嗅鞘细胞移植和复方丹参联合治疗脊髓损伤的研究.doc

嗅鞘细胞移植和复方丹参联合治疗脊髓损伤的研究 钟波肖红卫王素伟张爱莲 【摘要】目的探讨嗅鞘细胞移植和复方丹参联合应用治疗脊髓损伤的可行性，为临床治疗提供实验基础。方法 制备脊髓损伤大鼠模型，按治疗方法分为4组：空白对照组（Control）、复方丹参组（SM）、嗅鞘细胞移植组（OECs）、复方丹参联合嗅鞘细胞移植组（OECs+SM）。术后动态评价各组大鼠运动功能，术后12周取材进行免疫组化和横截面甲苯胺蓝染色评价轴突再生情况。结果OECs+SM组术后12周BBB评分显著高于其他3组（p0.01）；OECs+SM组（11.21.03）%NF-200阳性表达显著高于其他3组（p0.05）；OECs+SM组的轴突密度为（14359903）/mm2，显著高于其他3组，差异具有统计学意义（p0.05）。 结论单独使用OECs或SM，均可产生部分神经纤维的修复，但联合使用OECs和SM，两者可以产生协同作用，效果明显优于单独使用。 【关键词】嗅鞘细胞移植复方丹参脊髓损伤 doi：10.3969/j.issn.1671-332X.xx.12.006 脊髓损伤（SpinalCordInjury，SCI）是一种严重的临床常见疾病，多发生于交通事故及严重的创伤，可引起永久的瘫痪甚至死亡。SCI导致的截瘫处理及如何促进功能的恢复对临床医生来说仍是一项极大的挑战。在中枢神经系统继发性损害过程中，由于损伤组织缺血、缺氧的继发性病理改变，造成组织内氧自由基产生增加，清除能力下降导致氧自由基聚集。这种氧化应激（OxidativeStress）能诱导神经细胞凋亡1，是造成中枢损伤后继发性病理损害的主要机制之一。 细胞治疗可以补充SCI造成的细胞损失，且可促进功能的恢复。嗅鞘细胞（OlfactoryEensheathingCells，OECs）位于嗅球的外层，称为嗅觉神经层。当它由嗅上皮移行至嗅球时，同时将嗅神经进行了髓鞘包裹。移植到脊髓损伤部位后，OECs可以刺激受损的神经轴突再生，促进功能的恢复2，而丹参（SalviaMiltiorrhiza，SM）可有效清除脊髓损伤后血液和脊髓组织中的自由基3，改善神经纤维的修复环境。故笔者提出嗅鞘细胞移植和复方丹参联合使用治疗脊髓损伤的方法，并进行了初步研究，现报道如下。 1资料与方法 1.1OECs的分离、纯化和培养 分离：OECs于嗅球外部的两层细胞，将2.5月龄SD雄性大鼠用断头法处死，嗅球保存在冷冻的Hanks平衡盐溶液中，进行两次离心，做成含10%PBS的DMEM/F12培养基细胞悬浮液。将细胞用移液器吹打1520次，然后过200目细胞筛，制备单细胞悬液。根据OECs和成纤维细胞贴壁率不同进行OECs纯化：在培养12小时后，细胞悬液进行离心，加入20mol/l腺苷酸环化酶激活剂和20g/L牛脑垂体提取液（BovinePituitaryExtract，BPE），12小时后，上清液和悬浮细胞转移至另一个涂有Poly-L-Lysine的培养皿中。培养2天后，加入110-5mol/L的胞嘧啶-D-呋喃阿拉伯糖苷盐酸盐，培养24小时，PBS洗涤，含20mol/L腺苷酸环化酶激活剂和20g/LBPE的DMEM/F12培养基培养，2天更换1次。 1.2动物模型及分组 24只雄性SD大鼠随机分为4组：空白对照组（Control）、复方丹参组（SM）、嗅鞘细胞移植组（OECs）、复方丹参联合嗅鞘细胞移植组（OECs+SM），每组6只。5%水合氯醛（8ml/kg）腹腔注射麻醉，手术显微镜下于810胸椎水平行椎板切除，清除皮肤和肌肉，显露脊髓，用手术刀在胸9水平统一从右侧造成3/4的脊髓损伤模型。造模的成功与否用Rivilins斜板试验进行验证，将合格的模型动物纳入研究。 1.3治疗方法 SCI造模成功7天后，按分组注射不同内容物。空白对照组：仅行造模，不作嗅鞘细胞移植和复方丹参治疗，腹腔注射生理盐水5ml/次，2次/天，连续腹腔注射3周；复方丹参组：复方丹参注射液5ml/次，2次/天，腹腔注射共3周；嗅鞘细胞移植组：采用嗅鞘细胞移植，利用显微注射器在胸9水平由头端和尾端（相距约0.5mm）向损伤部位共注射5lOECs细胞悬液（1109/ml），深度约为2mm，注射完毕5分钟后拔出注射器；复方丹参联合嗅鞘细胞移植：嗅鞘移植移植同时并作腹腔丹参注射治疗3周。所有动物均饲养至造模后12周，取材。 1.4行为评估 在造模前、造模后1周及之后的每1周均由两名对分组不知情的研究者进行大鼠的Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分4，以评估其运动功能的恢复。 1.5免疫组化 造模12周后，将动物麻醉，开胸，主动脉插管，右心房切开，用pH=7.4的中性甲醛磷酸缓冲液灌注，当右心房溢出刺激性气味的液体2分钟后停止灌注。按造切口显露胸9平面，切取脊髓组织，标记损伤中心位置，用10%甲醛溶液4下浸泡24小时，含30%蔗糖的PBS浸泡过夜。以10m厚度冷冻切片，免疫组化法测定NF-200和S-100的含量，激光共聚焦扫描显微镜观察。 1.6横截面半薄切片甲苯胺蓝染色 上述灌注后，以2mm厚度取脊髓损伤中心横截面切片。PBS洗涤3次，每次5分钟，然后以1%四氧化锇溶液4下固定2小时。PBS再次洗涤3次，不同浓度酒精脱水