（分析化学专业论文）高效毛细管电泳安培检测的研究与应用.pdf

摘要 摘要 效毛细管电泳自问世以来在广泛的研究领域中日益显示出其强大的生 c e 具有高效、快速、耗样量小等优点已成为分析化学最前沿的研究 领域之一。在众多与c e 相联用的检测方法中，电化学检测( e 何以其特有 的优越性吸引着分析工作者：灵敏度高、选择性好、仪器简单。本文工作旨在 进行毛细管电泳柱端安培检测方法的应用研究， 1 高效毛细管电泳一柱端安培检测抗心率失常药物普萘洛尔 我们将碳纤维工作电极用于毛细管电泳电化学安培检测普萘洛尔。考察了 普萘洛尔的电化学行为，优化了检测条件。在最佳检测条件下：4 0 c m 长2 5 9 r n 内径毛细管；分离电压1 5 k v ：电迁移进样，在1 5 k v 下进样3 s ：1 2 v 检测电 位；p h7 5 ，l o m m o l l 磷酸盐缓冲溶液，此药物的检测限为5 x 1 0 4 m o f l ，线 性范围为l x l 0 4 - - 2 x 1 0 。m o l l ，线性相关系数为0 9 9 4 。电极稳定，重现性好， 用该法检测了人体尿样中的普萘洛尔并考察了其在尿样中的回收率，得到了令 人满意的结果，有一定的临床应用价值。 2 毛细管电j 1 8 c 柱端安培法分离分析多种抗心率失常药物 在碳纤维工作电极上检测了三种由毛细管电泳分离的b 一类肾上腺素受体 阻断剂：普萘洛尔、噻吗洛尔及醋丁洛尔。在最佳分离和检测条件下，在6 分 钟之内基线分离并检铡了此三种药物的混合物。普萘洛尔、噻吗洛尔及醋丁洛 尔的检测限分别为0 1 、0 0 1 、0 0 5 p a r t o l l ( n s = 3 ) ，线性范围分别为i - 1 0 0 、 0 2 1 5 0 、0 2 1 2 0 m m o l l ，线性相关系数都达到o 9 9 5 以上。在人体尿样中检验 了此方法的可行性，得到根好的结果。 ，、 关键谪：毛缀管区带电泳- 靠造辜基宅耽学裣灏8 一受锌疆颧裁 b f 一 前 一 一一 鲤! ! 坠曼! a b s t r a c t h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) h a sb e e nd e v e l o p e da sa p o w e r m ls e p a r a t i o nt e c h n i q u e a n d a p p l i e d i naw i d er a n g eo f a n a l y t i c a lf i e l d ss i n c ei t c a m eo u t i tp o s s e s s e sm a n ya d v a n t a g e si n c l u d i n gh i g hp e r f o r m a n c e ，h i g hs p e e d ， t r a c e a n a l y t e s a n d s a m p l ec o n s u m p t i o n e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( e c d ) i n c o m b i n a t i o nw i 也h p c et a k e sa d v a n t a g e so f h i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y f a i r l y s i m p l ei n s t r u m e n t sc o m p a r e dt o o t h e rd e t e c t i o nm o d e so fc e t h i sd i s s e r t a t i o n f b c u s e so nt h ea p p l i c a t i o no fc ew i t he n d c o l u m na m p e m m e t r i cd e t e c t i o nd e s c r i b e d a sf o l l o w i n g 1 d e t e r m i n a t i o no fp r o p r a n o l o l b yc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sw i t he n d c o l u m n a m p e r o m e t r i e d e t e c t i o n a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fp r o p r a n o l o l o nc a r b o nf i b r e e l e c t r o d e ( c f e ) b y c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s w a sd e s c r i b e d t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o rw a s o b s e r v e da n dt h ea n a l y t i c a lc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s w e r ea sf o l l o w i n g ：4 0c m l e n g t h2 5 哪i d s e p a r a t i o nc a p i l l a r y ；s e p a r a t i o nv o l t a g e 1 5k v ；e l e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o n3s e c o n da t1 5k v ；d e t e c t i o np o t e n t i a l + 1 2v ：p h7 5 1 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ed e t e c t i o nl i m i t r l o d ) o fp r o p r a n o l o lw a sa sl o wa s 5 x 1 0 z m o l la n dt h el i n e a rr a n g ew a sf r o m 1 1 0 。6m o 儿t o2 x 1 0 4 m o 此w i t ht h er e l a t i v ec o e f f i c i e n to f0 9 9 4 t h ec f e e l e c t r o d ew a ss t a b l ea n dr e p r o d u c i b l ed u r i n gt h ee x p e r i m e n t t h i sm e t h o dw a s a p p l i e dt oa n a l y z et h eh u m a n u l i l l es a m p l ea n dt h er e c o v e r yw a sa l s oi n v e s t i g a t e d w i t hs a t i s f a c t o r yr e s u r s 2 。d e t e r m i n a t i o no ft h r e e1 3 - b l o c k e r sb yc a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i sw i t he n d c o l u m ne l e c t r o e h e m i e a id e t e c t i o n e n d c o l u m ne l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no f t h r e es p e c i e so f1 3 - b l o c k e r sa tb a r ec f e a f t e rs a p a r a t i o nb yc eh a ss h o w nt ob eas e n s i t i v e ，f a s c i n a t i n ga n dr a p i dt e c h n i q u e t h em i x t u r eo f t h e s et h r e eb l o c k e r sw a s s e p a r a t e dc o m p l e t e l y w i t h i n6m i n u t e su n d e r t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s t h el o do fp m p r a n o l o l ，t i m o l o l a n da c e b u t o l o lw e r e 0 1 、0 oi 、o 0 5 p m o l l ( n s = 3 ) ，r e s p e c t i v e l y t h el i n e a rr e s p o n s er a n g e sw e r eo v e r i j a b s t r a c t t h r e em a g n i t u d e s s u c ha s1 - 1 0 0 、0 2 1 5 0 、0 2 1 2 0 1 a m o l lw i t l lt h el i n e a rc o e f f i c i e n t s o v e r0 9 9 5 t h ea n a l y s i so fh u m a nu r i n es h o w st h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no ft h i s d e t e c t i o nm o d ei nc l i n i c k e y w o r d s ：c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，e n d c o l u m ne l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ， 3 - b l o c k e r s 河北大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 引言 高效毛细管电泳( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，缩写为h p c e ) 是 离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进 行高效、快速分离的一种电泳新技术。传统电泳最大的局限是难以克服由两端 的高电压引起的的介质离子流的自热，或称焦耳热，这种焦耳热会引起载板从 中心到两侧或管子内部径向的温度、粘度和速度梯度，导致区带展宽，影响迁 移，降低效率，这种影响还会随电场强度的增大迅速加剧，因此极大地限制了 高压的使用，使电泳操作只能在低电场强度下进行，分离时间长、效率低、分 离度受到严重制约。h p c e 与传统电泳的根本区别在于它使电泳过程在散热效 率极高的毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度，全面改善分离质量。其 最基本的仪器结构如图1 1 所示，通常包括一个高压电源、一根毛细管、一个 检测 c a p i l l a r y e e l e c t r o c i e 图1 1 毛细管电泳装置简图 器以及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液储槽，输出信号和记 录装置相连。 对高效毛细管电泳最有启发性的工作应首推h j e r t e n 1 - t 1 9 6 7 年最早提出 窄孑l 径毛细管( 3 删n ) 在高电场下进行自由溶液的区带 b 永( c a p i l l a r y z o n e 文献综进 e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 。1 9 7 4 年，v i r t a m e n 2 提出用2 0 0 - - 5 0 0 u m 内径的毛细 管作电泳分离，而在目前所谈及的那种细管径毛细管内实现电泳的最初工作是 由j o r g e n s o n 和l a k a c s 3 5 】在1 9 8 1 年首先提出的，他们使用了7 5 9 i n 内径的玻 璃毛细管柱，用荧光检测器作在线检测，同时他们还就分离的机理、高电场和 小内径对高效的决定性影响等问题进行了讨论。正是由于j o r g e n s o n 等人十分 成功的实验和异常出色的理论工作，轰动了分离科学界，激起了人们的巨大反 响，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。 自问世以来，h p c e 显示了其在无机离子、有机分子、药物分析、临床分 析以及生命科学中对d n a 、蛋白质、多肽、核苷酸和氨基酸等生物分子分离 分析方面的巨大潜力，成为近年来分析化学和生物分析化学中最受青睐、发 展最快的一种分离分析技术 6 - 8 】。特别是自8 0 年代至今，随着人们对h p c e 技术潜能认识的加深，对c e 研究的投入直线增长，使c e 技术进入了飞速发 展的黄金时期。 毛细管电泳中常用的毛细管内径通常在2 岫至l o o p m 之间，所能检测到 的分析物的量非常小。因此对检测方法有很高的要求。h p c e 的检测器必须具 有灵敏、显微( 高空间分辨率) 以及快速响应的性能。与其联用的检测方法有光 学检测( 紫外u v 、荧光、拉曼光谱) 、质谱、电化学和放射性同位素等。在c z e 中，电化学检测法的灵敏度高，检测体积小。因此，可用于窄孔径( 电5 胂i d ) 毛细管检测，为微体积环境( 如单细胞) 研究提供了高灵敏度方法，特别是对无 机离子和有机小分子( 如羧酸) 的检测，因为它们的吸光系数小，u v 一可见吸收 检测器无能为力，而电化学方法却很有效。电化学方法( e c ) 包括安培法、电势 法和电导法。安培法测量化合物在电极表面发生氧化或还原反应时，失去或得 到电子，产生与分析物浓度成正比的电极电流，是与h p c e 联用最灵敏的电化 学检测方法。 1 2 高效毛细管电泳的基本理论 1 2 1 基本原理 1 2 1 1 双电层和z e t a 电势 由界面化学可知，固体与液体接触时，固体表面分子离解或，和表面吸附 河北大学硕士学位论文 溶液中离子，在固一液界面上形成双电层。在毛细管电泳中，不论是带 电粒子的表面还是毛细管管壁的表面都有双电层。 在水溶液中，多数固体表面带负电荷。按照近代双电层模型，在双电层 溶液一侧由两层组成。第一层为吸附层，称为s t e m 层或紧密层 9 ，l o 】。在s t e m 层中与固体表面接触的特性吸附离子是部分脱水的，它可以是异号离子，亦 可以是同号离子，其外面主要是由静电力吸附的水化对离子。第二层为扩散 层，由s t e m 面外的剩余对离子构成，其电荷密度随着远离表面而逐渐与体相 溶液的接近。对于熔融二氧化硅毛细管，在一般情况t ( p h 3 ) ，熔硅表面 的硅醇基( s i o h ) 电离成s i o 。，使表面带负电荷。负电荷表面在溶液 中积聚相反电荷的对离子，形成双电层。 在s t e r n 层和双电层的扩散部分的起点之间的边界层上的势称之 为管壁的z e t a 势，典型值约在0 到1 0 0 m v 之间，z e t a 势的值随距 离增大按指数衰减。熔硅表面上的z e t a 电势正比于它表面上的电荷 数与对离子层厚度的乘积，但这些又受到对离子的性质、缓冲液p h 、 缓冲液中阳离子和熔硅表面间的平衡等因素的影响【1 l 】。毛细管壁 上的z e t a 电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流，优 化c e 分离条件有实际指导意义。 1 2 ，1 2 毛细管中粒子的迁移运动 毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的 电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速 度还明显受到溶液电渗流速度的影响。粒子的实际流速v 是泳流速 度y 。和渗流速度t 。的矢量和。即： 忙e 。+ k ( 1 ) a 电泳 电泳是在电场作用下带电粒子的定向移动，其速度以，由下式决 定： 以。= 雎，e ( 2 ) 其中e 为电场强度，肛。表示溶质的淌度，即溶质在给定缓冲液中单 位时间间隔和单位强度下移动的距离。 文献综述 电泳淌度定义为单位场强下离子的平均电泳速度即 肛，2v i e2 l ( t e )( 3 ) 其中v 为粒子从进样处到检测器的迁移速度，l 为进样处到检测器 的距离，t 为粒子迁移通过这段距离的时间。开口管里，一个粒子 的电泳淌度可近似表示为 1 2 】 芝 a t = 3 (4)4 r c o 、 式中占：流体的介电常数 专：是粒子的z e t a 电势( 这里特指粒子外“固定”离子切平面 和离得最近的游离离子边界层之间的电势1 玎：介质的粘度 由此可见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除了与电场强度和 介质特性有关外，还与粒子的有效电荷及其大小和形状有关。因此， 粒子的大小与形状，以及其有效电荷的差异，就构成电泳分离的基 础。 b 电渗流 在毛细管中，电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，简称e o f ) 指的是体相 溶液在外加电场作用下整体朝一个方向运动的现象。处于扩散层中 的阳离子，在负电荷表面形成一个圆筒形的阳离子鞘，在外加电场 作用下，以剪切面为分界面，朝向阴极与s t e r n 层作相对运动。由 于这些阳离子是溶剂化的，当它们沿剪切面作相对运动时，携带着 溶剂一齐向阴极迁移，便形成e o f 。一般来讲z e t a 电势越大，双 电层越薄，粘度越小，电渗流值越大。 与电泳淌度类似，电渗的淌度从。可表示为： “：( 5 ) 4 石玎 知为管壁的z e t a 电势电渗流的速度通常是泳流速度的5 - 7 倍。 既然同时存在着泳流和渗流那麽，在不考虑相互作用的前提 下，粒子在毛细管电介质中的运动速度应当是两种速度的矢量和， 鲨! ! 奎兰堡主堂垡堡塞 即： + 吃2 ( ，+ _ 。) e ( 6 ) 正离子的运动方向和电渗一致，因此它应当最先流出，中性粒子的 泳流速度为“零”，将随电渗而行，至于负离子因为其运动方向和电 渗相反，因此在电渗速度大于电泳速度时，它将是随中性粒子之后 流出，而如果它的泳流速度大于渗流速度，则将无法流出，也就是 说如果渗流速度的绝对值大于所有负离子泳流速度绝对值，则此混 合物中的所有组分将朝向一个方向迁移。 以电场力驱动产生的e o f ，与高效液相色谱( h p l c ) q b 靠外部泵 压产生的液流不同。如图1 2 a 所示，e o f 的流型属扁平流型( f l a t f l o w ) ，而h p l c 的流型( 图1 - 2 b ) 则是抛物线状的层流( 1 a m i n a rf l o w ) 。 扁平流型不会引起样品区带的增宽，这是c e 获得高分离度的重要 原因之一。 b 二 二芝 图1 2 电渗流( a ) 和高效液相色谱( b ) 的流型( 上图) 及相应的溶质区带( 下圈) 电渗是伴随电泳产生的一种电动现象，在c e 分离中扮演着重要 角色。影响e o f 的因素有电场强度、毛细管材料、缓冲液p h 值、 缓冲液成分与浓度、添加剂和温度影响【13 2 3 。通过e o f 大小和 方向的控制，还可以影响c e 分离的效率、选择性和分离度，成为 优化分离条件的重要参数。有效地控制e o f ，对提高分离效率，改 善分离度，特别是提高c e 分离重现性具有非常重要意义。目前， 文献综述 用来控制e o f 的方法主要有以下几种： ( 1 ) 改变缓冲溶液成分和浓度； ( 2 ) 改变缓冲溶液p h ； ( 3 ) 力口入添力口齐q ： ( 4 ) 毛细管内壁改性一物理或化学方法涂层及动态去活： ( 5 ) 改变温度； ( 6 ) 外加径向电场。 1 2 1 3 分离效率与分离度 c e 中的分离效率用理论塔板数( t h en u m b e ro ft h e o r e t i c a lp l a t e s ， n 1 表示，其理论表达来源于色谱理论，用g i d d i n g s 方程定义为， = l o - 2 ( 7 ) ，为迁移距离，即有效长度，一是区带中浓度分布的方差( v a t i a n c e ) 。 用理论塔板高( h e i g h te q u i v a l e n tt o t h e o r e t i c a lp l a t e ，h e t p ) h 表示， 则 日= 告 ( 8 ) v 、+ 工为毛细管长度，可用实验方法测定。对具有高斯型的电泳峰， 按下式求出： 埘( 爿 t ，为迁移时间，矿，为半峰宽。 分离度( r e s o l u t i o n ，矗。) ，亦称分辨率，是指将淌度相近的组分分 开的能力。通常，在电泳图上读出两相邻峰的迁移时间和它们的峰 宽，按下式计算r ， 2 4 】。 月：￥瑚：辅 。 一十4 0 ( 1 0 ) 下标1 和2 分别代表相邻两个物质，w 为以时间表示的基线峰宽， 盯：表示方差。因此上式分子代表两种物质迁移时间之差，分母则表 河北大学硕士学位论文 示这一时间间隔组分展宽对分离的影响。 1 2 2 高效毛细管电泳的类型和特点： 1 毛细管区带电泳( c z e ) 毛细管区带电泳( c z e ) 亦称毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管 电泳中最基本也是应用最广的一种操作模式，通常把它看成其它各 种操作模式的母体。它是基于分析物表面电荷密度的差别进行分离 的。实验中，在毛细管和电解池中充以相同的缓冲液，样品用电迁 移或流体动力学从毛细管一端导入，施加电压，样品离子在电场力 驱动下以不同的泳动速度迁移至检测器端，形成不连续的移动区带 分离出来。 在c z e 中，需要控制的主要操作变量是电压、缓冲液的p h 和 浓度、添加剂、进样电压和时间。同时，合理优化选择柱温、分离 时间、柱尺寸、进样和检测体积、溶质吸附和样品浓度等也将大大 提高柱效。c z e 还可通过改变电渗流的方向来选择分析特测的离 子。 2 胶束电动力学毛细管色谱( m e c c ) 胶束电动色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) 是 以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的巧妙 结合。多数m e k c 在毛细管中完成，故又称为胶束电动毛细管色谱 f m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) m e c c 是 在电泳缓冲液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临 界胶束浓度( c m c ) i 对，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起 形成胶柬( 假固定相) ，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不 同而得到分离，如图1 3 。它是1 9 8 4 年由t e r a b e 首先报道的一种相 当新的毛细管电泳技术 2 5 】，也是目前研究较多、应用较广泛的一 种毛细管电泳模式。 c z e 基于溶质的淌度差异进行分离，而m e c c 则是基于溶质在 胶束中的不同分配进行分离。因此，m e c c 的突出优点是除能分离 型 离子化合物外，还能分离不带电荷的中性化合物，而c z e 仅能分离 离子化台物。将电泳技术与色谱技术结合，把电泳分离的对象从离 。 蕊煎 l 钦 ，_ 酗帮酽 叠* 一谐” 一= 曝离子表面话性刺匕令= e o f i = 瞎膻 - = 电棘 图1 - 3 电动力学色谱原理示意图 子化合物扩展到中性化合物，是m e c c 的一大创举。对含有离子和 中性化合物的混合样品，以及电泳淌度相同的溶质的分离，m e c c 要明显优于c z e 。此外，m e c c 还能很快且很容易地通过改变流动 相和胶束相组成来增加分离选择性，非常适合于手性化台物的分 离。但是，m e c c 对样品分子大小局限在分子量小于5 0 0 0 ，而c z e 则无此限制。 通常用作表面活性剂的化合物有四类，即阴离子、阳离子、两 性离子和非离子表面活性剂，研究者亦尝试将环糊精、胆汁盐等其 它旋光异构体选择剂及有机溶剂作为添加剂引入m e c c 进行新技术 改良。 3 毛细管凝胶电泳( c g e 、 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 综合了c e 和 平板凝胶电泳的优点，是以凝胶物质作支持物进行的区带电泳，利 用凝胶物质的多孔性和分子筛的作用使通过凝胶的物质按照分子的 尺寸大小逐一分离，是分离度极高的一种电泳分离技术 2 6 ，2 7 】。 理论上说，凝胶是毛细管电泳的理想介质，具有抗对流、减小 溶质扩散、阻挡毛细管壁对溶质的吸附等作用，并可减少甚至忽略 电渗流的影响。c g e 对于大分子物质如蛋白质、多肽、寡聚核苷酸 的分离分析，特别是d n a 序列分析显示了速度和效率方面的优越 河北大学硕士学位论文 性。它的主要缺点是制各较困难，寿命较短。 4 毛细管等速电泳( c i t p ) c i t p 是基于离子淌度的差异进行带电离子的分离 2 8 】，属于不 连续介质电泳，需要前导电解液和尾随电解液两种缓冲液。前者含 有与溶质离子电荷相同且淌度为体系中最高的离子，后者为体系中 淌度最低的离子，样品离子的淌度介于两者之间。当毛细管两端加 上电压后电位梯度的扩展使所有离子最终以同一速度泳动，样品带 在给定的p h 下按其淌度和电离度大小依次连续迁移，得到互相连 接而又不重叠的区带。 带长可用于定量测定，c i t p 可在无支持电解质的条件下进行分 离，并可通过控制p h 值，改变任两种离子间的分辨率，可观察到 指纹区物质的微小变化。c i t p 不能对阴离子和阳离子进行同时分 离，且由于采用不连续缓冲体系，空间分辨率较差。 5 毛细管等电聚焦电泳( c i e f ) 两性电介质在分离介质中的迁移造成p h 梯度，由此可以使蛋白 质根据它们不同的等电点进行分离，具有一定等电点的蛋白质顺着 这一梯度迁移到相当于它们的等电点的那个位置，并在该点停下， 由此产生一种非常窄的聚集区带，并使不同等电点的蛋白聚集在不 同的位置上，这就是等电聚焦分离的基本原理。其运行过程如图l - 4 所示。 在毛细管内实现等电聚焦过程，必须解决两个问题，一是减小 电渗流，如将亲水聚合物键合到管壁表面等，二是找到一种使区带 迁移的途径，可利用压差或改变缓冲液的p h 值等手段。同时克服 蛋白质等的吸附沉淀也是一个重要问题。等电聚焦分离有极高的分 辨率，通常可以分离等电点差异小于0 0 1 p h 单位的两种蛋白a 6 毛细管电色谱( c e c ) p r e t o r i o u s 等【2 9 在1 9 7 4 年第一次实现c e c 。c e c 是将毛细管 内添入固定相，分析物的运动受电渗、电迁移及在移动相和固定相 文献综述 b o c 芏= = 王= s = = s = = 王= j = = s = 墨玛 。臣兰兰兰垫苎圈管_ - - 商亡s = = j = = = 王= = 盂= = s = = s = = 5 = = s 3 叩 一。吖。己。+ h 。下 0 图i - 4c i e f 的运行过程a ：进样b ：聚焦c ：迁移 的分配影响，它既获得了接近于h p c e 水平的高柱效；同时还具备 h p l c 的选择性，既克服了c z e 选择性差和分离中性化合物困难的 弱点，又克服了m e c c 的胶束选择有限的缺点。 c e c 类型有填充柱电色谱法、开管柱毛细管电色谱法及压力驱 动电色谱法。 c e c 作为一种新的高效分离技术，近几年不仅在实验技术方面 有了进一步发展，而且在免疫学研究，药物分析，富勒烯化学等众 多领域都得到了广泛应用。另外，在相应的设备上也有了定的发 展【3 0 】。 7 亲和毛细管电泳( a c e ) 亲和毛细管电泳是近年发展起来的毛细管电泳的一个新分支， 在研究生物分子之间的特异性相互作用以及提高毛细管电泳分离的 选择性等方面有着广泛的应用。蛋白、核酸等生物大分子能够与配 体通过静电疏水、氢键等非键作用结合在一起，具有特异性高，可 逆等特点 3 1 】。基于这种作用的亲和色谱、亲和凝胶电泳等技术， 河北大学硕士学位论文 己被广泛用于生物样品的分离、纯化与鉴定【3 2 】。在蛋白、多肽、 核酸片段等生物样品的分离分析中具有独特的优越眭和应用潜力 3 3 】。目前，a c e 的研究主要集中在两个方面：一是研究受体与配 体之间的特异性相互作用，获得热力学与动力学等参数；二是利用 这种特异性相互作用提高毛细管电泳分离的选择性。 8 毛细管阵列电泳 传统的聚丙烯酰胺凝胶板电泳的一大优点是可以同时进行多道 分析，而一般的c e 方式却很难做到这一点。h u a n g 利用一个共焦 激光荧光扫描检测系统解决了由多根毛细管组成的毛细管阵列的同 时检测问题 3 4 1 。他们将这一技术称为毛细管阵列电泳。利用这一 技术，在2 5 根毛细管组成的阵列中进行了d n a 序列分析的尝试， 结果令人鼓舞。 9 毛细管离子分析( c i a ) 或毛细管离子电泳 低分子量有机阴、阳离子一直是c e 关注的课题。w a t e r s 公司为 此开发了专用的c e 仪器和化学品，并申请了专利。c i a 技术在分 析美国e p a 规定的地下水样中无机、有机阴离子方面，获得了高效、 快速的结果，样品的预处理、样品与试剂的消耗方面优于离子色谱， 有关方法已提交a s t m 审查【3 5 。 1 2 3 毛细管电泳的柱技术 毛细管电泳的分离过程在毛细管内完成。因此，毛细管是毛细 管电泳的核心部件。一段时间以来，围绕毛细管柱展开的研究，始 终是个活跃的领域。其中包括柱的几何尺寸、形状、材料、表面修 饰、多维分离、样品收集和预浓缩、梯度方法、凝胶、柱前柱后衍 生等。 1 柱的几何尺寸、形状和材料 通常所用的毛细管柱的直径为2 1 0 0 岫，细柱子最大优点有两 条：一是降低毛细管柱内电流，减少自热，二是增大散热面积( 侧面 积与截面积之比) ，加快散热，大大降低管中心和管壁之间的温差， i l 文献综述 从而减少粘度和速度在径向上的差异，保持电渗流流型的扁平性， 最终保持分离的高效。但是，孔径小，样品负载小，增加检测困难， 也增加进样、清洗等操作上的困难，而且还由于表面积体积比大， 增加了吸附作用。因此，一般使用的柱内径在2 5 一1 0 0 l u n 之间。 相对于直径而言，对长度的要求就没有那麽严格，一般说来， 在其它参数不变的隋况下，长度增加，电流减小，产生的热量也越 少，可以应用更高的电压，得到更高的柱效和分离度r 。 管壁的厚度由石英本身和涂在外面的聚酰亚胺组成。厚壁管有 助于改善整个散热环境，也能减少聚酰亚胺对散热的不利影响。 通常柱子都是圆管型的，z a r e 等f 3 6 提出过一种内孔为矩形的毛 细管，陈义等【3 7 】曾对扁方形毛细管进行过研究。在相近的散热条 件下扁方管的进样量可以大于圆管而不降低效率并可得到远大于 圆管的光路，但由于材料和制各技术上的困难，扁管实际上不易推 广。 毛细管柱的材料可以是聚四氟乙烯、玻璃和弹性石英等，目前 所用的基本上是圆管形弹性熔融石英毛细管，俗称熔硅毛细管。柱 外涂敷一层高聚物( 聚酰亚胺) 薄膜，使其柔软有弹性，不易折断。 2 管壁改性 用毛细管作电泳分离时，会遇到两种现象。一是电渗，二是吸 附。一般电渗必须予以适当的控制，而对吸附则要尽可能消除。有 效地控制e o f 和消除内壁对样品溶质的吸附一直是分离条件优化的 重要方面曾做了大量的研究工作。围绕这个问题，开展了内容丰 富的柱化学研究。它涉及柱内壁表面化学以柱壁涂溃或改性为主， 通过表面s i o h 基团衍生( 内壁涂层) 或加改性剂到缓冲溶液中( 动态 去活，d y n a m i cd e a c t i v a t i o n ) 髅j 方法对柱内壁进行改性。动态去活的 方法很多，如采用极端p h 、高离子强度缓冲溶液、添加表面活性 剂等。 3 毛细管电泳的进样技术 河北大学硕士学位论文 为了达到高效和快速的特点，毛细管电泳对进样的要求较严格。 进样时应满足两方面的要求：一是进样时不能引入显著的区带扩 张；二是样品量必须小于1 0 0n i ，否则易造成过载。常规进样方式 有两种：流体力学方式和电动( 亦称电迁移) 方式。 流体力学方式是应用最广泛的一种方式，可以通过虹吸，在进 样端加压或在检测端抽空等方法来实现，进样量表示为： p ：竺：! 二二! ：!n 1 1 8 叩工， 其中：肿是通过毛细管截面的压差；r 是毛细管内径玎是溶液的 粘度；c 为样品浓度；f ，为进样时间：工。是柱长。由上式可知，流体 动力学进样的进样量与通过毛细管截面的压差、样品的浓度、进样 时间及管径的4 次方成正t b ，与粘度及管长成反比。且进样量与组 分的淌度无关，因而不存在歧视效应。 电动进样是将进样端的缓冲溶液池换上样品管并施加一定电压 来实现的。通常所加场强为分离场强的1 5 到1 3 ，进样量q 由下 式计算： 。：睦! ! 竺：生( 1 0 ) 一 以。和以。分别是溶质和缓冲液的淌度；是进样电压， r 是毛细管 内径，c 是样品的浓度，工，是柱长。可见，除了毛细管内径和样品 浓度外，决定进样量的还有场强、进样时间和离子的表观淌度。对 于离子组分，由于表观淌度不同，会产生进样歧视，这是电动迸样 的最大缺点。但此法进样简单，当缓冲液粘度大，特别是在c g e 情况下，这种进样方式就非常有用。 为了适应低样品浓度分离的要求进几年发展了许多进样期间 或进样之后在毛细管中实现样品浓缩的方法，称为预浓缩进样和在 柱浓缩。利用这些方法可以提高检测灵敏度，降低样品浓度检测限e 1 2 4 毛细管区带电泳的几个参数 c z e 是c e 中最基本的一种操作模式，也是本实验采用的主要模 文献综述 式。c z e 中需要控制的变量主要是操作电压、缓冲液及其p h 值和 浓度、添加剂等下面作一简要介绍。 1 操作电压 分离体系的最佳外加电压值，与缓冲溶液浓度( 离子强度) 及毛细 管内径和长度有关。在柱长确定时，随着操作电压的增加，电渗流 和电泳流速度的绝对值都增加，迁移时间缩短，尽管电泳流速度的 增加视粒子所带的电荷而异，但由于电渗流速度一般远大于泳流速 度，因此表现为粒子的总迁移速度加快。在升高电压的同时，将使 柱内的焦耳热增加，缓冲液的粘度减小，而粘度和温度之间的关系 是指数型的，因此使操作电压和迁移时间的关系不呈线性，表现为 电压高时速度增加更快一些。在一定范围内柱效随电压的增大而增 大，过了极点后，随着电压的升高，焦耳热的影响加剧，柱效反而 下降，而极点的具体位置视系统和组分而异【3 8 】。 2 缓冲液 与柱壁表面化学一样，缓冲溶液从另一个侧面在c z e 柱化学中 扮演着重要角色。缓冲溶液类型、浓度( 离子强度) 和p h 不仅影响 e o f ，亦影响样品溶质的电泳行为，决定着c z e 分离效率、选择性 和分离度的好坏，以及分析时间的长短，在c z e 分离条件优化中具 有重要意义。背景电解质的选择目前还尚无严格规则可循，但有如 下几个基本要求必须满足。 ( 1 ) 要求有一定的p h 调节范围，并在该p h 范围有足够的缓冲容 量。因为z e t a 电势对p h 很敏感，在分离过程中要求保持恒 定的p h 值。 ( 2 1 尽可能选择浓度高而产生电流小的缓冲溶液。因为浓度高可 以提高r 。，电流小可允许使用较高的外加电压。 ( 3 ) 缓冲溶液的表观淌度接近样品溶质的淌度，否则引起区带发 散。 f 4 ) 在某些情况下，对缓冲溶液有特殊要求。 河北大学硕士学位论文 另外，特别强调的是在配制毛细管电泳用的缓冲液时，必须使用 高纯蒸馏水和试剂，除去颗粒以免堵塞毛细管柱及降低噪音。 缓冲溶液p h 强烈地影响熔硅毛细管壁的表面特性。在高p h 下， s i o h 基电离趋于饱和，e o f 达到最大且变化平缓，而在低p h ，电 离受到抑制，e o f 接近零。因此，缓冲溶液p h 成为影响泳出时间重 现性的关键参数。离子的电泳淌度直接正比于它的有效电荷，离子 的有效电荷受操作缓冲溶液p h 的影响，因此，缓冲溶液p h 的调节 与控制也是优化分离的重要对策，在蛋白质和多肽分离上更是如此。 缓冲溶液浓度的影响比较复杂。现在已确认，在恒定p h 下，淌 度随浓度增加而减小，但有关数学模型仍存在混乱现象。e o f 速度 随浓度增大而减小，不管儿，如何变化，雎。总比雎，大，所以在恒电压 下，任何溶质的泳出时间都随缓冲溶液浓度增加而加长，分离因子 得到改善。 3 添加剂 在c z e 分离中除了背景电解质外，常常还在缓冲溶液中添加某 种成分，通过它与管壁或与样品溶质之间的相互作用，改变管壁或 溶液物理化学特性，进一步优化分离条件，提高分离选择性和分离 度。常用添加剂有如下几类： ( 1 ) 表面活性剂，如季铵盐等； ( 2 ) 有机溶剂，如甲醇、乙腈等； ( 3 ) 两性离子，如三甲铵基内盐； ( 4 ) 金属盐，如k 2 s o ，l i c ! 等； ( 5 ) 手性试剂，如环糊精、冠醚等； ( 6 ) 其它，如尿素、线性聚丙烯酰胺等。 其中，表面活性剂是毛细管电泳使用最多的一种缓冲液添加剂。 1 2 5c e 的检测方法和检测器 c e 发展初期，j o r g e n s o n 曾指出，c e 技术的广泛应用与深入发展 所面临的主要挑战是高灵敏度和多模式检测器的发展【3 9 】。十几年 文献综述 来，为了适用c e 微体积在柱检测的要求，人们在检测方法和检测器 方面进行了大量的和卓有成效的研究，发展了许多类型的检测器， 有光学、电化学和质谱学检测器等。表1 1 4 0 y t j 出了各种类型c e 检测器的一般性能及简要特点。 表1 1c e 检测器的检测限及其特点 检测器检测限( t o o l l )特点 u v 一可见吸收 1 0 1 0 6 近似通用，常规应用 激光光热 1 0 1 0 8 灵敏度高，受激光器波长限制 荧光 非相干光诱导 1 0 1 0 。8 灵敏度高 激光诱导 1 0 ”1 0 。1 2 高灵敏度，价格昂贵 折射指数 1 0 1 0 。7 通用性强，结构简单，灵敏度较低 电化学 电导 1 0 一1 0 7 通用性 安培 1 0 一1 0 9 选择性，灵敏度高，微量 质谱 1 0 1 0 9 仪器复杂，可获得结构信息质量灵敏 度高 发射 1 0 一1 0 。“ 灵敏度高，操作放射性物质有特殊要求 间接法通用性强，灵敏度比直接法低1 2 个数 量级 间接u v 1 0 1 0 1 5 间接l i f 1 0 一1 0 。9 1 紫外吸收法 u v 可见吸收检测法是c e 分离的一种常规检测法。其检测原理 基于朗伯比尔定律，通用性好，结构简单，加上商品吸收检测器己 达到较高性能，因此，u v 可见吸收检测器是目前应用最广泛的一种 c e 检测器。但是，毛细管的短光程严重限制了它的灵敏度。为了提 高它的灵敏度，近年来人们做了大量的工作 4 1 。如使用高能量的氙 灯或激光做光源、引进光纤、光电二极管阵列、聚焦、快速扫描等 技术以及使用z 性检测池或多次反射的方法来增加光程- 进一步降 低检测限等。另外可以对分析物进行衍化处理使其光吸收性能增强a 2 光激发荧光检测法 毛细管电泳的荧光检测，特别是激光诱导荧光( l a s e r i n d u c e d f l u o r es c e n c e l i f ) 检测是所有检测方法中灵敏度最高的一种方法。多 1 6 - 型! 茎堂堡主堂垡堡苎 数情况下l i f 的检测限为l o 1 0 - 1 2 m o l l ，比常规u v 吸收法低5 6 个数量级。激光具有高强度、相干性好的特点，它既可诱导强的荧 光，又易于聚焦成微束入射到毛细管，这种聚焦甚至已接近光的衍 射极限，太大提高了灵敏度。 大多数化合物本身不发荧光，衍生技术( 荧光标记) 在荧光检测中 显得非常必要，恰当地选择激发波长和荧光标记试剂，对提高检测 灵敏度有着重要意义。 3 指数折射检测法 一般情况下，溶液的折射指数( r e f r a c t i v ei n d e x r i ) - 与溶液组成、 浓度及温度有关。与其它类型检测器相比，r i 检测器具有非破坏性 和通用性强、结构简单、造价低廉、适于微体积和微柱检测的优点。 不需衍生可直接检测所有c e 分离组分。 4 质谱检测法 质谱本身就是一种重要的分析手段，把它作为一个检测手段是任 何分离分析方法梦寐以求的目标。质谱法灵敏度高、专属性强、可 提供样品结构信息。c e 的高效分离与m s 的高鉴定能力相结合，可 用n l 级样品进行结构分析和分子量的准确测定，成为微量生物样品 分离分析的强有力工具。特别是在多肽和蛋白质的分离分析中受 到人们格外的青睐。m s 用作c e 的检测器，有在线检测和离线检测 两种方式。在线检测是分离毛细管直接耦合到m s 中进行检测。对于 c e m s 耦台，关键技术问题是联用接口。电喷雾接口是目前常用的 一种手段【4 2 。完全可以相信，随着接口技术的日臻成熟，m s 作为 c e 的理想检测器，