（等离子体物理专业论文）离子注入选育米根霉及固定化生产l乳酸发酵技术研究.pdf

摘要 摘要 近年来，随着经济的发展和社会的进步，整个世界对环境保护越来越重视，由 于聚乳酸( p l a ) 是可降解塑料材料，所以p l a 可望在将来代替聚氯乙烯( p v c ) 等 各种不可降解的塑料。而l 一乳酸作为p l a 的材料，需求量也将越来越大。为了提 高l 一乳酸的产量，本文根据育种理论和发酵工艺理论，对l 一乳酸生产菌种的选育、 固定化细胞发酵生产l 一乳酸在线分离进行了系统的研究。首先，采用离子束诱变 育种技术对菌株进行诱变筛选，研究了菌株的特性。其次，在发酵工艺的基础上， 对固定化细胞的工艺进行了研究，对固定化细胞在发酵罐中不同条件下的发酵结果 进行了分析；同时还对乳酸在线分离进行了初步的探索。由于米根霉的特殊性质， 不适于在传统的搅拌罐中进行发酵生产，所以对发酵罐结构进行了改造，将搅拌罐 改为鼓泡罐作为固定化米根霉的发酵装置。 1 采用离子注入诱变筛选技术，通过试验，确定米根霉离子注入懈注赠皂 量为1 0 - - - 1 5 k e y ，注入齐匿为8 0 木2 6 1 0 ”i o n s c m 2 ，总结了诱变筛选工艺流程，筛选到 具有较好的遗传稳定性突变菌株r l 6 0 4 1 。摇瓶发酵实验结果表明，突变菌株r l 6 0 4 1 的糖酸转化率高达9 0 ，比出发菌株( 7 0 ) 提高了2 0 个百分点，相对提高了2 8 5 7 。 2 对固定化细胞的载体进行了优选实验，确定了聚氨酯泡沫为合适的载体。通 过实验，确定了最佳转速为1 5 0 r m i n ，载体大小为4 m m x 4 m i n x 4 r a m ；确定t a n 入载体 的最佳量为0 2 9 1 0 0 m l ，最适温度为3 8 c ；同时还确定了加入载体的最佳时间是在 菌体培养1 0 h r 后，有利于固定化细胞的生长。通过对乳酸脱氢酶( l d h ) 活性与固 定化细胞发酵产酸的研究，获得- j l d h 与乳酸产量存在着正相关性的实验结果。 3 根据代谢通量模型的建立及代谢通量分析的理论，构建了代谢通量网络，建 立了米根霉胞内代谢反应方程、质量平衡方程，对固定化细胞和游离菌的代谢通量 进行了分析，可以确定米根霉葡萄糖代谢中丙酮酸( p y r ) 是刚性节点。 4 研究了不同比例的碳源、氮源以及微量元素对发酵的影响，得出了氮源对产 酸的影响较明显的结论；在连续分批发酵了1 5 批次后，乳酸产量始终保持7 8 8 9 9 l ， 并且固定化细胞没有破损。为了后期的连续发酵，通过实验确定了最佳投糖浓度为 8 。 摘要 5 通过米根霉在不同条件下发酵结果分析，可以得出不适于采用搅拌罐发酵的 结论；根据实验结果对搅拌罐进行一系列的改造，为固定化连续发酵耦合分离实验 做准备。在发酵过程中，从通气量对发酵结果影响的分析中可以得出，通气量对发 酵过程影响较明显，在开始发酵的前l o h r ，茵体对氧气的需求量较大；随着通气量 的增大，整个发酵时间缩短4 h r ，转化率提高了1 0 。 6 通过建立初步分离的流程，对乳酸发酵的分离过程进行了初步研究。通过此 流程后，有利于对后续电渗析分离装置起到保护作用，延长其使用寿命。 在论文的最后一章，对研究中出现的新问题进行了探讨。 关键词：米根霉固定化细胞l 一乳酸 离子注入 诱变选育发酵罐 乳酸脱氢酶代谢流 a b s t r a c t s t u d i e so f r h i z o p u so r y z a ei m p l a n t e db yi o nb e a ma n d i m m o b i l i z e dt e c h n o l o g yp r o d u c e dl ( + ) l a c t i ca c i d y o n g h o n gf a n ( m a j o r ：p l a s m ap h y s i c s ) d i r e c t e db yp r o f z e n g l i a n gy u a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h ee c o n o m ya n dt h ep r o g r e s so ft h e s o c i e t y , p e o p l ep a y m o r ea t t e n t i o nt ot h ep r o t e c t i o no ft h ee n v i r o n m e n ta g a i n s t p o l l u t i o n a sw ek n o w , p o l y l a c t i ca c i d ( p l a ) c a l lb eb i o d e g r a d e d ，s ot h ep l a s t i cw h i c hc a n tb e d e g r a d e ds h o u l db er e p l a c e db yp l a h e n c e f o r t h ，al o to fl 1 a c t i ca c i dw o u l db en e e d e d s i n c ei tc a nb eu s e dt os y n t h e s i z ep l a t h i sd i s s e r t a t i o n p r e s e n t sas y s t e m a t i c a ls t u d yo f t h es e l e c t i o na n db r e e d i n go fl - l a c t i ca c i dp r o d u c i n gm u t a n ta n dt h ef e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g yb a s e do nt h es t r a i nb r e e d i n gt h e o r ya n df e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n gt h e o r ys o a st oe n h a n c et h ep r o d u c t i o no ft h el a c t i ca c i d f i r s t l y , m u t a g e n i eb r e e d i n gw a st a k e n w i t ht h em e t h o do f 矿i o n si m p l a n t i n gt oi n v e s t i g a t et h ec h a r a c t e ra r i df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o no ft h em u t a n t s e c o n d l y ，a ne x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u to nt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o nb o t hh li m m o b i l i z e dc e l l sa n di nb i o r e a c t o r ；a tt h es a m et i m e t h e p r o c e s so f o n l i n es e p a r a t i n gw a ss t u d i e d d u et ot h es p e c i a lc h a r a c t e ro fr h i z o p u so r y z a ew h i c h w a su n s u i t a b l ei i lm i x i n gb i o r e a c t o r , t h u st h eb i o r e a c t o rw a sm o d i f i e dt o tm e e tt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fr h i z o p u so r y z a e t h em a i nc o n t e n t si nt h i sd i s s e r t a t i o na r e s u m m e du pa sf o l l o w s ： 1 t h eo p t i m a lc o n d i t i o nv i ai o nb e a mi n d u c i n gw a so b t a i n e d ：t h ee n e r g yo f i m p l a n t a t i o nw a s10 - - 一15 k e v , a n dt h ed o s eo fi m p l a n t a t i o nw a s8 0 * 2 6 10 1 3 i o n s c m 2 b yal a r g en u m b e ro fs c r e e n i n g s ，t h em u t a n ts t r a i nr l 6 0 4 1w a so b t a i n e d t h er e s u k s s h o w e dt h a tr l 6 0 41s t r a i nh a sw e l lg e n e r t i c a ls t a b i l i t y t h ef e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n to f r o t a r yf l a s ki n d i c a t e dt h a tc o m p a r e dw i t ht h ec o n v e r t i o nr a t e ( 7 0 ) o ft h ep a r e n ts t r a i n , t h eo n ew i t ht h em u t a n ts t i a i l li n c r e a s e db y2 0 a n dr e a c h e d9 0 a n dt h er e l a t i v e i n c r e a s i n gr a t ew a s2 8 5 7 2 t h ec a r r i e ro ft h ep o l y u r e t h a n ef o a mw a sd e c i d e dt h r o u g ht h eo p t i m a l e x p e r i m e n to nt h ec a r r i e ro fi m m o b i l i z e dc e l l t h eo p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t i o nw a s d e t e r m i n e d ：r o t a r ys h a k e ra t15 0 r m i n ，t h ec a r r i e ri n4 m m x4 m mx 4 r n m , a d d i n gt h e i i i a b s t r a c t p o l y u r e t h a n ef o a m ( 0 2 9 ) i n t ot h ef l a s k ( 1 0 0 m l ) ，t h et e m p e r a t u r e a t3 8 ( 2 ，t h ec a r r i e r a d d e di n t om e d i u ma f t e r10h o u r s c u l t u r i n g t h er e l a t i o n s h i po fl a c t i ca c i da n d a c t i v i t yo fl d h w a sa l s os t u d i e d ；w ed r e wt h ec o n c l u s i o nt h a tt h e i rr e l a t i o n s h i pw a s p e r i t i n e c e 3 t h em e t a b o l i cm o d e lw a se s t a b l i s h e da n da n a l y s i si l l u s t r a t e d i nt h i sp a r t ，w e c o n s t r u c t e dt h em e t a b o l i cn e t w o r k s ，e s t a b l i s h e dt h ei n t r a c e l l u a rm e t a b o l i cr e a c t i o n e q u a t i o n sa n dm a s sb a l a n c i n ge q u a t i o n s w ea n a l y z e dt h em e t a b o l i cf l u x e so ft h ef r e e c e l la n di m m o b i l i z e dc e l la n dr e a c h e dt h ec o n c l u s i o nt h a tt h ep y rw a sak e yk n o t t h e s er e s u l t sw o u l de n h a n c et h el a c t i ca c i dp r o d u c t i o n 4 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tr a t i oo fc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o u r c ea n dt h a to f m i c r o e l e m e n to nt h ef e r m e n t a t i o nw e r ea l s os t u d i e d w ef o u n dt h a tn i t r o g e ns o u r c eh a d a no b v i o u se f f e c to nl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n a f t e rt h eb a t c hf e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u t o n15b a t c h e s ，t h el a c t i ca c i dp r o d u c t i o nw a sk e p ts t e a d ya t7 8 8 9 9 l ，a n dt h e i m m o b i l i z e dc e l l sw e r ei n t a c t f o rt h ep u r p o s eo fc o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o ni nf u t u r e ，t h e o p t i m a ls u g a rc o n c e n t r a t i o nw a s d e c i d e dt ob ea ta b o u t8 5 t h r o u g ha na n a l y s i so ft h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，w e c o n c l u d e dt h a tt h er h i z o p u so r y z a ew a su n s u i t a b l ef o rt h em i x i n gb i o r e a c t o r , a n dw e m o d i f i e dt h es t r u c t u r eo ft h em i x i n gb i o r e a e t o ri n t oa i r l i f tb i o r e a c t o r d u r i n gt h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t h ep r o c e s so fd i s s o l v i n go x y g e nw a ss t u d i e d w ec o u l dd r a wt h e c o n c l u s i o nt h a tt h ed oh a da ne v i d e n te f f e c to nl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n w i t ht h e i n c r e a s eo fo x y g e n ，t h et i m eo ff e r m e n t a t i o nw a ss h o r t e n e df o r4 h ra n dt h ec o n v e r s i o n r a t ew a si m p r o v e db y10 t h e r o f o r e ，t h er h i z o p u so r y z a ew a sa e r o b i o s i sf u n g u s 6 t h ep r i m a r ys e p a r a t i n gf l o ww a sc o n s t r u c t e da n dt h eo n - l i n es e p a r a t i n gp r o c e s s w a sa n a l y z e d a f t e rt h ef e r m e n t a t i o nl i q u i dw a sd e a l tw i t ht h ep r i m a r ys e p a r a t i n gf l o w , i tc o u l dp r o t e c tt h ee q u i p m e n to fe l e c t r o d i a l y s i ss e p a r a t i n gb e t t e rf r o mb l o c k i n ga n d k e 印i tw o r kf o r al o n g e rt i m e i nt h el a s tp a r to ft h ed i s s e r t a t i o n , s o m ep o s s i b l en e wp r o b l e m sw e r ea l s op u t f o r w a r d k e y w o r d s ：r h i z o p u so r y z a e ；i m m o b i l i z e dc e l l ；l ( + ) 一l a c t i ca c i d ；i o n si m p l a n t a t i o n ； s c r e e n i n g ；f e r m e n t a t i o nb i o r e a c t o r ；l d h ：m e t a b o l i cf l u x i v 常用缩略语 常用缩略语 英文中文 缩写 a d e n o s i n ed i p h o s p h a t e 二磷酸腺苷 a d p a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 三磷酸腺苷 a t p d i n i t r o s a l i c y l i cc o l o r i m e t r i cm e t h o d 3 ，5 一二硝基水杨酸比色法 d n s e m b d e n m e y e r h o f - p a r n a sp a t h w a y糖酵解途径 e m p e r y t h r o s e4 - p h o s p h a t e四磷酸赤酰糖 e 4 p g l u c o s e 葡萄糖 o u r a v i na d e n i n ed i n u c l e o t i d e 黄素腺嘌呤二核苷酸 f a d r a v i na d e n n ed i n u c l e o t i d er e d u c e d 还原型黄素腺嘌呤二核苷酸 f a d h f r u c t o s ep h o s p h a t e 六磷酸果糖 f 6 p g i y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t e三磷酸甘油醛 g a 3 p g u c o s e6 - p h o s p h a t e 六磷酸葡萄糖 岛p h e x o s em o n o p h o s p h a t ep a t h w a y 磷酸戊糖途径 h m p m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s 代谢流量分析 m f a n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 n a d p h 酸 o x a l o a c e t a t e 草酰乙酸o m p h o s p h o e n o l p y r u v a t e僻酸烯醇内酮酸 p e p p o l y p r e n y ld i p h o s p h a t e 聚异戊二烯焦磷酸 p p p p y r u v i ca c i d丙酮酸 p y r p o l y - l a c t i ca c i d聚乳酸 p l a s c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p e 扫描电镜s e m l i n e a re n e r g yt r a n s f e r 传能线密度 l e t p e n t o s ep h o s p h o k e t o l a s ep a t h w a y 戊糖磷酸解酮酶途径 p p k f r u c t o s e - 6 p h o s p h a t e p h o s p h o k e t o l a s e果糖一6 一磷酸磷酸解酮酶途径f - 6 - p p k a s e p a t h w a y 中国科学院博士论文原创性声明 本人呈交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 所有数据、图片资料真实可靠。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学 位论文的研究成果不包含他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做 出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。本学位论文的知识产 权归属于培养单位。 本人签名：日期： 第一章引言 第一章引言 乳酸是世界公认的三丈有机酸之一，食品工业重要的酸味剂和防腐剂，也是医 药、化工、皮革、香料等工业的重要原料。乳酸既可以用化学合成的方法从石油或 煤等一次性资源中获得也可以用发酵方法从再生资源中获得。近年来随着石油和 煤等一次性资源的储量同盏减少，发酵法生产l 一乳酸被广泛采用。由于l 一乳酸是 生产聚l 一乳酸的原料而倍受科学家的重视，聚l 一乳酸可望在将来代替p v c 、p p 等 各种不可生物降解的塑料，以消除“白色污染”所造成的环境危机。另外，由于聚 l 一乳酸具有良好的生物相容性，因此广泛用作医用材料，如药物缓释材料、组织工 程材料、手术缝合线、骨折固定件等，被认为是最有发展潜力的可生物降解的高分 子材料，备受国内外关注。 1 1 乳酸的研究和应用进展 111 乳酸的性质 1111 乳酸的分子结构 乳酸( 1 a c t i ca c i d ) t 又名* 羟基丙酸( d h y d r o x y - p r o p a n o i ca c i d ) ，分子式为 c 3 h 6 0 3 ，分子量9 00 8 ，熔点1 68 c ，沸点1 2 2 c ( 2 k p a ) ，相对密度1 2 0 6 ( 2 5 4 ) ，燃烧热3 6 1 5 c o l g ，是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物 和微生物中“”。乳酸分子中有一个不对称碳原子，具有光学异构现象，从而具有 d 型和l 型两种构型。3 。l _ 乳酸为右旋性d 乳酸为左旋性，其结构式见图11 ， 当l ( 十) 一乳酸和d ( 一) 一乳酸等比例混合时，即成为消旋的d l - 乳酸。 嘤 “棚 吼 d ( 煳 圈i i乳酸的结构式 f i g l lt h es t r l i c t h f e o f l a c t i ca c i d ；一 k 离子注入选育米根霉及固定化生产l 乳酸发酵技术研究 1 1 1 2 乳酸的理化性质 乳酸异构体的理化性质如表1 1 所示豫引： 表1 1 乳酸异构体的理化性质 t a b l e1 ip h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fl a c t i ca c i di s o m e r 构型熔点 沸点比旋光度 q d 2 0解离常数熔化热( k j m 0 1 ) 溶解度g l o o g 水 l2 5 一- - 2 6+ 3 31 3 7 1 0 1 6 8 7 d2 5 2 6- - 3 31 3 7 1 0 1 6 8 7 d l1 8 1 2 2 ( 1 8 6 6 5 p a ) 01 3 7 1 0 1 1 3 5 纯净的无水l 一乳酸是白色的晶状固体，乳酸易与水互溶，不易结晶。6 0 浓度 以上的乳酸，已有很高的吸湿性，所以，商品l - 乳酸通常为6 0 的乳酸溶液，药 典级乳酸含量为8 5 - 9 0 ，食品级乳酸含量8 0 以上。在6 7 - - , 1 3 3 p a ( 1 - 一5 m m h g ) 的真空条件下反复分馏，可以得到纯品的乳酸结晶。 l 一乳酸通常是乳酸和乳酰乳酸的混合物，为无色透明或浅黄色糖浆状的粘稠 液，几乎无臭或微带有脂肪酸臭，味酸，与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮 混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯。 由于乳酸分子内有羟基和羧基，所以有自酯化的能力，乳酸的这种酯化能力使 其在开发可生物降解高分子聚合物方面具有很广阔的应用前景。羟基酸有一个羟基 和一个羧基，由于羟基的吸电子效应，羟基酸的酸性比相应的羧酸强，所以乳酸的 酸性比丙酸强。乳酸还可以参与许多反应，如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯 化反应等h 5 1 。 乳酸脱水聚合形成聚乳酸的一般形式为： n c h 3 c h o 。一蚪r 删十州h 2 0 c h 3 在加热乳酸时，发生自乳化可以形成乳交脂： 吼一r 一 f ，该系统则为超定系统( o v e r d e t e r m i n e ds y s t e m ) ，不仅能求出方 程的唯一解，而且可以用于系统的检验；若m ( f ，即模型中约束方程的个数小 于未知通量的个数，则这个系统即为不定体系( u n d e r d e t e r m i n e ds y s t e m ) ，这 时只有在代谢物平衡中引入新的约束，或者代谢物平衡施加一个整体优化准则 才能确定未知通量。通常情况下求解不定系统，需首先设定一个优化的目标， 寻求在目标优化的前提下，可获得模型通量分布的估值n 5 2 1 ；求解正定系统可 以直接用矩阵变化法“5 3 1 ，求解超定系统一般采用最小二乘法n 5 引。 4 2 3 米根霉代谢网络模型方程构建 对于米根霉代谢网络中的各组分，都符合质量守衡定律，对每组分列出 质量平衡方程( 见表4 2 ) 。为了便于计算，代谢方程写成矩阵形式( 式4 7 ) ： 5 l 离子注入选育米根霉及固定化生产l 一乳酸发酵技术研究 冬嚣t t r ( 4 7 ) 破 、7 其中，t 为代谢网络的计量系数矩阵，r 为反应速率向量，拿包括三部分： 班 部分是豳实验测得的底物消耗速率和产物形成速率，一部分为生物质合成的 前体物质，由文献上菌体组分含量数据得，第三部分为胞内中间物质，处于拟 稳态，累积速率为0 。 表4 2 质量平衡方程 t a b l e 4 2m a s sb l a n c ee q u a t i o n s 由表4 2 可知，对于米根霉发酵的代谢通量模型，共有l o 个方程，1 5 维速率 向量，因此整个方程的自由度为5 。颢实验可以测褥葡萄糖的比消耗速率，和卜 乳酸、苹果酸、富马酸、乙醇等5 组数据，此系统为正定系统，求方程采用m a t l a b 求解。 v a l l i n o n 6 5 1 定义代谢网络上有2 个以上分支途径的点为节点，节点处的通量分 配变化j 常显著的节点称为赋性节点，反之为挠性节点。在米根霉发酵产乳酸鲶过 程中，存在着节点，并且由于从p y r 出发存在四条代谢途径，从以下米根霉游离菌 和固定化缀胞在不阏生长时期的代谢逶量分柝中可以看出，节点p y r 处的逶量变纯 比较显著，所以p y r 为一刚性节点，也就是米根霉胞内代谢网络上的关键节点。因 此要想提高乳酸的产量和对糖的转化率，就必须提高流向乳酸的代谢流，减少其他 几个分支途径的代谢流。具体的方法可以通过控制外部环境提高乳酸前体物质丙酮 酸的浓度，还可以通过基因工程技术提高乳酸脱氢酶的活性或者降低酶系的活性， 5 2 第四章固定化米根霉代谢通量的分析 也可以筛选乳酸脱氢酶活性较高的菌株等方法。 表4 1r l 6 0 4 1 不同菌体形态的l 一乳酸分批发酵过程的比速率值( m m o l g h ) t a b l e4 1t h es p e c i f i cr a t e sf o rl - l a c t i ca c i db a c hf e r m e n t a t i o no f d i f f e r m tm o 呐o l o 甜r l 6 0 4 1 ( m m o l g h ) ( 注：表中数据是通过h p l c 测定发酵液中的乳酸、富马酸、苹果酸；利用生物传感仪测定残糖、乙醇等数值 后，经计算后得到的比速率值) 本实验研究了米根霉在游离菌和固定化细胞两种不同条件下，形成不同的菌 体形态对发酵的影响。由于菌体形态影响着发酵液的流变学特性及质量传递的效 率，从而影响产酸的进程。在这两种不同状态下，通量分布结果如图4 2 所示。由 图中发酵过程中的通量值比较可以看出，游离菌和固定化细胞相比较，固定化细胞 用于合成乳酸的葡萄糖相应的较多，导致其产酸水平较游离菌高，这或许是因为固 定化细胞是增殖好的细胞，细胞内部的葡萄糖流向乳酸的通量较高，而游离菌接入 发酵瓶中后，由于米根霉有较长的菌丝容易结成球，影响了其溶氧及物质传递，在 下图通量分析图中可以看出，流向生成乳酸途径的葡萄糖较少而生成乙醇和二氧化 碳等副产物的通量都较固定化细胞有所提高。由此可见，不同的菌体形态对乳酸产 量的影响是明显的，所以如果能够很好地了解代谢网络，构建代谢网络图，对于提 高产物的产量是很有可能和实际意义的。 离子注入选育米根霉及固定化生产l - 孚- l 酸发酵技术研究 筒限 a d p g l u a 聃 a d p g 6 p l l i ，i i f n l 6 p i t o o n o o = a t 冲瑚 ”n a d h 2 r a t p + n a d h 2 f a 图4 2 米根霉发酵过程中的代谢通量分布 f i g u r e 4 2m e t a b o l i cf l u xd i s t r i b u t i o no fr h i z o p u so r y z a ef e r m e n t a t i o n ( 图中数据分子是游离菌，分母是固定化细胞的通量值) 注：图中的数据单位是m m o l c g d c w h r ，并且把葡萄糖的消耗速率设定为1 0 0 ，其他 的通量值以此为基础计算得到。 4 3 本章小结 本章主要对代谢通量模型的建立及代谢通量分析的理论基础进行了阐述，并 且构建了代谢通量网络，建立了米根霉胞内代谢反应方程、质量平衡方程，对固定 化细胞和游离菌的代谢通量分析，通过分析可以知道米根霉葡萄糖代谢中丙酮酸 ( p y r ) 是刚性节点，并且通过代谢网络的分析可以为今后构建代谢网络使其将代谢 流流向有利于提高产物的方向奠定了基础。 第五章固定化米根霉摇瓶分批发酵的研究 第五章固定化米根霉摇瓶分批发酵的研究 工业发酵过程的研究，一般分为三种规模或者三个阶段：( 1 ) 实验室规模，进 行菌种的筛选和培养基的研究；( 2 ) 中试工厂规模，确定菌种培养的最佳操作条件； ( 3 ) 工厂生产规模，进行大规模生产，取得经济效益的过程。微生物培养过程研究 有两个主要作用：一是将科研所的的新方法应用于工业生产；二是通过试验找到更 好的菌种、更佳的培养基和培养条件以及更好的设备去改进现行的生产。由于前两 章已经对筛选出的菌株进行了研究，并且确定了摇瓶最佳的发酵条件，要想进一步 进行放大实验，要先在实验室中进行发酵罐培养小试试验。在本章中，对实验室小 试前的准备工作进行了研究。 5 1 材料与方法 5 1 1 实验菌株 实验菌株r l 6 0 4 1 ，本实验室通过离子注入诱变p w 3 5 2 经过鉴定为米根霉 ( r h i z o p u so r y z a e ) 】获得。 5 1 2 培养基 5 1 2 1 斜面培养基：同第二章1 2 1 。 5 1 2 2 产孢子培养基( g l ) ：同第二章1 2 2 。 5 1 2 3 种子培养基( g l ) ： 同第二章1 2 3 。 5 1 2 4 发酵培养基( g l ) ：同第二章1 2 4 。 5 1 2 5 增殖培养基( ) ：同第二章1 2 5 。 5 1 2 6 筛选培养基：同第二章1 2 6 。 以上培养基的湿热灭菌条件为0 1 m p a ，1 2 1 ，2 0 m i n 。碳源和c a c 0 3 单独灭 菌后，在接种前与其它成分混合。 5 1 3 培养方法 5 1 3 1 斜面培养：同第二章1 3 1 。 5 1 3 2 单菌落分离平板培养：同第二章1 3 2 。 5 1 3 3 种子培养：同第二章1 3 3 。 5 1 3 4 发酵培养：同第二章1 3 4 。 5 1 3 5 电镜制片： 离子注入选育米根霉及固定化生产l 一乳酸发酵技术研究 1 取载玻片，无水乙醇浸泡后灼烧，冷却备用： 2 载玻片上正面做好标记，反面画一圆圈； 3 将分批发酵后的固定化细胞用小刀切成小薄片，放置在载玻片上； 4 1 戊二醛固定，自然风干。 5 1 4 分析方法 5 1 4 1p h 测定 采用国产精密p h 试纸和p h s - 2 c 型精密酸度计( 上海雷磁仪器厂) 。 5 1 4 2 发酵液中残糖的计算：同第二章1 4 2 。 5 1 4 3l - 乳酸的测定：同第二章1 4 3 。 5 2 结果与分析 5 2 1 发酵培养基成份对固定化细胞生产乳酸的影响 工业微生物绝大部分是异养型微生物，它需要碳水化合物、蛋白质和前体等物 质提供能量和构成特定产物的需要。为此，对发酵培养基成份对固定化细胞生产乳 酸的影响进行了研究，分别对( 1 ) 只) b h g l u c o s e ，不加入氮源及微量元素；( 2 ) 加 入g l u c o s e 和微量元素，不加入氮源；( 3 ) 加入西u c o s e 和硫酸铵，不加入微量元素； ( 4 ) 碳源、氮源和微量元素全部加入等四种情况进行了研究，g l u c o s e 、( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 及微量元素的加入量同本章1 2 4 ，研究结果如下图： 8 0 7 0 6 0 j 5 0 蝴柏 钆 禽 蒜 2 0 1 0 o g i u g i u + 微量元素g l u + ( n h k s o g l u + ( n h b s o + 微量元素 图5 1 不同培养成份对乳酸产量的影响 f i g u r e 5 。1e f f e c to f d i f f e r e n ti n g r e d i e n to nl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n 碳源、氮源及微量元素对固定化细胞生产乳酸的影响见图5 1 。从图中可以看 出，在只加入碳源时，乳酸的产量最高达n s l g l ；而不加氮源时，乳酸的产量稍 第五章 固定化米根霉摇瓶分批发酵的研究 微要低一些达到7 2 9 l ；在不加入微量元素时，乳酸的产量比不加氮源时要高一些 达到7 5 9 l ；当碳源、氮源及微量元素都加入培养基中时，乳酸的产量不加微量元 素时要高一些达至u 7 7 9 l 。从试验结果可以看出，氮源对乳酸产量的影响较为明显， 而微量元素的影响则显得较为小些。 5 2 2 不同发酵时间对乳酸发酵的影响 固定化米根霉发酵生产l 一乳酸，在发酵生产过程中，随着发酵时间的变化，乳 酸产量、残糖以及菌体的生物量都在变化。为了研究r l 6 0 4 1 产酸特性，在投糖浓度 1 5 ，3 8 ，摇床转速为1 5 0 r m i n 条件下进行了本次试验。 036g1 2 1 5 1 8 2 1 2 4 2 7 3 0 3 3 3 63 9 4 24 54 85 15 45 7 发酵时间( h ) 图5 2 不同发酵时间发酵产酸曲线 f i 9 5 2t h ec u r v e so fl a c t i ca c i dp r o d u c t i o nd u r i n gd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nt i m e 固定化米根霉发酵生产l 一乳酸的过程中，乳酸产量、残糖及生物量的变化随发 酵时间变化的曲线如图5 2 所示。从图中可以看出，在整个发酵过程中，糖浓度随 着发酵时间的增加在减少，在发酵开始的前l o h r 内糖浓度降低的较慢，随后糖浓度 明显下降，到了3 0 h r 后减少缓慢；而从乳酸产量的曲线来看，乳酸的产量一直在增 加，达至u 3 5 h r 后，乳酸的产量增加的较慢；对于增殖好的固定化细胞的生物量在发 酵过程中基本上变化不大，由此可以看出，1 5 投糖时发酵周期较长达到约3 5 h r 。 5 2 3 不同糖浓度对乳酸产量及转化率的影响 考虑到实验最终要从摇瓶转到发酵罐中进行连续发酵，投糖浓度过高发酵时间 离子注入选育米根霉及嘲定化生产l - - 孚l 酸发酵技术研究 较长，所以需要综合考虑投糖浓度对乳酸产量以及转化率高低的影响，为此进行了 2 0 9 l ，5 0 9 l ，8 0 9 l ，1 0 0 9 l ，1 2 0 9 l ) l 个梯度的不固投糖浓度对乳酸产量以及 转化率影响的研究。 0 0 9 0 8 0 7 0 02 04 01 0 01 2 01 4 0 糖浓度( g l ) 图器3 不同糖浓度对产酸的影响 f i 9 5 3e f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no nl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n 不同投糖浓度对乳酸产量以及转化率的影响的实验结果如上图所示。从图中可 以看出，随着投糖浓度的增加，乳酸的产量在逐渐地增加，但是转化率却是在减少 的。当投糖浓度为2 0 9 l 和5 0 9 l 时，虽然转化率很高但是乳酸产量较低；投糖浓度 为8 0 9 l 时乳酸的产量较高并量转化率也较高；投糖浓度达到l o o g l 和1 2 0 9 l 时， 虽然乳酸的产量很高，但是转化率却下降；考虑到以后在发酵罐中要实现连续化发 酵生产，如果投糖浓度太低，发酵液会被很快稀释，基于上述原因，所以选择发酵 投糖浓度为8 0 9 l 。 5 2 4 固定纯细胞反复分批发酵的研究 在确定的最佳固定化条件下，将培养好的固定化细胞转接入摇瓶发酵培基中进 行乙一乳酸发酵，将每批发酵结束后的豳定化细胞用无菌水冲洗三次，再转接入新鲜 的发酵培养基中进行反复分批发酵，重复1 5 批次。用以确定固定化细胞的重复使用 效率。 柚 博 o 装v 糌警蘩 1麓v嘲牝整霏 第五章固定化米根霉摇瓶分批发酵的研究 1 0 0 8 0 6 0 o 01234567891 0 ”1 21 3 1 4 1 5 1 6 d i f f e r e n tb a t c h 图5 4 固定化细胞分批发酵的产酸量 f i 9 5 4t h el a c t i ca c i dp r o d u c t i o nw i t hd i f f e r e n tb a t c hf e r m e n t a t i o no fi m m o b i l i z e dc e l l 固定化细胞分批发酵培养结果如图5 4 ，从图中可以看出，培养好的固定化细 胞在连续分批1 5 次发酵后，乳酸产量比较稳定，说明固定化米根霉活性保持良好， 重复使用1 5 批次后，产酸量基本上保持在7 8 - 8 9 9 l ，这充分体现了固定化细胞使用 寿命长、稳定性好、可重复利用的优点；与游离菌相比，固定化细胞分批发酵时， 节省了每次做种子瓶的时间和原料，降低了成本，减少了染菌的机率，为今后固定 化细胞连续发酵的工业化生产奠定了基础。 5 2 5 扫描电镜观察固定化细胞 经过1 5 批次反复