力和富集途径不同，因此，应根据不同食用菌的结构特 征，科学处理好各种栽培条件，通过生物、物理、化学或生物学途径控制食用菌中 重金属含量，减少重金属离子在生态系统中的传递，避免一些有毒重金属元素对食 用者造成伤害。另外，添加有益重金属元素拮抗有害重金属离子，利用元素间的相 互竞争作用，阻断有害重金属元素的吸收途径，降低有害重金属含量。富集有益的 重金属元素( 如c u 、z n ) 到食用菌中，为人类造福。 根据上述研究进展和现状，结合本单位生产实际安排食用菌富集重金属的人工 栽培实验，利用先进实用的分析方法和实验仪器对食用菌中的重金属元素进行准确 分析和检测，本课题主要做好以下三方面的工作： l 。合理安排食用菌的培养生态试验，重点以平菇、香菇、金针菇、杨树菇、草 菇、双孢蘑菇、木耳、风尾菇、灵芝和巴西蘑菇为研究对象，筛选出最适宜的母种 和原种( 栽培种) 培养基配方。 2 利用原子吸收分光光度计测定不同食用菌中的重金属含量，研究非污染条件 下食用菌对重金属的富集性能和重金属离子的含量变化趋势。在不同的培养料上， 考察平菇、香菇、金针菇和木耳的锌含量状况，研究栽培原料对食用菌富集性能的 影响，同时比较相似条件下不同食用菌的富集锌能力。通过土壤和牛粪等辅料的不 同，研究巴西蘑菇富集镉的主要来源。通过食用菌氨基酸含量的不同研究食用菌富 集重金属能力的大小。 3 在重金属复合污染条件下，研究平菇袋栽过程中的生态效应，平菇不同部位 富集重金属元素的特性，不同重金属元素在平菇体内的分配状况，重金属对平菇不 同部位氨基酸含量的影响，揭示出平菇袋栽过程中对复合污染适应性的大小及其生 态效应机理。 6 郑袖大学硕士学位论文 第二章食用菌的培养生态化学研究 2 1 食用菌的培养生态试验 栽培原料是食用菌生长的物质基础，其产量与培养料的种类和质量密切相关。 能够栽培食用菌的原料较多，木屑、棉籽壳、玉米蕊、麦秸、稻草、豆秸、花生壳、 棉柴杆等，以及大部分农作物秸秆和有些工业的副产品都可用于栽培食用菌。不同 原料的理化性质和营养成分不同，影响菌丝对营养物质的吸收和利用，有些原料需 进行科学合理的调配才能满足食用菌菌丝和子实体生长的需要。不同栽培原料的理 化特点和营养成分相差较大，有些原料不经处理和科学配制，往往造成菌丝生长不 好，不出菇或产量低。 2 1 1 实验部分 实验材料：琼脂、马铃薯、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、麸皮、葡萄糖、蔗糖、 淀粉和k h 2 p o 实验菌种：平菇、香菇、金针菇、杨树菇、草菇、蘑菇、木耳、风尾菇、 灵芝和巴西蘑菇。 实验设备：天平、试管、玻璃棒、电炉、手提高压锅、无菌操作台、恒温培养 箱、温度计、常规接种工具。 2 1 2 实验操作i ( 一) 母种培养基的配制 按照不同配方配制培养基，以p d a 培养基( 马铃薯2 0 0 9 + 葡萄糖2 噜+ 琼脂2 昭 + h ，0 1 0 0 0 m 1 ) 为例。首先将马铃薯去皮，切成薄片，放入锅内，加水1 0 0 0 m l ，加热 煮沸3 0 m 左右( 薯片煮至熟而不烂为止) 。用四层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂， 再加热煮沸。待琼脂完全溶化并成粘稠状液体后，再加入葡萄糖，搅拌，最后补足 水分至1 0 0 0 m l 。 配制好的培养基，趋热分装，装入量为试管高度的1 4 ，在液体未凝固之前直立 放置，及时装锅灭菌，待试管内培养基液的温度下降到6 0 左右时，取出试管，制 作斜面培养基。经过无菌检验，确认已灭菌彻底，才能使用试管培养基。实验中按 照上述方法配制了五种培养基p d a 培养基；p d a 综合培养基；p d a + m g s 0 4 0 5 9 + c a c l 2 0 i g + k h 2 p 0 4 1 9 + f e s 0 4 0 1 9 + ( n h , ) 2 s o , 3 9 ；麸皮浸出汁培养基；p d a + 麸皮l o o g ；玉米粉培养基：玉米粉4 0 9 + 葡萄糖l o g 十琼脂2 0 9 + h 2 0 l o o m l ； 苹果汁培养基：苹果l o o g + 蛋白肽2 9 + 葡萄糖2 0 9 + 琼脂2 0 9 + h ，0 2 0 0 0 m l 。 ( 二) 原种培养料的配制 原种培养料一般由棉籽壳、麦粒以及农作物秸秆等天然材料配制成的，各种原 料要求新鲜，干燥，无霉变结块，无虫蛀。水质要清洁，符合饮用水卫生标准。各 种原料的养分和物理性质都不相同，充分了解原料和辅料的成分和特性，就能合理 配制出优良的培养基质。原种培养基多采用棉籽壳发酵料和麦粒培养基：棉籽壳 8 5 + 麸皮1 0 + 石膏1 + 石灰4 ，配制方法：将石灰溶解于水，加入棉籽壳 中，拌匀至含水量为6 5 ，再堆积发酵1 5 2 0 d ，使用时加入麸皮和石膏粉，拌匀 后装瓶。小麦粒9 8 + 石膏2 ，先将小麦粒浸泡过夜，去掉杂质和不饱满的麦 粒。放入水中煮沸，熟而不烂为止。捞出沥干水分，摊开冷却，然后拌入石膏粉，装 瓶。此外，还可在麦粒中拌入棉籽壳或木屑，防止灭菌时瓶中迸水，造成麦粒破裂 7 邦炳大学硕士学位论文 或结成团。 培养料配制好后，装瓶，用塑料膜或棉花塞封口，高压灭菌。从灭菌锅内取出， 冷却后放入接种箱内。消毒杀菌后，严格按照无菌操作进行接种，培养室内培养菌 丝，培养室要求暗光干燥，通风换气良好，能够调节温度。 ( 三) 栽培种的培养料配制 与原种的培养料配方相同。用发酵法生产栽培种时，除用玻璃瓶外，还可用塑 料袋装料或袋装菌种。灭菌操作与原种的灭菌操作方法相同，但袋装培养料的灭菌 时间要稍加延长。冷却后，移入接种箱内，进行接种。在培养室内搭建培养架，放 置栽培种后培养菌丝。 2 1 3 结果与讨论 2 1 3 1 母种培养基的配方筛选 培养基是食用菌生长的物质基础，要求营养平衡，适当含水量和适宜的酸碱度。 栽培食用菌的原材料较多，理化性质和营养成分各不相同，影响菌丝对营养物质的 吸收和利用，需进行科学合理的调配才能满足食用菌菌丝和子实体生长的需要，表 2 1 一表2 1 0 是在不同的培养基上不同种属菌丝的生长情况： 表2 1平菇菌丝在5 种培养基上生长状况 生长速度 - i - ：- 1 2 345 图2 1 平菇菌丝在5 种培养基上生长 由此可见，p d a 综合培养基和麸皮培养基最适合平菇菌丝的生长，是制作母种 培养基的理想配方。 2 4 4 0 密中 整齐合适 1 l 3 5 3 0 浓密粗壮 整齐合适9 4 5 3 0 浓密粗壮 整齐合适9 立 一! ：! !量生墼壹盒运 ! 垒 郑州大学硕士学位论文 一 生长速度( m m d ) 舡l i u 23 45 图2 2 香菇菌丝在5 种培养基上 试验表明，玉米粉培养基和麸皮培养基最适合香菇菌丝的生长 一 壅! ：! 全盐蔓堕丝垄! 登堇蓥薹占生篓鉴鎏 i i i 磊i 丁磊磊磊函满黑间培养基生长速度( 呲d ) 密度生长势菌落边缘气生嗣丝量 一id i 。 2 5 5 0密粗壮整齐 合适 9 36 2 0浓密粗壮 整齐合适8 4 6 2 0浓密粗壮整齐较多8 55 1 0密中 整齐合适 1 0 1 工 23 45 图2 3 金针菇菌丝在5 种培养基上生长 试验表明，麸皮和玉米粉培养基最适合金针菇菌丝的生长，是制作母种培养基 的理想配方。 表2 4杨树菇菌丝在5 种培养基上生长状况 9 郑豫大学硕圭学位论文 一 123 45 图2 4杨树菇菌丝在5 种培养基上生长 试验表明，p d a 综合培养基、玉米粉培养基和麸皮培养基最适合杨树菇菌丝的生 长，是制作母种培养基的理想配方。 试验表明，苹果汁和麸皮培养基最适合草菇菌丝的生长，是制作母种培养基的 理想配方。 表2 6 蘑菇菌丝在5 种培养基上生长状况 0 郑悄大学硕士学位论文 图2 6 蘑菇菌丝在5 种培养基上生长状况 试验表明，玉米粉培养基和苹果汁培养基最适合蘑菇菌丝的生长，是制作母种 培养基的理想配方。 耋! ：! 查里堕丝垄! 型堕菱茎土生篓鉴翌：一一 培养基生长速度 密度生长势菌落边缘 气生菌丝量满管时间 方。 l l l l i 囊1 一 表2 8 风尾菇菌丝在5 种培养基上生长状况 郑蚋大学硕士学位论文 一 方。 12 34 5 一一一 图2 8 风尾菇菌丝在5 种培养基上生长 由此可见，麸皮培养基最适合风尾菇菌丝的生长，是制作母种培养基的理想配 表2 9 灵芝菌丝在5 种培养基上生长状况 12345 图2 9 灵芝菌丝在5 种培养基上生长 由此可见，麸皮和玉米粉培养基最适合灵芝菌丝的生长 表2 1 0 巴西蘑菇菌丝在5 种培养基上生长情况： 郑州大学硕士学位论文 一 图2 1 0巴谣蘑菇菌丝在5 种培养基上生长 由此可见，p d a 综合培养基和麸皮培养基最适合巴西蘑菇菌丝的生长，是制作母 种培养基的理想配方。 图2 1 1 各类食用菌菌丝菌丝在5 种培养基上生长 由图可知，各类食用菌菌丝对营养物质的生理需求不同，培养基成分各有侧重 按照实验结果合理选择各自适宜的母种培养基配方。 2 1 3 2原( 栽培) 种培养料的配方选择 食用菌菌丝体品种繁多，同一品种在不同地域或不同品种在同一环境条件下栽 培，其性状表现有很大差异。而就某一品种在当地条件下栽培是否优良，必须经过 比较试验才能确定。通过同一菌种在不同培养材料上生长状况的比较试验，可以考 察不同培养基对于不同菌种的生长影响。所选择的培养基主要是根据生产实践中最 为常用的几种：棉籽壳培养基；玉米粒培养基；高梁粒培养基：麦粒种培 养基：玉米芯5 7 + 麸皮2 0 + 粗玉米l o + 石灰粉4 + 过磷酸钙1 。 郑帕大学硕士学位论文 图2 1 0 平菇菌丝在5 种培养基上生长 由此可见，平菇菌丝比较适宜在高粱粒和麦粒培养基上生长。在食用菌栽培过 程中，添加不同的辅料可以提高平菇的生物学效率，如利用玉米秸秆和棉籽壳按1 ： 1 混合栽培平菇，菌丝生长速度快，满袋时间比纯棉籽壳提前6 天，投入产出比为1 ： 2 4 6 。 表2 1 3香菇菌丝在5 种培养基上的生长状况 由此可见，香菇比较适宜在麦粒培养基上生长，2 0 天可满瓶，比棉籽壳培养基 满瓶提前2 3 天，其生长速度较棉籽壳快一倍。 旧2加 8 o协掩m 包 6 8 8 m 垃坻 2 6 1 8 4 3 6 2 9 2 2 l l 互o 2 3 4 5 郄蛐大学硬士学位论文 一 2浓密整齐 适宜 2 0 3浓密 整齐 适宜 2 1 4浓密整齐 适宜 2 0 由l 而法丽i ：豪k 鑫煞薅蒜未磊争由此可见，金针菇较适宜在高梁粒、麦粒和玉米粒培养基上生长 表2 1 5杨树菇菌丝在5 种培养基上的生长鉴况 由此可见，杨树菇比较适宜在高粱粒玉米粒和麦粒培养基上生长。 表2 1 6草菇菌丝在5 种培养基上的生长状况 由此可见，草菇菌丝比较适宜在高粱粒和麦粒培养基上生长 图2 1 2 不同食用菌在5 种培养基上的满瓶时间图 表2 1 7蘑菇菌丝在5 种培养基上的生长状况 郑蚋大学碗士学位论文 由此可见，蘑菇比较适宜在麦粒培养基上生长。 表2 ! !查三堕丝垄! 登苎鲞董占堕生篓鉴堡 1 薷f 焉百1 霭夏r 瓦磊面瓢时间( d )培养基密度 菌落边缘 气生菌丝量满瓶时1 日j ( d ) 2浓密整齐 适宜 2 7 3浓密整齐 适宜 2 8 4浓密整齐 适宜 2 7 5密不整齐较少 3 4 由此可i 采丽莲丽匿蕊丽甄f 磊丽五蕊雨穰_ 酉露。 表2 1 9风尾菇菌丝在5 种培养基上的生长状况 由此可见，凤尾菇菌丝比较适宜在高粱粒和麦粒培养基上生长 表2 2 0灵芝菌丝在5 种培养基上的生长状况 由此可见，灵芝比较适宜在高粱粒和麦粒培养基上生长 表2 2 l 巴西蘑菇菌丝在5 种培养基上的生长状况 由此可见，巴西蘑菇比较适宜在玉米粒和麦粒培养基上生长。 1 6 郑州大学碗士学位论文 图2 1 3 不同食用菌在5 种培养基上的满瓶时间图 从实际生产和经济效益考虑，麦粒培养基比较适合原种的制备，而棉籽壳、玉 米芯、木屑、稻草等皆可作为食用菌的主要栽培原料由于各种原料物理性能和营 养成分差异较大，因此在用量上和用法上不尽一致。在配制培养料时，尽量使养分 含量、养分的释放量和食用茵菌丝分解吸收量达到均衡，既可增加产量，提高品质， 又可降低原料成本。 2 2 不同食用菌类微生物中重金属含量分布特征研究 我国大型真菌资源相当丰富，其中野生食用菌种类多达7 2 0 种，1 4 3 目，4 4 科 几乎包揽世界上已知约重要食用菌、野生食用菌按生态习性分种五种类型即：木生 菌、粪生菌、土生菌、虫生菌和菌根真菌。前两类一般容易分离活菌种或进行驯化， 而后三类贝u 相反。目前可以人工栽培的有：双孢蘑菇、平菇、香菇、凤尾菇、金针 菇、滑菇、猴头菇、杏孢菇、白灵菇、鸡腿菇、杨树菇、巴西菇、木耳、银耳、竹 荪、伏苓、灵芝、灰树花和虫草等3 0 多种，野生采集量较大的有松口蘑、牛肝菌、 羊肚菌、内蒙口蘑、干巴口蘑等。常见食用和药用真菌种类统计及应用见表2 2 2 ： 表2 2 2食用和药用真菌种类统计及应用类别 多数食用菌可兼作药用，许多药用真菌可食用，有的毒菌，经过处置后可以安 全食用。食( 药) 用真菌风味独特，营养丰富，能够改善人们的物质生活和食物结 构，防治疾病，增强体质，为发展经济建设发挥作用。食用菌种类丰富，栽培料来 源多而广泛，人工栽培投资少，见效快，经济效益高，适宜广大农村脱贫致富，又 和城市环保及废物利用相结合，受到各级政府和人民群众的欢迎。由于部分食用菌 1 7 郑强大学硕学位论文 - 一 对重金属具有一定的富集或生物转化作用，经常食用可通过食物链进入人体，从而 影响食用者的健康，因此，加强食用菌与重金属关系的研究，尤其是重金属复合污 染对食用菌生态效应的影响，对于食用菌产业健康发展，保护生态环境，维护人体 健康都有着十分重要的意义。 2 2 1 实验部分 实验材料与实验设备： 实验中所采用的样品均来自河南省农科院食用菌研究开