（植物营养学专业论文）油菜体内氮素再分配与氮素生理效率的关系研究.pdf

油菜体内氮素再分配与氮素生理效率的关系 研究 摘要 氮肥损失引起的环境污染得到了人们的普遍关注i ，如何提高作物的氮肥利用效 率已成为当前植物营养学领域的研究热点。随着栽培措施的不断改进，人们将目光转 向植物本身，希望通过新品种选育来提高作物的氮肥利用效掣2 1 。因而，研究不同油 菜品种( 基因型) 氮效率及其在生理代谢方面的差异势在必行，可为定向选育氮高效 油菜品种以及遗传改良油菜氮素营养性状提供重要的科学依据。 本试验采用珍珠岩砂培方法，在正常供氮条件下研究了2 个油菜品种( 7 4 2 和 h u i y o u 5 0 ) 生长后期韧皮部汁液成分的变化动态以及有关氮素再分配的关键酶：叶片 蛋白水解酶( p r o t e o l y t i ce n z y m e ，p e ) 、叶片谷氨酰胺合成酶( g l u t a m i n es y n t h e t a s e , g s ) 和籽粒谷氨酸合成酶( g l u t a m a t e ：z - o x o g l u t a r a t ea m i n o t r a n s f e r a s c ，即g l u t a m a t e s y n t h a s e ，g o g a t ) 的活性，并且用同位素( 1 5 n ) 示踪技术进一步研究了不同氮素生理 效率的油菜品种生长后期营养体有机氮再分配的差异。 1 比较两个油菜品种以上3 种酶的活性表明，p e 活性品种间差异很小；g s 活 性角果形成前期7 4 2 高于汇油5 0 ，角果形成后期则7 4 2 低于汇油5 0 ；g o g a t 活性， 汇油5 0 的酶活性强但维持时间短，7 4 2 的酶活性弱而维持时间长。油菜花后不同时 期氮素再分配关键酶活性的测定结果表明，随着花后植物体的衰老，叶片p e 的活性 虽有所波动但总体上呈下降趋势；叶片g s 的活性在角果形成中期达到最强值，后期 又有一个下降的变化趋势；耔粒g o g a t 活穗逐渐升高，到角果形成后期达最高值后 又下降。 2 2 油菜品种韧皮部汁液中游离氨基酸和i 广谷氨酰胺含量差异的测定结果表明， 游离氨基酸含量的品种间差异并没有显示出规律性变化，而l 谷氨酰胺含量7 4 2 均 高于汇油5 0 。油菜花后不同时期韧皮部汁液中游离氨基酸和l 谷氨酰胺含量的测定 结果表明，谫离氨基酸含量在生长后期的测定值变化较大，而l 谷氨酰胺含量在生 长后期两品种均呈快速下降的趋势。 3 采用1 n 示踪方法，研究油菜生长后期营养体有机氮再分配差异的结果表明， 品种7 4 2 与汇油5 0 相比，7 4 2 的有机氮再分配量大，有机氮再分配速度先慢后快， 向籽粒再分配的氮素量及其比例大，向角果皮再分配的氮素量及其比例小，植株体氮 素损失量及其比例小，氮素损失速度慢。由于以上原因，7 4 2 的氮素生理效率与氮收 获指数均明显高于汇油5 0 。比较2 品种4 个生育期吸收的氮素再分配量及其比例表 明，蕾苔期吸收的氮素再分配量及其比例最大，角果发育期吸收的氮素再分配量及比 例最小，苗期和开花期吸收的氮素再分配量及比例居于前二者之间。 关键词：蛋白水解酶；g s ；c , - ( ) g a t ；游离氨基酸；l 谷氨酰胺；油菜；氮素再利用； 植株体氮素损失 n s t u d i e so nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e n i t r o g e nd i s t r i b u t i o na n dt h e n i t r o g e np h y s i o l o g i c a le f f i c i e n c yi no i l s e e dr a p e a b s t r a c t t h ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nb yt h el o s so fnf e r t i l i z e rh a sb r o u g h ta b o u tg r e a t c o n c e l t la l lo v e rt h ew o r l d ( r a n ne ta 1 ，2 0 0 2 ) a sar e s u l t , h o wt or a i s et h enf e r t i l i z e r e f f i c i e n c yh a sb e c o m eac e n t r a li s s u ei nt h ep l a n tn u t r i t i o nf i e l d s w i t ht h ec o n t i n u o u s i m p r o v e m e n to fc u l t i v a t i o nm e a s u r e s ，f o c u sh a sb e e nt u r n e dt op l a n ti t s e l f , w i t he f f o r t st o r a i s enf e r t i l i z e ru s ee f f i c i e n c yt h r o u g h c r o pb r e e d i n g t h i sp a p e rc o m p a r e dt h ed i f f e r e n c e o f n e f f i c i e n c yo fs o m es e e dr a p eg e n o t y p e sa n dp r e l i m i n a r i l ys t u d i e dm e i rm e c h a n i s mf o r p r o v i d i n gas c i e n t i f i cb a s i si nt h em a n a g e m e n to f nn u t r i e n t ，a n ds e l e c t i n ga n db r e e d i n go f h i 曲ne f f i c i e n c yv a r i e t i e s t w os e e dr a p ev a r i e t i e s ( 7 4 2 ，h u i y o u 5 0 ) w e r eu s e di no u r e x p e r i m e n t s t h ed y n a m i c c h a n g ei np h l o e mj n i c ec o n t e n td u r i n gt h el a t e rg r o w i n gp e r i o da n dt h ea c t i v eo ft h ek e y e n z y m ef e e 、g s 、g o g a t ) w h i c hl e a dt ot h ed i f f e r e n c eo f n i t r o g e nu s ee f f i c i e n c y w e r e s t u d i e du n d e rt h es a n dc u l t m eo f c o m p l e t en u t r i e n ts o l u t i o nc o n d i t i o nw i t hn o r m a ln i t r o g e n s u p p l ya n dt h ed i f f e r e n c e so fo r g a n i cn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o ni nv e g e t a t i v eo fo i l s e e dr a p e v a r i e t i e sw i t hd i f f e r e n tn i t r o g e np h y s i o l o g i c a le f f i c i e n c yw e r es t u d i e d - u s i n g1 5 nt r a c e m e t h o dd u r i n gt h el a t e rg r o w i n g p e r i o d t h ea c t i v eo ft h ep r o t e o l y t i ce n z y m e ( p e ) a n dt h eg l u t a m i n es y n t h e t a s e ( g s 、i n b l a d e sa n dt h ea c t i v eo fg l u t a m a t ez - o x o g h i t a r a t ea m i n o t r a n s f c r a s e ( g o g a t ) i ns e e d sa t d i f f e r e n tt i m ew e r ed e t e r m i n e dd u r i n gt h el a t e rg r o w i n gp e r i o d , a n dt h ec o n t e n to f 丘 a m i n oa c i da n dl - g l u t a m i n ei np h l o e m j u i c ew e r ea l s od e t e r m i n e di nt h ee x p e r i m e n t t h e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tw i t hs e n e s c e n c eo ft h ep l a n td u r i n gt h ep e r i o da f t e rb l o o m i n g , t h e a c t i v eo fp r o t e o l y t i ee n z y m ei nb l a d e sd e c r e a s e d ，t h o u g hi tf l u c t u a t e d t h eg sa c t i v ei n b l a d e sd e c r e a s e df i r s t ，t h e ni n c r e a s e da n df i n a l l yd e c r e a s e da g a i n ；t h eg o g a ta c t i v ei n s e e d si n c r e a s e dg r a d u a l l y , r e a c h i n gt h em a x i m u md u r i n gt h el a t e rp e r i o do f s e e d sa n dt h e n d e c r e a s e d c o m p a r i n gt h ea e t i v e so ft h et h r e ee n z y m e si nt w ov a r i e t i e s ，t h ee x p e r i m e n t a l d a t ai n d i c a t e dt h e r ew a sl i r l ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h ea c t i v e so fp r o t e o l y t i cc l l z y l n ei nt w o b r e e d s t h eg sa c t i v ei n7 4 2w a sh i g h e rt h a nt h a ti nh u i y o u5 0d u r i n gt h ee a r l i e rp e r i o do f i i i s e e d s ，b u ti tw a st h eo p p o s i t ed u r i n gt h el a t e rp e r i o do fs e e d s t h eg o g a ta c t i v ei n h u i y o u 5 0w a sh i 曲b u t i to n l ys u s t a i n e df o ras h o r tp e r i o d ；h o w e v e r , t h eg o g a ta c t i v e i n7 4 2w a sl o wb u ti ts u s t a i n e df o ral o n g e rp e r i o d t h ec o n t e n t so ff r e ea m i n oa c i da n dl - g l u t a m i n ei np h l o e mj u i c ew e r em e a s u r e d d u r i n gt h eg r o w i n gp e r i o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to ff r e e a r i n oa c i di n p h l o e mj u i c ew e r eu n s t e a d y , w h i l et h ec o n t e n to fl - g l u t a m i n ea p p e a l - t ob er a p i dd e c l i n e d i nt h et w ob r e e d s t h ed i f f e r e n c ei nf r e ea m i n oa c i db e t w e e nb r e e d sw a sl a r g e ，a n dt h e c o n t e n to f l g l u t a m i n ei n7 4 2i sh i g h e rt h a nt h a ti nh u i y o u5 0 t h ed i f f e r e n c e so fo r g a n i cn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o ni n v e g e t a t i v eo fo i l s e e dr a p e v a r i e t i e sw i t hd i f f e r e n tn i t r o g e np h y s i o l o g i c a le f f i c i e n c yd u r i n gt h el a t e rg r o w i n gp e r i o d w e r es t u d i e du s i n g1 5 nt r a c em e t h o du n d e rt h es a n dc u l t u r eo fc o m p l e t en u t r i e n ts o l u t i o n c o n d i t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a t1 1 i 曲n i t r o g e np h y s i o l o g i c a lv a r i e t y ( v a r i e t y7 4 2 ) h a dl a r g e r a m o u n to fo r g a r f i cn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o n , c o m p a r e dw i t ht h el o wn i t r o g e np h y s i o l o g i c a l e f f i c i e n c yv a r i e t y ( v a r i e t yh u i y o u 5 0 ) t h es p e e do fo r g a n i cn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o nw a s s l o wa tf i r s ta n dt h e nf a s t ，t h ea m o u n to fn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o nt o w a r ds e e d sa n di t s p r o p o r t i o n w a sl a r g e r , t h ea m o u n to fn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o nt o w a r ds i q u i l i na n di t s p r o p o r t i o nw a ss m a l l e r t h ea m o u n t so fn i t r o g e nl o s sb yp l a n ta n di t sp r o p o r t i o nw e r e s m a l l e r , a n dt h ev e l o c i t yo fn i t r o g e nl o s si ss l o w e r a sar e s u l t ，t h en i t r o g e np h y s i o l o g i c a l e f f i c i e n c ya n dn i t r o g e nh a r v e s ti n d e xo fv a r i e t y7 4 2w e r eh i g h e rt h a nt h a t o fv a r i e t y h u i y o u 5 0 b yc o m p a r i n gt h ea m o u n to fn i t r o g e nr e d i s t r i b u t i o na n di t sp r o p o r t i o nd u r i n g t h ef o u rg r o w i n gp e r i o d s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el a r g e s tr e d i s t r i b u t i o na m o u n to f u i t r o g e na b s o r b e db yp l a n ta n di t sp r o p o r t i o nw a sf o u n di n s t e r ne l o n g a t i o ns t a g e ，t h e s m a l l e s tr e d i s t r i b u t i o na m o u n ta n di t sp r o p o r t i o na ts i l i q u i n gs t a g e , w h i l et h o s ew e r e b e t w e e nt h e ma ts e e d i n ga n df l o w i n gs t a g e s ， k e yw o r d s ：o i l - s e e dr a p e ；p r o t e o l y t i ce n z y m e ；g s ；g o g a t ；f r e ea m i n oa c i d ； l - g l u t a m i n e ；n i t r o g e nr e u s e ；n i t r o g e nl o s sb yp l a n t i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我 所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含来获褥湖南农业大学或其它教育研究机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作t n 确的说明并表示了谢意。 研究生虢；珏彳压擎 帆。一7 年r 胁日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。同意湖南农业太学可以用不同方式在不霹媒体上发表、传播学位论文的全部 或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生魏7 07 忽肇 帆舢1 年胁日 导师签名： 磅舀琵 时间：声唧年6 月潮 第一章绪论 1 研究目的和意义 1 1 当前全球范围内面临氮素利用率低下的严峻形式 目前地球上氮肥每年的用量大约是1 0 0 0 亿公斤。在许多农业系统中相当大一部 分可利用氮肥从土壤中流失到地下水、河流和海洋中。氮肥的利用率相当低 4 ( c a s s m a n e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。全球范围内，谷物氮素利用效率( n u b ) ：( 被作物吸收的氮一( 来 自土壤的氮雨水中储存的氮) 】作物使用的氮) 大约只有3 3 【5 1 ( j a c k s o n ，1 9 8 6 ) 。然而 由于相对较低的氮肥价格( o 5 5 u s p e rk 曲。发达国家的农民仍继续大量施用肥料： 一方面是为了稳产；另一方面或者说更多的是为了丰产。据r a u n 和j o h n s o n ( 1 9 9 9 ) 的统计表明：每年约有6 7 的( 折合人民币1 5 9 亿) 有效氮肥损失掉了( 假如肥料一土壤 平衡1 。可是氮的利用率( n l r e ) 只提高了1 。更严= 重的是：过量化肥的施用对环境方 面造成的影响而产生的损失将无法仅仅用金钱去衡量，并且对于提高氮肥利用率的报 道还很少，急需进一步深入研究 e l 。 1 2 品种间氮素利用效率的基因型差异 植物在利用空气中的二氧化碳及土壤中的养分和水分，把太阳能转化为生物能的 过程中，增加了其生物量，同时也积累能量，驱动自身的生长发育。在这个过程中， 植物在有细胞膜和其它亚细胞嚣的细胞和组织内进行着各种生理生化活动，这些活动 一方面受植物的遗传控制，另一方面也受环境因素的影响。进行这些过程的基本要素 是营养元素，各种生理生化过程的需求又决定着植物对营养元素吸收和利用的状况。 植物在生长过程中需要合成蛋白质，蛋白质的合成受d n a 的控制。植物生长状况决定 于基因潜力和环境条件的相互作用。 所以，不论是通过一般农艺措施提高植物的营养效率，还是通过遗传工程途径改 良植物的营养效率，都应该对植物的生物学和生理学机理进行深入研究。“一基因一 酶”的基本原理表明，基因的最后表达是通过酶及其指导的生理生化过程实现的。假 如植物某一营养性状存在着基因型差异，那么这种差异必定有相应的生理生化标记。 确定这些标记之后，就可以追踪该性状的控制基因。只有找到了控制基因，才能更有 效地对该性状进行遗传改良( 尤其是分子遗传学改良) 。迄今已有大量的证据表明植 物无论是在不同的种属间还是在同一种类植物的不同品种( 或品系) 之间均存在着氮 效率差异，具体表现在：1 吸收硝态氮和铵态氮能力的差异；2 硝酸还原酶的水平和 活性的差异；3 体内无机氮( 主要是硝酸盐) 储藏库大小的差异；4 氮在体内运输和 再利用的差异【7 ”( r o s e ，1 9 8 4 ；c l a r ka n dd u n c a n ，1 9 9 1 ) 。 在某一植物种内的品种或品系之间也普遍存在氮效率的基因型差异。自从h a r v e y ( 1 9 3 9 ) 首次定量报道不同玉米品种在吸收利用氮素方面的差异以来，有关植物氮效 率基因型差异的报道已涉及玉米、小麦、水稻、高粱、苹果等多种类型的作捌7 。”( r o s e ， 1 9 8 4 ：c l a r ka n dd u n c a n ，1 9 9 1 ) ，说明了氮效率基因型差异是普遍存在的现象，有 着很大的遗传改良潜力。 因此，提高作物氮的经济利用( 如水稻氮素利用率只有3 0 ) ，筛选氮素高效利 用基因型作物，培育经济用氮的新品种，成为世界各国面临的一项重大课题。以往对 氮素吸收、同化方面报道较多，而有关衰老过程中氮代谢的变化，氮再分配与作物产 量形成、品质改良，衰老叶片中氮素的输出及调节等方面的研究则比较少。 1 3 本试验研究对于提高氮素利用率方面的作用 植物体内氮的有效分布和运输特征与氮素的损失有着密不可分的关系，它可以大 大提高植物体内氮的利用率，从本质上保证植物能更高效、大量的吸收利用外界氮源， 提高氮素利用率( n u e ) ，从而可以减少氮的损失和污染。研究者提出1 9 】：减少对氮 肥的需求量最好是寄希望于寻找更有效的氮肥的运输途径，使植物体的吸收、储藏、 转运是个畅通无阻的过程，换之以大量氮肥的施用。 本试验正是应当前形式所需，以植物体内部生理机制为基础，以植物体运输、转 化机制的影响作为研究对象，研究油菜生育后期，不同品种间氮素的分配、转运及其 生理机制，以期找到一种高效高产的生理转化、转运机制，从而提高氮素利用效率， 改善人类生存环境。根据项目组以往的研究结果，本试验选用了正常供氮条件下氮素 胜利效率差异较大的2 个油菜品种7 4 2 和汇油5 0 为供试材料。 2 国内外研究进展 目前国内外对氮素分布、转化和转运生理机制方面的研究不仅很少，并且主要集 中在对单品种植物、一个特定生育时期氮素分配、转化和转运情况的研究，或是某个 生育时期在外界提供某种特殊物质时，氮素转运分配以及氮素利用率的变化，缺乏系 统性和实用性。 2 1 不同形态氮素的转运、转化机制 2 1 1 氮转运系统对氮素转运和分配的影响 铵和硝态氮是大多数植物生长需要的氮源“”。植物根细胞吸收硝态氮是高等植 物同化氮素的第一步“ 。用1 3 n 0 3 测定硝态氮的内流和净吸收【1 2 】表明，硝态氮( n 0 3 。) 有三个转运系统：低亲和转运系统( l o w a f f i n i t yt r a n s p o r ts y s t e m s ，l a t s ) 和高亲和 性转运系统( h i g h - a f y m i t y t r a n s p o r ts y s t e m s , h a t s ) ，高亲和性转运系统可进一步分为： 构成型( c o n s t i t u t i v eh i g h - a f f i n i t yt r a n s p o r ts y s t e m s ，c h a t s ) 和诱导型( i n d u c i b l e h i g h - a f f i n i t yt r a n s p o as y s t e m s ，i h a t s ) 1 3 , 1 4 , 1 5 较低n 0 3 浓度( 以生物产量为基础的氮素生理效率= 生物产量植株全氮 ( 2 ) 以籽粒产量为基础的氮素生理效率= 籽粒产量植株全氮 ( 3 ) 收获指数= 籽粒产量生物产量 ( 4 ) 氮收获指数= 籽粒全氮植株全氮 1 5 n 丰度按半微量定氮法进行前处理，河北省农业科学院遗传研究所m a t 质谱 仪测定。根据标记结束时所取样品的各器官原子百分超和标记后在无1 氐营养液中生 长到不同生育期后所取样品的各器官原子百分超，计算营养器官氮素向生殖器官的转 运量与比例、营养器官氮素的减少量与比例以及氮素的损失量与比例。计算公式如下： ( 1 ) 氮素转运比例= 生殖器官1 村累积量标记结束时植株1 5 n 累积量1 0 0 ( 2 ) 氮素转运量= 氮素转运比例标记结束时植株氮素累积量 ( 3 ) 营养器官氮素的减少比例= ( 标记结束时营养器官1 5 n 累积量收获期营养 器官1 氐累积量) + 标记结束时营养器官1 5 n 累积量x i 0 0 7 ( 4 ) 营养器官氮素减少量= 营养器官氮素的减少的比例标记结束时营养器官氮 素累积量 ( 5 ) 氮素损失比例= 【标记结束时植株1 5 n 累积量一收获期( 或角果发育期) 植株 1 n 累积量卜标记结束时植株0 5 n 累积量x 1 0 0 ( 6 ) 氮素损失量氮素损失比例标记结束时植株氮素累积量 试验所得数据均用e x c e l 和s p s s 专业版统计软件进行处理，其中有机氮再利用 数据两品种间进行t 检验。 2 氮素再分配关键酶活性研究 2 1 供试品种及试验设计 采用砂培试验，在湖南农业大学农业资源与环境专业教学实习基地玻璃房内进 行。选用3 0c s x 3 0c n l 棕色塑料钵，生长基质为无营养液成分( 用水和稀盐酸清洗 干净) 的珍珠岩砂粒，采用h o a g l a n d 完全营养液，按不同时期油菜正常生长的营养 需求量进行浇灌。供试油菜品种为7 4 2 和汇油5 0 ，于2 0 0 5 年1 1 月2 日移栽，2 0 0 6 年5 月5 同收获。共培养4 2 钵( 每品种2 l 钵) ，每钵移苗一棵。按表2 2 时间安排 分别在2 0 0 6 年4 月5 日、4 月7 日、4 月1 1 日、4 月1 4 日、4 月1 7 日和4 月2 4 日， 采选其功能叶( 上数4 - 8 片叶) 和籽粒( 全株籽粒混合样) ，前者用于测定蛋白永解 酶和g s 活性，后者用于测定g o g a t 的活性。同时采用e d t a 法收集韧皮部汁液。 2 2 取样及测定方法 韧皮部汁液的收集过程如下【9 8 l ：用单面刀片( 丙酮浸泡，蒸馏水冲洗干净干燥后 既可使用) 切取1 0 片中部节位叶，用蒸馏水冲洗以除去木质部汁液的污染物，然后 迅速将切下的叶柄平整面插入装有1 5 m l1 0 m m o l l 的e d t a - n a 2 溶液( p h 7 0 。含氯霉 1 4 素o ，0 1 5 m m o y l ) 的l o o m l 烧杯内，再将烧杯放入一个密闭的饱和湿度的容器中，在 黑暗中2 5 ( 2 下收集5 小时。已研究表明，5 小时后韧皮部汁液被完全收集，并且细胞 组分的污染物可以被忽略【9 引。 实验重复与测定重复次数均为3 次。4 月7 日、4 月1 1 日、4 月1 4 日、4 月1 7 臼和4 月2 4 日，还收集韧皮部汁液测定其中的可溶性糖、游离氨基酸及l 一谷氨酰胺 含量。其中可溶性糖、游离氨基酸的实验重复与测定重复次数均为3 次；l _ 谷氨酰胺 实验与测定重复次数均为1 次。 2 3 氮素再利用关键酶活性及韧皮部汁液成分的测定及其计算 2 3 1 蛋白水解酶活性的测定 叶片蛋白水解酶活性参照韩雅珊的方法进行测定1 9 9 1 ，以每分钟生成1pm o l 酪氨 酸所需的酶量定义为一个酶活力单位。 1 酶的粗提液 剪取时片，洗净吸于后剪碎混均，称取1 0 0 0 9 ，置玻璃研钵中冷冻3 0 分钟，加 少量石英砂和l o m l o 2 m p h 为7 5 的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，用而层纱布过滤，滤 液用8 0 0 0 x g ( 约8 5 0 0 r p m ) 冷冻离心1 5 分钟，得到的上清液即酶的提取液。 2 标准曲线的制作 将标准酪氨酸配成0 - 1 0 0 u g m g 的各种不同溶液，分别吸取l m l ，各加入 5 m l o 5 5 m o l l n a 2 c 0 3 溶液及l m l f o l i n - 酚试剂，置于4 0 水浴中发色2 0 分钟，在6 8 0 n m 处测定吸光度。以酪氨酸的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3 酶活性的测定 取酶液3 m l ，预热至4 0 ，加入预热的0 5 9 6 酪蛋白2 m l ，于4 0 反应3 0 分钟， 反应结束时加入1 0 9 6 三氯乙酸5 m l ，立即摇匀，静置3 0 分钟后过滤。取滤液l m l ，加 入o 5 5 m o l l n a 2 c 0 3 溶液5 m l ，l m l f o l i n 酚试剂，于4 0 水浴中发色2 0 分钟，在6 8 0 n m 下测定吸光度。空白先加5 m l 三氯乙酸溶液，再加入底物和酶液，同样测定吸光度。 2 3 2 谷氨酰胺合成酶活性的测定 叶片g s 活性参照现代植物生理学实验指南【瑚1 介绍的方法进行测定，以每分 钟生成ll lm o lr 一谷氨酰羟亏酸所需的酶量定义为个酶活力单位。 1 酶的初提液 叶片洗净以后，剪碎混均，称取1 0 0 0 9 置玻璃研钵中，冷冻3 0 分钟。加入少量 的石英砂及5 m m 磷酸缓冲液提取液1 0 m l ，研磨成匀浆，用二层纱布过滤，清液用 8 0 0 0 x g ( 约8 5 0 0 r p m ) 冷冻离心1 5 分钟，得到的上清液即酶的初提液，整个过程在4 下进行。 2 标准曲线的制作 制作标准曲线的r 一谷氨酰基羟( r - g l u t a m y h y d r o x a m a t e ) 用量一般为卜2 m m 之 间，按测酶的反应液总量定容，加入i m l f e c l ，试剂，在5 4 0 n m 处测定吸光度，绘制 标准曲线。 3 谷氨酰氨合成酶活性的测定 反应液的组成如下：0 6 m l 眯唑一盐酸缓冲液( o 2 5 m ，p h 7 0 ) ，0 4 m l0 3 m 谷氨 酸钠0 ，4 m i0 3 m mh t p 二钠盐溶液，0 。2 m 1 0 5 l d m g s o , ，1 2 m i 酶液。反应液在2 5 水 溶液中保温5 分钟，加入0 2 m l 羟胺试剂，以开始反应，在2 5 c 水浴中再保温1 5 分 钟，加入i m l f e c l ，试剂终止反应。混合液在5 0 0 0 g ( 约5 0 0 0 r p m ) 离心1 0 分钟， 上清液在5 4 0 n m 处测定吸光度。空白加酶液前加入f e c i 。试剂。 2 3 3 谷氨酸合成酶( 删) 的测定方法 籽粒g o g a t 活性参照王小纯f l o o 的方法进行测定，以每分钟反应混合液减少 1um o ln a d h 所需的酶量定义为一个酶活力单位。 粗酶液的提取同g s 。反应混合液包括0 4 m l2 0 m m o l l 的l 一谷氨酰胺，0 5 m l 2 0 1 n o l l 的a 一酮戊二酸，0 i m ll o m m o l l 的k c i ，0 2 m l3 r 啪o l ln a d h 和0 3 m l 酶 液，总体积3 o m l ，不足部分用2 5 m o l l 的t r i s h c l 缓冲液( p h 7 6 ) 补足( 1 5 m 1 ) 。 反应启动后，用7 5 2 紫外可见分光光度计于3 4 0 n m 处每3 0 s 测定1 个消光值，连续测 定1 1 次，取光密度稳定减小的一段来衡量活性。个g o g a t 活性单位定义为在该反 应条件下，每分钟反应混合液减少l u m o l n a d h 为一个酶活性单位。 2 3 4 游离氨基酸总量的测定m l 1 样品处理：按上述韧皮部汁液的收集方法进行韧皮部汁液的收集。 2 制作标准曲线 取6 支2 0 c m 3 刻度试管，按下表加入各试剂。加完试剂后，混均，盖上玻璃球塞， 置沸水浴中加热1 5 分钟，然后取出放在冷水浴中，摇动冷却，使加热时形成的红色 逐渐被空气氧化而退色，直到溶液呈蓝紫色时。用6 0 乙醇定容至2 0 c m 3 ，摇匀，于 5 7 0 n m 下测定消光值，制定标准曲线。 表2 2 试剂量 t a b l e 2 2a m o u n to fr e a g e n t 3 样品中游离氨基酸含量测定 吸取样品滤液1 c m 3 ，加蒸馏水l c 一，水合茚三酮3 1 c m 3 ，抗坏血酸0 1 c 一，同标 1 6 准曲线方法显色、比色。根据吸光度值在标准曲线上查得样品液的含氮量。 4 结果计算 c = b v 。x 1 0 0 a w 、 式中：c ：l o o g 鲜材料中游离氨基酸含量( m g l o o g 鲜样) ； b ：查标准曲线值( m g c m 由u g c m 3 0 0 0 1 而来) ； v 。：样品提取液稀释总体积( c m 3 ) ； a ：测定所取滤液体积( c m 3 ) ； w ：样品重。 2 3 5 谷氨酰胺含量测定方法【1 0 l 】 i 展开采用新华3 号滤纸，每个样品点样l u l ，在室温下用不饱和法展开，展开 剂用甲醇一水( 体积比4 ：1 ) 上行法展开。 2 定量称取一定量的谷氨酰胺标准样品，配成1 、1 5 、2 o 、2 5 、3 o 等几 种不同质量浓度的溶液，每种溶液点样l u l ，发酵液经离心后，取其上清液点样l u l ， 展析完毕用热风吹于滤纸，喷上0 5 的茚三酮无水乙醇溶液，1 0 5 烘干5 m i n ，滤纸 上立即出现紫红色的氨基酸斑点，剪下氨基酸斑点。用硫酸铜乙醇溶液浸泡3 0 m i n ， 然后在5 1 0 h m 处测定光密度，从标准曲线上可求得韧皮部汁液中谷氨酰胺的含量。 试验所得数据均用e x c e l 和s p s s 专业版统计软件进行处理。 第三章结果与分析 一、不同品种油菜生长后期氮素再利用关键酶活性研究 许多研究表明，多数一次结实植物叶片、茎和生殖器官( 如颖片) 中的氮素再分 配效率大于6 5 ，即使生长后期土壤氮素供应充足，籽粒中氮至少有5 0 来自营养 器官。在此过程中蛋白水解酶、g s 和g o g a t 起关键性的转化和调节作用。蛋白水 解酶的活性直接影响氮再利用代谢的第一步反应( 氮素的活化) 。降解后的氨基酸与 氨结合通过g s 的作用形成可以在韧皮部大量运输的谷氨酰胺( g i n ) 。g o g a t 则可 以使运输到子粒( 果实) 的酰胺类物质转化成氨基酸代谢的中心物质谷氨酸【】”】， 从而可以进一步形成籽粒蛋白质。水稻的研究结果表明，蛋白水解酶活性在生殖生长 后期差异大，高蛋白品种的酶活性明显高于低蛋白品种【1 0 3 l ；随着叶片的衰老g s 2 活 性也急剧下斟1 0 4 1 ，而集中分布在维管束组织伴胞细胞中的g s l 一活性仍然较强【1 0 5 】， 想必衰老器官氮素的重新分配与g s l 的活性有关。但是，以上研究大部分是以禾谷 类作物为材料进行的，迄今为止还没有油料作物的研究结果。因此，本试验以油菜为 材料，研究了花后一段时期内蛋白水解酶、g s 和g o g a t 活性及韧皮部汁液可溶性 糖、游离氨基酸和l 谷氨酰胺含量的变化趋势。以期深入揭示油菜生长后期氮素的 转运动态。 1 蛋白水解酶活性 s i m p s o n 等以花后1 5 天的小麦植株为材料，研究氮素活化再分配情况表明，大分 子含氮物质首先分解成可在韧皮部运输的各种小分子含氮化合物，才能运输到籽粒 ( 果实) 中去，在此过程中蛋白水解酶起到关键性的作用。花后不同时期油菜功能叶 蛋白水解酶的活性的变化情况如图3 1 所示。由图3 1 可以看出，各测定时期两个油 菜品种功能叶蛋白水解酶活性基本上没有差异，说明两个品种氮素的活化能力相近， 在氮素的活化转运再利用的品种间差异方面，蛋白水解酶的贡献较小。 随着生育期的进程蛋白水解酶活性虽然有所波动，但总体上呈下降趋势，说明油 菜蛋白水解酶的活性随着植株的衰老而减弱。且有关于几个水稻品种关键酶活性的比 较研究结果表明：水稻功能叶蛋白水解酶活性在整个生育期大多呈现先升高后降低的 趋势。本研究结果呈现了同样的趋势。最后一次测定与第一次测定时相比，7 4 2 下降 了4 1 9 ，汇油5 0 下降了3 1 0 9 6 ，这种时强时弱的蛋白水解酶活性有利于缓解生长后 期氮素转运与叶片的代谢过程酶蛋白需求之间的矛盾。 4 一，4 - 74 - 1 l4 - 1 44 - 1 74 - 2 0 4 - 2 4 测定日期 圈3 i 蛋白水解酶活性的变化趋势 f i g u r e 3 1 t r e n d s o f t h e p r o t c i n a c t i v e 2 g s 活性的变化趋势 比较两个品种的g s 活性表明( 图3 2 ) ，角果形成前期( 从4 月5 日到4 月l l 曰) 7 4 9 的平均g s 活性高于汇油5 0 ( 3 4 0 9 6 ) ；角果形成后期( 从4 月1 4 日到4 月 2 4 日) 汇油5 0 的平均g s 酶活性高于7 4 2 ( 2 3 7 ) 。 与蛋白水解酶活性的变化趋势不同。g s 活性呈先下降后增强最后又有下降的变化 趋势。角果形成前期( 从4 月5 日到4 月1 1 日) ，7 4 2 和汇油5 0 分别下降了4 3 6 和2 8 0 9 6 ；测定时期内g s 最高活性出现在4 月1 7 日，7 4 2 和汇油5 0 分别为2 9 1 和 3 2 0 。角果形成后期( 4 月1 7 日到4 月2 4 日) ，两个品种g s 活性又分别下降了5 lo 和5 4 5 。观察整个测定期内的g s 活性来看，7 4 2 和汇油5 0 分别减弱了5 1 9 和3 1 6 。 4 0 3 5 3 0 芒 曼2 5 藿2 0 。1 5 l o 5 4 - 54 - 74 - 1 14 - 1 44 1 74 - 2 0 4 - 拍铡定日期 图3 2g s 活性的变化趋势 f i g u r e 3 2 t r e a d so f t h eg sa c t i v e 植物体内的谷氨酰胺和天冬酰胺都是重要的氮素运输形态，与氨基酸相比它们的 n c 较高，可缓解碳架供应不足“嘲。此外，谷氨酰胺在氮素代谢中成为多种含氮化合 物( 包括天冬酰胺) 合成的前体物质。因此，谷氨酰胺合成酶活性会影响到植株体内 氨基酸和蛋白质的代谢。测定前期g s 活性高，有利于更多的氮素以谷氨酰胺的形式 1 9 暑n)、掣蜒嚣琏*皿觏 运出，及时满足籽粒形成初期酶蛋白形成所需要的氮素【。 3 g o g a t 活性的变化趋势 籽粒g o g a t 活性的变化动态如图3 3 所示。由图3 ，3 可以看出品种间差异。 试验