（药理学专业论文）五味子乙素抑制uvb对hacat、fb细胞的损伤及机制研究.pdf

附表6 9讨j 沧7 7结论8 3参考文献8 4综述。9 0致谢9 6个人简历9 7中文摘要五味子乙素抑制u v b 对皮肤细胞的损伤及机制研究摘要五味子乙素( s c h i s a n d r i nb ，s c h b ) 是从传统中药北五味子中提取获得。已有研究发现它可以清除肝细胞中的自由基及脂质过氧化物，并可提高肝细胞中抗氧化物酶的表达，但它在皮肤紫外防护的研究中国内外均未见报道。本实验以五味子乙素为研究对象，探讨其抑制u v b 对皮肤细胞的损伤及作用机制。目的：探讨s c h b 抑制u v b 对h a c a t 、f b 细胞的损伤，并初步研究其保护机制。方法：1体外u v b 损伤模型制作及药物保护作用的测定：实验设计分为5 组：空白组、u v b 照射组、u v b 照射+ 不同浓度的s c h b ( o 1 肛m 0 1 l 1o 岬o l l ) 。以m t t 测定细胞生存率。2测定s c h b 对u v b 损伤模型中s o d ( 超氧化物歧化酶) 、g s h p x ( 谷胱甘肽过氧化物酶) 与m d a ( 丙二醛) 的含量变化3测定s c h b 对a 3 7 5 细胞中酪氨酸酶及黑色素的含量变化。4测定s c h b 对u v b 损伤模型中r o s 的变化及对u v b 损伤模型的形态观察。5测定s c h b 对u v b 损伤模型中p 5 3 、b a x 、p 2 l 、c a s p a s e 3 、c o x 2 、m m p l 、i l 1 0 、i l 1 ，t n f - am r n a 的表达。6免疫组化法观察不同浓度s c h b 对u v b 损伤模型中c o x 2 蛋白表达。7w e s t e m - b l o t 法检测不同浓度s c h b 对u v b 损伤模型中c o l l a 蛋白表达的影响。结果：ls c h b 对u v b 损伤模型的保护：经m t t 法检测发现适量紫外线辐射对h a c a t ，f b 细胞的正常生理功能无影响，但当紫外线照射强度达到一定强度后，细胞的生存率明显降低，并随着照射强度的增加而减小。根据照射强度和细胞生存率，选定照射强度为3 0 m j c m 2 建立u v b 损伤模型。研究发现s c h b 抑制了u v b 对中文摘要h a c a t 、f b 细胞的损伤，与对照组相比，具有显著性差异。2s c h b 对u v b 损伤模型中的抗氧化酶s o d ，g s h p x 及脂质过氧化物m d a 的影响采用酶化学法测定u v b 损伤模型中的抗氧化物酶s o d ，g s h p x 及脂质过氧化物m d a 的变化。结果显示s c h b 可升高u v b 损伤模型中的抗氧化物酶含量，降低其脂质过氧化物m d a 的含量，与对照组相比，差异有统计学意义。3s c h b 对a 3 7 5 细胞中酪氨酸酶及黑色素的影响利用n a o h 法测定s c h b 对a 3 7 5 细胞中酪氨酸酶含量，结果表明s c h b可降低a 3 7 5 细胞中酪氨酸酶含量，测定s c h b 对a 3 7 5 细胞黑色素生成，结果表明s c h b 可降低a 3 7 5 细胞中黑色素的生成，与对照组相比，差异有统计学意义。4s c h b 对u v b 损伤模型中r o s 的变化及其对u v b 损伤模型的形态变化用d c f h 。d a 测定s c h b 对u v b 损伤模型中r o s 的变化，结果表明s c h b可抑制u v b 损伤模型中r o s 的增多，且r o s 生成量随s c h b 浓度的增大而减少。将d c f h d a 作用于u v b 损伤模型，通过激光共聚焦观察u 厂b 损伤模型细胞荧光变化，结果表明s c h b 可降低u v b 损伤模型中电子的外泄，与对照组相比，差异有统计学意义。5s c h b 对u v b 损伤模型中p 5 3 、b a x 、p 2 1 、c a s p a s e 3 、c o x 2 、m m p 1 ，i l 1 0 、i l 一6 、i l 18 ，t n f am r n a 的影响用i m p c r 测定s c h b 对u v b 损伤模型中p 5 3 、b a x 、p 2 1 、c a s p a s e 3 、c o x 2 、m m p 1 ，i l 1 0 、i l 6 、i l 1 8 ，t n f am r n a 的变化，结果表明s c h b对u v b 损伤模型中p 2 l 表达影响不大，与对照组相比，差异无统计学意义。s c h b 可降低u v b 损伤模型中p 5 3 、c a s p a s e 3 、c o x 一2 、m m p 1 、i l 6 、i l 1 8 、i l 1 0 ，t n f - am i 矾a 表达，且具有一定的浓度依赖性，与对照组相比，差异有统计学意义。6w s t e m - b l o t 和免疫组化法测定s c h b 对u v b 损伤模型中前胶原的影响通过w s t e m _ b l o t 和免疫组化法观察测定s c h b 对u v b 损伤模型中前胶含量的变化，s c h b 对u v b 损伤模型中前胶原的变化，结果表明s c h b 可升高u v b 损伤模型中前胶原含量，且随着浓度的增高而升高，与对照组相比，差异有统计学意义。中文摘要结论：s c h b 在体外可以抑制u v b 对h a c a t ，f b 细胞的氧化损伤，提高u v b 损伤模型中抗氧化物酶s o d ，g s h p x 的含量，降低脂质过氧化物m d a 的产生，减少u v b 损伤模型中r o s 含量，可有效的抑制紫外线损伤。s c h b 降低了u v b 损伤模型中凋亡基因及炎症基因的表达，如降低了p 5 3 ，c a s p a s e 3 ，b a xm r n a 的表达，抑制了i l 6 ，c o x 2 ，t n f a ，i l 1 8 等炎症基因的表达，还降低了基质金属蛋白酶m m p 1 的表达，但对p 2 1m r n a 无影响。s c h b 可抑制u v b 损伤模型中c o x 2 蛋白表达及对前胶原的降解。因此，s c h b 有望开发为一个高效的抗氧化剂和紫外防护剂，可广泛的应用于紫外防护药物和化妆品中，为人类提供一个天然的紫外防护伞。关键词：s c h b ；c 似一2 ：m m p l ；u v b ；r o s ；光老化p r o t e c t i v ee f i e c to fs c h i z a n d r i nba g a i n s to x i d a t i v ed a m a g eo fu v bi r r a d i a t e ds “nc e l l sa n di t sm o i e c u l a rm e c h a n i s ma b s t r a c to b i e c t i v e ：s c h i z a n d r i nbe x t r a c t 丘i o ms c h i s a n d r ac h i n e i s i s ( t u r c z ) b a i l ls h o we x c e l l e n ta c t i v i t yi nc l e a n i n gf r e er a d i c a l s ，a n t i 一1 i p i do v e r o x i d a t i o n ，a n de l e v a t i n ga n t i o x i d a n te n z y m e ，a n dt h ea b i l i t yo fa m i o x i d a mm o r eb e t t e rt a m i ne ，w h i c hw e r er e p o r t e di nh e p a t i cc e l l s a n do nt h i sp r o p e r 吼t h em o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n o l o g ym e t h o d sw e r ea p p l i e dt ot e s ta n da n a l y s i st h ea n t i o x i d a j l ta b i l i t yo fs c h i z a n d r i nb t h ep h o t o p r o t e c t i o ne 彘c to fs c h i z a n d r i nbo ns k i nc e l l sa g a i n s to x i d a t i v ed a m a g eo fu v bi n 。a d i a t e ds k i nc e l l sa n di t sm o l e c u l 2 u rm e c h a n i s mi sn o td e f i n e d t h i sp a p e rh a ss t u d i e dt h ea b i l i t ) ，o fa n t i o x i d a n t ，p h o t o p r o t e c t i o no ns k i nc e l l sa n di t sm o l e c u l a rm e c h a n i s m m e t h o d s ：1c e l lc u l t u r e ，u v bi r r a d i a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fc e l lv i a b 订i t y2m e a s u r e m e n to fs o d ，g s h - p xa n dm d ar e l e a s e3d e t e r m i n a t i o no ft y r o s i n a s ea c t i v i t ya n dm e l a n o c h r o m es e c r e t i o n4d e t e c t i o no fi n t r a c e l l u l a rr o sa n dc o n f o c a lm i c r o s c o p y5m e a s u r e m e n to fp 5 3 ，p 2 1 ，p c n a ，c o x - 2 ，i l 一1 0 ，i l 一6 ，i l 一1 8 ，t n 仁a ，m m p 。1 ，c a s p a s e 一3 ，b a xe x p r e s s i o n6w 色s t e m - b l o tr e s u l t s ：1i n h i b i t o 叫e f f e c t so fs c h i z a n d r i nbo nv i a b i l i t yo fu v be x p o s e ds k i nc e l l si nt h ee x p e r i m e n t ，t h r e ec e l l s l i n e sw e r ec h o s e nt od e t e m l i n et h ea n t i o x i d a n ta c t i v i “o fs c h i z a n d r i nb t h ei m m o r t a l i z e dh u m a nk e r a t i n o c y t ec e l ll i n eh a c a tw a sp u r c h a s e df r o mk e y g e nb i o t e c h n o l o g y h u m a nd e n n a lf i b r o b l a s t sa n dm e l a n o m ac e uw e r eo b t a i n e d 仔o mt h ec h i n au n i o nm e d i c a lu n i v e r s i t vo fb l o o di n s t i t u t e a l lc e l l sw e r ec u l t u r e di nd u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i ac o n t a i n i n g1o f b s ，2 m m o l lg l u t 锄i n e ，1o o u 噍n 1p e n i c i l l i na n dl o o u 2 细ls t r e p t o m y c i na t3 7 h u m i d 讯e da t m o s p h e r eo f5 c 0 2i nd英文摘要a l r s c h i z a n d r i nbh a se x c e l l e n tp e r f o m l a n c ei np r o t e c t i n gf 两mo x i d a t i v ed a m a g et oh a c a tc e l l sa n df bc e l l sb ym t ta s s a y w h e nt h eu v bi 1 1 r a d i a t i o ni sa t3o m j c m 2 ，t h ec e l lv i a b i l i t yw a sr e d u c e d3o ，b u ts c h i z a n d r i nbw a sa d d e dt ou v b e x p o s e dk e r a t i n o c ”e sa n df i b r o b l a s t s c a n ，t h ev i a b i l i 够w a si n c r e a s e d15 t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts c h i z a n d r i nbh a se x c e l l e n ta n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y t h ev i a b i l i t ) ，w a sd o s e d e p e n d e n t l ye m l a n c e da n do b t a i n e dt h ei n h i b i t i o ni nu v b j n d u c e ds k i nc e l l s 2m e a s u r e m e n to fs o d ，g s h p xa n d 匝) ar e l e a s et h es u p e m a t a n ta n di n t r a c e l l u l a rs o d ，g s h - p xa n dm d al e v e lw a sm e a s u r e db ya s s yk i t ( n a n j i n gj i a n c h e n gb i o e n g i n e e r i n gi n s t i t u t e ) t h er e s u l ts h o w e dt h a ts c h i z a n d r i nbc a ni n c r e a s et h es o d ，g s h - p xa n dd e c r e a s et h em d a i ti n d i c a t e dt h a ts c h i z a n d r i nbe l e v a t e dt h ea n t i - o x i d a n ta b i l i t yw h e nt h eu v bi 1 1 r a d i a t i o na t3o m j c m 2 3m e a s u r e m e n to ft h et y r o s i n a s ea c t i v i t ya n dm e l a n o c h r o m es e c r e t i o nt h er e s u l ts h o w st h ei n h i b i t o 巧e f - f e c t so fs c h i z a n d r i nbo nt y r o s i n a s ea c t i v i t va n dm e l a n o c h r o m es e c r e t i o ni nu v b i n d u c e dh u m a nd e n n a l6 b r o b l a s t s i ts u g g e s t e dt h a ts c h i z a n d r i nbh a sp o s s e st h ef u n c t i o no fw h i t e n i n g 4d e t e c t i o no fi n t r a c e l l u l a rr o sa n dc o n f o c a lm i c r o s c o p yw es e l e c t e da 3 7 5 c e l l s 、v h i c hs e e d e di nd m e mi ne x p o n e n t i a lp h a s eo fg r o w t h ，a d ds c h i z a n d r i nb ，t h e nk e e p i n go nc u l t i v a t i n gt h ea 37 5c e l l sf o r2 4 h ，t h e nd e t e c t e db y4 0 5 n m e a c he x p e r i m e n tw a sr e p e a t e da tl e a s tt h r e et i m e s t oa v o i dd i r e c tp h o t o o x i d a t i o no ft h ef l u o r e s c e md y e ，c e l l sw e r ef i r s t仃e a t e dw i t hu v bi 仃a d i a t i o na n dt h e nl o a d e dw i t ht h ed y e i nb r i e eh a c a tc e l l sw e r ei r r a d i a t e dw i t hu v b ( 3 0 m j c m z ) i nt h ep r e s e n c eo ra b s e n c eo fs c h i z a n d r i nba n dt h e nl o a d e dw i t hd c f h d a ( 5u m ) t h ei n t e n s i t yo fd c ff l u o r e s c e n c ew a sm e a s u r e du s i n gas p e c t r o n u o r o p h o t o m e t e r e a c he x p e r i m e n tw a sr e p e a t e da tl e a s tt h r e et i m e s t h ei n t e n s i t yo fd c ff l u o r e s c e n c ew a sm e a s u r e du s i n gas p e c t r o f l u o r o p h o t o m e t e r t h er e s u l ts h o w st h a ts c h i z a n d r i nbc a nr e d u c et h e英文摘墨u c e dh u m a nd e m a lf i b r o b l a s t s i n t e n s i t yo fd c fq u o r e s c e n c ei nu v b i n dt h ef i g u r es h o w st h a tt h ei n t e n s i t yo fd c ff l u o r e s c e n c ei nu v b e x p o s e dh a c a tc e l lw a sr e d u c e d t h ei n h i b i t o r yw a se n h a n c e dw i t hd o s e d e p e n d e n t l y 5t h ee x p r e s s i o no fp 53m r n a ，c a s p a s e 一3m r n a ，b a xm r n a ，p 21m i a ，b c l 2m r n aa n dm d r - 1m r n ae x p r e s s i o no fp 5 3m r n a ，c a s p a s e 一3m r n a b a xm r n a ，p 21m r n a ，i l 1m r n a ，i l 6m r n a i l 1 0m r n a ，i l 1 8m r n a ，t n f - am r n a ，c o x 2m i 之n a ，m m p lm r n ai nu v b 。i n d u c e dh a c a tw a sm e a s u r e db yr ：r - p c r t h er e s u l ts h o w e dt h a tp 5 3m r n a ，c a s p a s e 一3m r n a ，b a xm r n a ，p 21m r n a ，i l 1m r n a ，i l 6m r n a ，i l 。1 0m r n a ，i l 1 8m r n a ，t n o am r n a ，c o x 一2m r n a ，m m p 1m r n al e v e l sd e c r e a s e d 6i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n 2a n dw e s t e m b l o tt h ee x p e r i m e n t ss h o w e ds c h i z a n d r i nbw a sa s s o c i a t e dw i t ht h ed e c r e a s e do fc o x 一2a n dt h ei n c r e a s e do f 够p eip r o c 0 1 1 a g e n c o n c l u s i o n s ：t h e 玎e p o r ti st h ef j r s tt op r o v i d ee v i d e n c et h a ts c h i z a n d r i nbc a nc l e a nt h ee er a d i c a l sd e r i v e d 行o mu v b i 1 1 r a d i a t e dh a c a ta n di n c r e a s et h ea n t i o x i d a n te n z y m e t h ea n t i o x i d a n te n z y m ep l a y sa ni m p o r t a l l tr o l ei nt h ea n t i o x i d a n td a m a g e t h ec e i lv i a b i l i t yi so b v i o u s i ya u g m e n t a t i o n t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tp 53m r n a ，c a s p a s e 一3m r n a ，b a xm i 之n a ，p 21m i n a ，i l 一1m r n a ，i l 6m r n a ，i l 1 0m i 之n a ，i l 1 8m r n a ，t n f am r n a ，c o x 2m i 之n a m m p lm r n al e v e l sd e c r e a s e dc o m p a r ew i mc o n t r o lg r o u p s c h i z a n d r i nbp r e v e n t e dc o l l a g e nd e g r a d a t i o nb yb l o c k i n gn 御、伊sp r o d u c t i o ni nu v b i n d u c e df i r b l a s t s i tc a l lm o d u l a t et h ec o x 2s e c r e t i o n s c h i z a n d r i nba t t e n u a t e dt h eu v b 。i n d u c e dt o x i c i t yo fh a c a ta n dh u m a nd e m a lf i b r o b l a s t s f u i r t h e rs t u d i e sn e e d e dt oc l a “句t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mi n v o l v e di ne f f e c t so nu v b e x p o s e dc e l 】s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts c h i z a n d r i nbp o s s e s se x c e l l e n ta n t i o x i d a n t t h ed a t e sp r o v i d es t r o n ge v i d e n c ef o rt h ev a l u eo fs c h i z a n d r i nba sa na n t i o x i d a n ta n da n t i i n f l a m m a t o r ya g e n t k e yw o r d s ：s c h i z a n d r i nb ；i t 0 s ；c o x 一2 ；u 、，b ；m n l p l ，p h o t o a g i n g 6研究论文u v b 照射h a c a t 、f b 保护作用及机制研究- - j l刖蟊近年来，由于大气臭氧层不断的遭到破坏，致使太阳辐照强度不断增强，其中紫外线辐射增强尤为明显，对人们的影响将越来越大。长期在户外工作的人群，长期的暴露在目光下，过多接触紫外线，造成了皮肤的氧化损伤，导致皮肤发生目光性皮炎，光老化、皮肤癌变、免疫抑制等一系列疾病【l - 4 】。随着国际上“回归大自然”呼声的日益增高，l a n c o m e ( 兰蔻) 、l o r e a l ( 欧莱雅) 等国际大品牌不断研发天然产物、或以天然产物为先导化合物衍生的新型防护剂，他们的防护用品在国际市场上占主导地位，并拥有大量的专利。线按波长可分为三种：长波紫外线( 波长 3 2 0 n m ) 、中波紫外线( 2 9 0 3 2 0 n m ) 和短波紫外线( 波长 9 7 ，由本院生药学教研室陈虹教授研究室提供，体外实验用d m s 0 配制。1 2 生化试剂d m e m r p m i 1 6 4 0天润善达公司产品胎牛血清( f b s )中国医学科学院血研所科技公司溴化四氮唑蓝( 3 - ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l - 2 一y 1 ) 一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ，m t t )si g m a 公司s i m ( s u l f o r h o d a m i n eb ，硫化罗丹明)s i g m a 公司十二烷基磺酸钠( s d s )s i g m a 公司过硫酸胺( a m m o l o m i u mp e r s u l f a t e ，a p s )s i g m a 公司聚丙烯酰胺( a c 叫i 踟i d e )s i g m a 公司研究论文1 w e e t l 2 0h o e c h s t3 3 3 4 2e b ( 溴化乙啶)d t t ( 二硫苏糖醇)考马斯亮兰g 2 5 0t r i t o nx 1 0 0苯甲基磺酰氟( p m s f )琼脂糖( a g a r o s e )1 、r i sb a s e二甲基亚砜( d m s o )三氯乙酸( t c a )碳酸氢钠二乙胺四乙酸( e d t a )氯化钠氯化镁硫酸铵氯化锌氯化钾甲醇乙醇乙酸盐酸甘油甘氨酸( 层析纯)二甲苯溴芬兰g i e m s a 染色磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 )磷酸氢二钠购1 1 r i z o lr ，r - p c r 试剂盒s i g m a 公司s i g m a 公司s i g m a 公司鼎国生物技术有限责任公司四甲基乙二胺f l u k a 公司产品香港f a r c 0 公司宝灵曼公司进口产品p r o m e g a 公司产品g i b e c o 公司g i b e c o 公司进口分装北京化学试剂公司产品北京化学试剂公司产品上海五联化工厂生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产天津市科锐思精细化工有限公司生产北京欣经科技术有限公司分装中国人民解放军9 0 6 6 工厂生产上海试剂三厂提供s e r v a 公司北京益利精细化学品有限公司北京市红星化工厂p r o m e g a 公司生产大连宝生物资源有限公司生产研究论文4 x 蛋白上样缓冲液6 x d n a 上样缓冲液总超氧化物歧化酶( s o d )丙二醛试剂盒( m d a )谷胱甘肽过氧化物试剂盒( g s h p x )其他常规试剂及溶剂均由北京化工厂、试剂研究所提供。p c r 引物p a c t i n上海生工生物技术有限公司s o l a r b i o 公司生产s o l a r b i o 公司生产南京建成生物工程研究所南京建成生物工程研究所南京建成生物工程研究所北京双环化学试剂厂及北京化学s e n s e ：5 g t gg g gc g c c c ca g gc a cc a 3 a n t i s e n s e ：5 c t tc c tt a a t g tc a cg c ac g at t tc 3 扩增片段：5 4 0 b pm m p 1上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 。g a tt c cc a ag c ca t at a tg g ac g tt c c 3 a n t i s e n s e ：5 一t t gg a at t cc g ga c t t c at c tc t gt g g 3 扩增片段：2 5 6 b pc a s p a s e 一3上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 一g t gg a at t ga t gc g tg a tg 一3 a n t i s e n s e ：5 g g aa t c t g tt t c1 7 t tg c at g 3 扩增片段：4 9 9 b pp 5 3上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 g c cc cc c tc a gc ac t t a t cc g 3 a n t i s e n s e ：5 t c cc a g g a ca g gc a ca a ac a cg c 3 扩增片段：2 7 4b pp 2 1上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 a t ta g c a g cg g aa c aa g ga g t c a ga c at 3 a n t i s e n s e ：5 c t gt g aa a g a c ac a g a a c a g ta c a g g gt 3 扩增片段：3 4 6 b pb a x 上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 c g tc c ac c aa g aa g c t g ag c g 3 a n t i s e n s e ：5 a g ca c t c c cg c ca c aa a ga t g 3 1 2研究论文扩增片段：3 8 2 b pc o x 一2 上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 t t ca a at g ag a tt g tg g g a a aa t tg c t - 3 a n t i s e n s e ：5 a g at c at c tc t gc c tg a gt a tc t t 3 扩增片段：3 5 8 b pt n f a 上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 。一c c cg a gt g ac a ag c ct g ta g 3 a n t i s e n s e ：5 c t ca g a a a ga g ca t cg a ta t g 3 扩增片段：3 5 6 b pi l 一6 上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 一c t ac a t t t gc c ga a ga g c 3 a n t i s e n s e ：5 c t cg a c g g ca t ct c ag c c 3 扩增片段：4 5 9 b pi l 一1 8 上海生工生物技术有限公司s e n s e ：5 一a g ga a ta a ag a tg g c t g ct g aa c 一3 a n t i s e n s e ：5 g c tc a c c a c a a cc t ct a c c t cc 3 扩增片段：3 5 8 b p1 3 溶液配制g i e m s a 染液：g i e m s a 粉1 9 于研钵内与少许甘油混合研磨至无颗粒( 共6 6 m l ) ，再加甘油于5 6 温育2 小时，最后加入6 6 m l 甲醇混匀，置棕色瓶室温存放l p b s 缓冲液：n a c l8 9 ；k c lo 2 9 ；n a 2 h p 0 4 。1 2 h 2 02 8 8 9 ；k h 2 p 0 4o 2 9 ，加三蒸水定容至l o o o m l ，调整p h7 2 7 4s o r e n s e n 缓冲液：n a 2 肿0 4 。12 h 2 01 6 6 9 ；i 2 p 0 4o 2 7 9 ，溶于1o o m l三蒸水，p h7 2p e m 缓冲液溶液：p i p e s8 0 m m o l l ，e g t al m m o l l ，m g c l 2o 5 m m o l l ，用n a o h 溶液调至p h6 9p i 染液：p i 粉末5 m g ，溶于l m l 三蒸水p e m p 缓冲液：含4 聚乙二醇的p e m 溶液p e m d 溶液：含l 二甲基亚砜的p e m 溶液h o c h e s t 3 3 3 4 2 染液：h o c h e s t 3 3 3 4 2 粉末2 m g ，溶于2 m l 三蒸水研究论丈缓冲甘油：甘油p b s ( 9 ：1 、) ，p h8 5t b e ( 1 ) 缓冲液：t r i sb a s e1o 7 8g ；硼酸5 5 0g ；e d t a o 7 4g ，溶于l o o o m l 三蒸水，p h 8 o3 0 丙烯酰胺：丙烯酰胺2 9 9 ；n ，n 亚甲基双丙烯酰胺1 9 ，溶于1o o m l 蒸馏水分离胶缓冲液：1 5 m o l lt r i s h c l ，p h 8 8浓缩胶缓冲液：1 o m o l lt r i s h c l ，p h 6 85 t r i s g l y c i n e 电泳缓冲液：t r i sb a s e ，u l t r a p u r e 3 0 3 9 ：g l y c i n e l 8 7 7g ；s d slg ，溶于1o o o m l 三蒸水1 m o l ld t t 贮存液：3 0 9 9d t t 溶于2 0 m lo 0 1 m o l l 乙酸钠溶液( p h5 2 ) ，过滤除菌分装，2 0 贮存1 0 m m o l lp m s f 贮存液：1 m l 异丙醇溶解1 7 4 m gp m s f ，2 0 贮存。1 0 过硫酸铵：过硫酸铵o 1 9 ，溶于1 m l 去离子水。4 保存，保存时间为一周l o s d s ( 十二烷基磺酸钠) ：s d s1 0 9 ，溶于1 0 0 m l 去离子水o 1 s d s ：s d so 1g ，溶于1 0 0 m l 去离子水细胞裂解液：1m o l lt r i s h c l ( p h8 o ) 2 5m l ；n a c lo 4 4 9 ；t r i t i o n x l o oo 5 m l ，去离子水补至5 0m l 。4 保存t b s t ：n a c l8 8 9 ；1 m o l l1 h s h c l ( p h 8 o ) 2 0m l ；t w e e n 2 0o 5m l ，去离子水补至1 0 0 0 m l 。4 保存转膜缓冲液：g l y c i n e2 9g ；t r i sb a s e ，u l t r a p u r e5 6g ；s d so 3 7g ；甲醇2 0 0m l ，去离子水补至1 0 0 0 札考马斯亮蓝g 2 5 0 染液：考马斯亮蓝g 2 5 0 粉末o 0 5g ；9 5 乙醇2 5m l ：8 5 浓磷酸5 0m l ，去离子水定容至5 0 0m l1 4 免疫试剂鼠多克隆抗体c o l l a 2 ( s c 1 6 6 8 6 5 ) ，c o x 2 ( s c 1 7 4 6 ) 【1 9 】，辣根过氧化酶二抗购白天津均尧联赢生物制品公司d a bk i t ( 2 0 ) 试剂盒购自北京中山生物技术有限公司1 5 细胞株人永生化角质细胞h a c a t 细胞购自凯基生物技术有限公司，人黑色素瘤细胞a 3 7 5 等由中国医学科学院协和医科大学药物研究所。人疤痕成1 4纤维细胞( h y p e r t r o p h i cs c a r 舶r o b l a s t ，f b ) 由武警医学院生药教研室从人新鲜疤痕组织中分离并进行原代培养获得1 7 主要仪器s a n y 0m c 0 1 7 5 型c 0 2 培养箱n a p c 0 公司j j t - 9 0 0 13 0 0 超净工作台北京半导体设备一厂o l y m p u si x 7 0 倒置显微镜日本0 1 y m p u s 公司t g l 16 g 冷冻离心机、常温离心机上海安亭科学仪器厂a d v e n t u r e r 万分之一电子天平o h a u s 公司m i l l i p o r e 纯水仪m i l l i p o r e 公司m o d e l 6 8 0 型酶标仪b 1 0 一r a dl s 一9 8 0 0 型液闪计数仪b e c l ( r i l a n旋涡混合器美国b o h e m i an y 公司e p s 5 0 0 4 0 0 型电泳仪p h a r h l a c i a 公司e c p 3 0 0 0 三恒电泳仪北京六一仪器厂d y y i i i 。4 0 c 型电转仪北京六一仪器厂水平电泳槽北京东方仪器厂垂直电泳槽北京六一仪器厂d s h z 3 0 0 多用途水浴恒温震荡器江苏太仓实验仪器厂h y 4 型调速多用震荡器常州国华电器有限公司l x l o o 手掌型离心机江苏海门市麒麟医用仪器厂w z 2 a 型微量震荡器北京海淀电子医疗仪器厂u v - 2 6 0 型紫外可见分光光度计s h i m a d z a 公司t r a n s i l l u m i n a t o ru v w h i t e2 0 2 0 d ，c o l ds p r i n g s 及k o d a k l 2 0 凝胶成像系统。c 一4 0 4 0 2 0 0 m 型0 1 y m p u s 数码相机，o l y m p u s 公司。c e l ll a bq u a n t as c 型流式细胞仪，b e c l a nc o u l t e r 公司，天津市肺癌研究所。2 实验方法2 1 细胞培养及u v b 模型制作人表皮角质永生化细胞h a c a t ，人成纤维细胞f b ，人黑色素瘤细胞a 3 7 5 。在d m e m 培养基中( 含1 0 胎牛血清，1 0 0 i m i ，青霉素、1 0 0 舭链霉素) 培养。研究论丈取对数生长期h a ca 1 、，f b 细胞，用2 5 胰蛋白酶消化，计数，细胞浓度为l 10 4 个，以1o o 止接种于9 6 孔板，等细胞融合到8 0 左右，用1 p b s 沈2 遍后，每孔留6 0 此冷p b s ，照射紫外线，照射强度= 紫外线强度照射时洲1 9 - 2 2 1 。2 2s c h b 体外抗u v b 作用的研究2 2 1 细胞培养h a ca t ，f b 细胞接种于含1 0 胎牛血清，1 0 0 u m l 青霉素、1 0 0 “m l链霉素的d m e m 培养基中，将培养瓶置于3 7 、5 c 0 2 饱和湿度培养箱培养，每1 2 天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁8 0 时，贴壁细胞用o 2 5 胰蛋白酶消化。2 2 1 1m t t 法测定s c h b 对h a c a l f b ，a 3 7 5 生长的影响( 1 ) 取对数生长期细胞接种于9 6 孔培养板内，每孔1 0 0 “l ( 含1 1 0 4 个细胞) ，置于3 7 ，5 c 0 2 温箱中培养。( 2 ) 次日，待细胞贴壁为8 0 左右，给药组加入含有不同浓度的s c h