（分析化学专业论文）毛细管电泳—安培检测联用技术及其应用研究.pdf

华东师范大学2 0 0 6 年申请硬士学位论文 毛细管电泳一安培检测联用技术及其应用研究 摘要 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是近二十年来发展最快的分离分 析技术之一，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，进样量从微升 水平进入纳升水平。作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离 技术，其研究和应用涉及环境分析、药物分离、生化分析等几乎所有的分析领域。 极细的毛细管内径带来了很高的分离效能，但同时也给样品组分的检测带来困难 因此对检测技术相应提出了较高的要求，发展了许多类型的检测器，有光学、电 化学、质谱学检测器及化学发光等。电化学检测中的安培检测技术，具有比紫外 检测更高的灵敏度，且仪器简单、价格成本低、线性范围宽、操作简便，因而其 与毛细管电泳联用后在分析化学领域得到了广泛的研究和应用，研究对象大到生 命大分子，小到单细胞分析和无机离子分析。 与经典电泳相比，c e 克服了由于焦耳热引起的谱带展宽，柱效较低的缺点， 确保引入高的电场强度，改善分离质量。柱效高的可达每米几百万乃至几千万理 论板数以上。从效率、速度、用量和成本来说，c e 都显示了它的优势。但由于 毛细管电泳分析技术是近二十多年来才兴起的分析技术，而且安培检测同毛细管 电泳联用起步略晚于紫外、激光诱导荧光等检测技术，尽管其优势明显，在药物 分析、环境分析等领域还有许多空白，所以本文的目的是拓宽毛细管电泳安培 检测的应用范围。主要内容共分为四章： 第一章为绪论。在该章中综述了毛细管电泳的特点、分离模式及其理论基础、 联用检测器的介绍、进样技术和毛细管电泳研究现状，最后介绍了毛细管安培检 测的理论及进展。 第二章内容是毛细管电泳安培检测联用技术测定格列齐特原药中氨基杂环 和氮杂双环的应用研究。对原料药进行杂质含量分析是控制其纯度的一个非常重 要的方面。由于制备过程中的原因，格列齐特原料药中可能含有一些杂质。所以 本文建立可靠可行的分析方法，对其原药中的杂质进行检测，以达到质量控制的 嚣的。在最佳毛细管电泳分离条件和安培检测条件下，氨基杂环和氮杂双环可在 9 m i n 内完全分离，线性范围分别是1 o x1 旷1 o 1 0 3 m o l l 和2 0 1 0 “1 0 1 0 m o l l ，检测下限分别达到5 0 1 0 。7 m o l l 和1 0 1 0 。6 m o l 几，对格列齐特原料 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 药样品的测定得到了满意的结果。 第三章的内容是毛细管电泳安培检测联用测定复方中成药维c 银翘片的有 效成分对乙酰氨基酚( p a r a c e t a m 0 1 ) 、维生素c ( v i t a m i nc ) 、绿原酸( c h l o r o g e n i c a c i d ) 和咖啡酸( c a f f e i ca c i d ) 。探讨了电极电位、运行缓冲溶液、分离电压及进样 时间等对毛细管电泳分离安培检测的影响，得到了较为优化的测定条件。在最佳 毛细管电泳分离条件和安培检测条件下，四种物质可在2 2 m i n l 勾达到很好的分离， 在碳电极上也有较大的电流响应。检测下限达到5 0 1 0 。7 m o l l 和1 o x l 0 。6 m o l l 。 该法具有较好的重现性和灵敏度，为维c 银翘片的质量控制提供了准确、快速的 方法。 第四章内容是采用简单的c z e 分离模式，不加任何添加剂，在极端p h 值条件下 成功地分离了环境中硝基苯胺类化合物。研究了背景缓冲溶液、p h 值、分离电 压、温度及进样时间等因素对分离的影响，在选定的实验条件下1 5m i n l 勾实现了 3 种苯胺类化合物的分离，得到分析物的标准曲线、线性范围及加样回收率，同 时测定了2 种染料废水样品中被测物的含量。结果表明该方法快速，准确，重现性 好。 关键词：毛细管电泳，安培检测，格列齐特，硝基苯胺，结构异构体，极端p h 值 华表峤范大学2 0 0 6 年枣请硬士学鼗论文 s t u d y o nt e c h n i q u ea n da p p l i c a t i o no fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i so n eo f t h em o s ti m p o r t a n ta n dr a p i d l yg r o w i n g s e p a r a t i o nt e c h n i q u e si nr e c e n tt w e n t yy e a r s ，i ta b s o r b e dt h ev i r t u e so fb o t ht h e c o n v e n t i o n a le l e c t r o p h o r e s i sa n dm o d e mh i ；曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) h o w e v e r , t h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e ri sg r e a td e v e l o p e dt o t e n so f t h o u s a n d sa n de v e nm i l l i o n sa n dt h ev o l u m eo fs a m p l ei n j e c t i o nr e a c h e sn a n o m i l l i l i t e rl e v e li nc ea n a l y s i i nr e c e n ty e a r s ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) h a sb e e n e x t e n s i v e l ys t u d i e da n da p p l i e da sah i 曲l ye f f e c t i v ea n a l y t i c a lm e t h o di nm o d e m a n a l y s i s a n de x c e l l e n tp r o s p e c t so fc eh a v e b e e ns h o w ni n t h ef i e l d so f p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，b i o c h e m i c a la n a l y s i s ，f o o da n a l y s i s ，a n de n v i r o n m e n t a l a n a l y s i s i th a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sm u c hl o w e rs a m p l i n gv o l u m e c h e a p e r i n s t r u m e n t a t i o na n dh i g h e rs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y h o w e v e r , t h es m a l ls a m p l ei n j e c t i o n v o l u m ea n dv e r yt h i nc a p i l l a r yb r i n ga b o u td i f f i c u l t i e st od e t e c t i o n s t h ec o m m o n u s e dd e t e c t i o nm e t h o d sa r e u l t r a - v i o l e t ( u v ) ，l a s e r i n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l r f ) ，l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ，m a s ss p e c t r a ( m s ) b e c a u s ea m p e r o m e t r i cd e t e c t o r ( a d ) i sm o r es e n s f f i v et h a nu v - v i s i b l ed e t e c t o ra n dm u c hc h e a p e rt h a nl i fd e t e c t o r , i ti sp r e f e r r e dt oc o u p l ew i t hc ei nm a n ya n a l y s i sa r e a s t h eg o a lo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oa p p l yt h i sc e a dt e c h n i q u et or e s o l v es o m e a c t u a la n a l y t i c a lp r o b l e m si np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，e n v i r o n m e n t a la n a l y s i s t h e c o n t e n t so f t h ed i s s e r t a t i o ni n c l u d ef o u rc h a p t e r s ： i nt h ef i r s t c h a p t e r , t h ec h a r a c t e r i s t i c s o fc e ，t h es e p a r a t i o nm o d e l sa n d b a s i c t h e o r i e so fc e ，t h ed e t e c t o r s ，t h ei n j e c t i o nt e c h n o l o g i e so fc e ，t h es t u d i e sa n d a p p l i c a t i o n so fc e a ds i m p l yi si n t r o d u c e d c h a p t e r2i st h ed e t e r m i n a t i o no fa m i n o h e t e r o c y c l ea n da z a b i c y c l ei ng l i c l a z i d e b u l kb yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sw i t hu m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n as i m p l e ，r e l i a b l e 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 a n dr e p r o d u c i b l em e t h o d ，b a s e do nc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o m s i sw i t ha m p o r o m e t r i c d e t e c t i o n ( c z e a d ) ，w a sd e v e l o p e d f o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f 3 - a m i n o - 3 一a z a b i c y c l o 3 ，3 ，o o c t a n e ( a m i n o h e t e r o c y c l e ) a n d3 - a z a b i e y c l o 3 ，3 ，o o c t a n e ( a z a b i c y e l e ) i ng l i c l a z i d eb u l kd r u g t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fc z e a dw e r e5 0 m m o l1 1b o r a t es o l u t i o n ( p h9 0 1 嬲r u n n i n gb u f f e r , 1 4k va ss e p a r a t i o nv o l t a g ea n d o 9 5 v ( v e r s u ss c e ) a sd e t e c t i o np o t e n t i a l u n d e rt h es e l e c t e do p t i m u n lc o n d i t i o n s ，t h e t w oa n a l y t e sc o u l db ep e r f e c t l ys e p a r a t e dw i t h i n9m i n t h el i n e a r i t yr a n g eo f a m i n o h e t e r o e y c l ew a sf r o m1 0 x1 0 击t o1 o x1 0 。m o l la n dt h a to fa z a b i c y c l ew a s f r o m2 o 1 0 。6 t o1 0 1 0 。3m o i l t h e i rd e t e c t i o nl i m i t sw e r e5 o 1 0 7m o l la n d 1 0 1 0 6m o y lr e s p e c t i v e l y ( s n = 3 ) t h i sp r o p o s e dm e t h o dd e m o n s t r a t e dl o n g - t e r m s t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t yw i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n so f l e s st h a n2 f o rb o t l l m i g r a t i o nt i m ea n dp e a kc u r r e n t i th a sb e e ns u c c e s s i v e l yu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o n o f t h e s et w oa n a l y t e si ng l i c l a z i d eb u l kd r u g ，a n dt h ea s s a yr e s u l t sw e r es a t i s f a c t o r y d e t e r m i n a t i o no fa c t i v e i n g r e d i e n t si nv cy i n q i a ot a b l e t sb yc a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o nw a sr e p o r t e di nc h a p t e r3 ac a r b o n d i s k e l e c t r o d ew a su s e da sw o r k i n ge l e c t r o d ea n d0 9 5v ( v e r s u ss e e ) w a ss e l e c t e da s d e t e c t i o np o t e n t i a l t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fc z ee x p e r i m e n tw e r e3 0m m o l l b o r a t es o l u t i o n ( p h9 5 ) a sr u n n i n gb u f f e r , 1 4k va ss e p a r a t i o nv o l t a g ea n d8s ( 1 4k v ) a se l e c t r o - k i n e t i cs a m p l i n gt i m e u n d e rt h es e l e c t e do p t i m u mc o n d i t i o n s ，p a r a c e t a m o l ， v i t a m i nc ，c a f f e i ca c i da n dc h l o r o g e n i ca c i dc o u l db ep e r f e c t l ys e p a r a t e dw i t h i n2 2 m i n ，a n dt h e i rd e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) r a n g e df r o m5 x 1 0 7t ol x l 0 击m o l l t h i s p r o p o s e dm e t h o dd e m o n s t r a t e dg o o dr e p r o d u c i b i l i t yw i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s o fl e s st h a n3 f o rb o t hm i g r a t i o nt i m ea n dp e a kc u r r e n t ( n = 7 ) t h eu t i l i t yo ft h i s m e t h o dw a sd e m o n s t r a t e db ym o n i t o r i n gak i n do fc o m p o u n dm e d i c i n en a m e dv e y m q i a nt a b l e t sa n dt h ea s s a yr e s u l t sw e r es a t i s f a c t o r y i nt h ec h a p t e r4 ，c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o m s i sw i t ha m p e r o m e 仃i cd e t e c t i o n ( c z e - a d ) w a sf i r s t l ya p p l i e dt ot h es i m u l t a n e o u ss e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no f n i t r o a n i l i n ep o s i t i o n a li s o m e r s t h et h r e ea n a l y t e sc o u l db ep e r f e c t l ya n a l y z e db y u s i n gt h eb u f f e ro fe x t r e m ep h t h ee f f e c t so fs e v e r a li m p o r t a n tf a c t o r sw e r e i n v e s t i g a t e dt of i n do p t i m u mc o n d i t i o n s ac a r b o n - d i s ke l e c t r o d ew a su s e da sw o r k i n g v 华东师范大学2 0 0 6 年申请硬士学位论文 e l e c t r o d e t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e4 0m m o l lt a r t a r i ca c i d - s o d i u mt a r t r a t e ( p h 1 2 1 嬲r u n n i n gb u f f e r , 1 7k va ss e p a r a t i o nv o l t a g ea n d1 1 0v ( v e r s u ss a t u r a t e d c a l o m e lr e f e r e n c ee l e c t r o d e s c e ) a sd e t e c t i o np o t e n t i a l u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s ，o - ，m a n dp - n i t r o a n i l i n ew e r es e p a r a t e ds u c c e s s f u l l ya n dg o o dl i n e a r i t y , r e p r o d u c i b i l i t y a n dr e c o v e r yr e s u l t sw e r eo b t a i n e d t h ed e t e c t i o nl i m i tf o r m n i t r o a n i l i n ew a sa sl o wf l sa t9 0 6 1 0 一m o l l t h i sp r o p o s e dm e t h o d d e m o n s t r a t e dl o n g - t e r ms t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t yw i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s o fl e s st h a n1 8 f o rm i g r a t i o nt i m ea n d1 1 f o rp e a ka r e a s t h eu t i l i t yo ft h i s m e t h o dw a sd e m o n s t r a t e db ym o n i t o r i n gd y e s t u f fw a s t e w a t e ra n dt h ea s s a yr e s u l t s w e r es a t i s f a c t o r y k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ，g l i c l a z i d e ，o - m 一，p - n i t r o a n i l i n e ，p o s i t i o n a li s o m e r s ，e x t r e m ep h 学位论文独创性声明 本人厮呈交豹学位论文是我在导拜的指导下进行静研究3 2 作及取褥的 崭究或荣，据我麟知，除文中已缀注明g l 翊雏内骞势，零论交琴包含其饱令 人已经发袭或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中作了明确说明并裘示谢崽 作者签名：金 日期：塑! ：! ：型一 学位论文授权使用说明 本人完全了舞华窳翔莲大学有关保塑、链瘫学位论文静溉定，学校有投保 留学位论文并向国家童管部门绒其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆搜查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有校将学位论文的标惩和摘要 汇编毽叛。保密耱学嫩论文在解密届避霜奉规定。 i j 、 学位论文作者签名：) 够导师签名 日期。趣f ：! ：掣 獬1 三 o r i g i n a l i t y n o t i c e i np r e s f i n gt h i st h e s i si np a r t h l 内l f f i l m e n to f t h er e q u i r e m e n t sf o rt h em a s t e r s d e g r e ea te a s tc h i n an o r m a lu n i v e r s i 竹1w a r r a n tt h a tt h i si so r i g i n a la n da n yo ft h e t e c h n i q u e sp r e s e n t e di nt h et h e s i sh a v eb e e nf i g u r e do u t 诲m e a n yo f t h er e f e r e n c e s 桕t h ec o p y r i g h t , t r a d e m a r k ，p a t e n t , s t a t u t o r yr i g 址o rp r o p r i e t y 矗g b to fo t h e r sh a v e b e e n e x p l i c i t l ya c k n o w l e d g e da n di n c l u d e di nt h er e f e r e n c e ss e c t i o n 砒t h ee n do f t h i s t h e s i s 。 s i g n a t u r e ：孟盘羔zd a t e ：越i ：；翌 c o p y r i g h t n o t i c e ih e r e i na g r e et h a tt h el i b r a r yo f e c n u s h a l lm a k ei t sc o p i e sf r e e l ya v g l a b l ef o r i n s p e c t i o n 1f t l 吐e ra g r e et h a te x t e n s i v ec o p y i n go ft h et h e s i si sa l l o w a b l eo n l yf o r s e h o l a r l yp u r p o s e s ，i np a r t i c u l a r , s t o r i n gt h ec o n t e n to ft h i st h e s i si n t or e l e v a n t d a t a b a s e s , 嚣sw e l ls ec o m p i l i n gm a dp u b l i s h i n gt h et i t l ea n da b s t r a c to ft h i st h e s i s 。 c o n s i s t e n tw i t h “f a i rb s e ”a sp r e s c r i b e di nt h ec o p y r i 曲tl a wo ft h ep e o p l e s r e p u b l i co f 例n a a i i 出o r s i g n a t u r 。：主2 盘。! s u p e r v i s o r s i g n a t u r e ： 训铆z d a t e ：垫f ：兰：! i d a t e ：竺：! ：二f 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 第一章绪论 第一节毛细管电泳概述 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是近二十年来发展最快的分离分 析技术之一，它实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，是分析科学中继高效液相 色谱之后的又一重大进展，将分离柱效提高到上百万理论塔板数，进样量也从微 升水平进入纳升水平。作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分 离技术，近年来发展迅猛并得到广泛应用，其研究和应用涉及环境分析、药物分 离、生化分析等几乎所有的分析领域。同时使单细胞分析，乃至单分子分析变为 可能，长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力，依据样品 中各个组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类新型液相分离技术。 其分离的依据，是组分沿管轴方向运动的速度差异。仪器部分包括高压电源、样 品缓冲溶液池、毛细管、样品检测器、数据采集器等【图1 】。在高压直流电场的 作用下，缓冲溶液中的带正电荷的离子会从正极往负极移动，带负电荷的离子会 从负极向正极移动，从而达到分离。离子在毛细管内的实际迁移速率为其电泳速 率和电渗流速率的矢量和。 c a p m 了f l e c n 呻。i 曲 。l l 。t ，, t 。 厂一一1 一一1 斟萨 凶 l ! 生二叠砸 = 二= 毛细管电泳方法虽新，但历史久远。以毛细管等速电泳( c i t p ) 的发展为 起点可以追溯到1 9 6 0 年代甚至更远 1 】。毛细管电泳技术是瑞典科学家h j e l l e n 首先提出的 2 】，他用壁涂甲基纤维素的3m mi d ( 内径) 石英管进行电泳分离。 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 为锐化区带，他令管子绕轴旋转，构思巧妙，但难以实用。1 9 7 0 年，e v e r a e r t s 用等速 电泳系统做c z e 分离，操作简单但柱效较低 3 1 。1 9 7 9 年，m i k k e r s 等一方面从 理论上研究了影响c z e 效率的电场聚焦现象，一方面在试验上通过减少进样量 并采用较细的毛细管可以抑制区带电场畸变和对流，从而获得高效率。实验证明 在p m o l 级进样量下，o 2 m mi d 的管子可以获得小于1 0 um 板高的效率【4 】。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s s 用7 5umi d 的毛细管，在3 0k v 的电压下进行电泳， 可以产生4 0 万理论塔板数的效率，并实现了正、负离子的同时分离，同时对高 电场和小内径对柱效的决定性影响、分离机理等问题进行了探讨。他们的研究使 c z e 取得了突破性进展，奠定了毛细管电泳的理论基础。1 9 8 3 年后，h j e r t e n 先 后提出了毛细管凝胶电泳【6 】和毛细管等电聚焦法【7 】，它们不仅可以大幅度提高 效率，而且可以实现自动化操作，便于定性、定量工作。1 9 8 4 年t e r a b e 运用含 s d s 胶束的缓冲液分离了中性成分 8 ，从而建立了m e c c ( 胶束电动毛细管色 谱) 。 与经典电泳相比，c e 克服了由于焦耳热引起的谱带展宽，柱效较低的缺点， 确保引入高的电场强度，改善分离质量。柱效高的可达每米几百万乃至几千万理 论板数以上。c e 与高效液相色谱( h p l c ) 一样同是液相分离技术 j 艮大程度& c e 与h p l c 互为补充，但无论从效率、速度、用量和成本来说，c e 都显示了它的优势。 c e 没有泵输运系统，成本相对要低，且可通过改变操作模式和缓冲液成分，根据不 同的分子性质( 如大小、电荷数、手征性、疏水性等) 对极广泛的物质进行有效分 离，相比之下，为达到相同目的，h p l c 要用价格昂贵的柱子和溶剂。另外，c e 在 进样和检测时均没有象h p l c 勇g 样的死体积，且c e 以电渗流为推动力，使溶质带 在毛细管中原则上不会扩散，而h p l c 以压力驱动，柱中呈抛物线型导致谱带变宽， 柱效降低。毛细管电泳技术具有四高、二少、一广的特点。 四高高效率：理论塔板数高，柱子长，且进样端和检测端都无死体积，因此 高柱效。高灵敏度：毛细管电泳分离后，用激光诱导荧光检测法( l i f ) 和安培型电 化学检测法( a d ) ，即可达几十个至几个分子及单细胞检测。高速度：使用细内 径( 2 5 7 5 m ) 的毛细管，它具有电阻高，能使用高的电场( 1 0 0 5 0 0v e m ) 。高电场 的应用提高了分离效率，缩短了分离时间，通常只需几十秒至几十分钟内就可完成 分离。芯片式c e 则更快，能以秒计算。易实现高自动化：c e 是目前自动化程度最 攀表耀墓夫学2 0 0 6 年串 毒醺圭学靛论文 毫的分离分据方法之一。 二少囝所需的进样少( 消耗体积在i 5 0 r d ) 。释积也小( 如：一檄7 5 肛1 1 1 x 1 0 0 e m 营予麓窖获仗势4 毒黏l ；5 8 # mx 5 0c ：n l 警予其容耪迩苓是l # l 。：速器 成本少( 只需少量的流动相和低廉的毛细管) 。由于c e 的消耗少且一机多用，其运 章亍成本可戳下降到极低的永平。 一广一成用范围广。从笼机离予至8 d n a 片段，都可用于分离，尤其多用子分 离生物多聚体如肽类、蛋囱质、核替酸、众属离子、无梳离子及药物，几乎可以 分瓷除挥发性积难溶物之挑的各种貔质。 毛细管电泳通常使用内径很小的弹性涂层熔融石英管，散热快，可承受高电 场，在滚滚夯囊下筑产生平嚣形状鞠毫渗瀛，毽怒也绘c e 豢来以下阕题；铡各 能力差；光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；凝胶、色谱填充管需 要专门豹滚锈技术；大懿诩蘸，截瑟积院畿“放大”壤辫豹律雳，静致蛋巍质等 的分离效率下降或无峰；吸附引起电渗变化，进而影响分离重现性等，目前尚难 以定量控制电渗。所以还需要进一步的研究工作，来拓展篡应用藤。 第二节毛缨管电泳分离模式及其理论基础 逗细管电泳按分离介质帮分离原理不网，存在多葶孛操作模式，各葶争摸式的分离 机理是不相同的。如今的嘏细管电泳不再仪仅局限于分离带电荷的大分予粒子。 也逶合分裹辍离子、鬻离予骐及孛瞧分子。鬻显熬廷缨管溆泳戆分舞模式包摇毫 细傺区带电泳( c z e ) 、胶束电动毛细管色谱m m c c ) 、毛细管凝胶电泳( c o e ) 、毛 蜜鬻等毫聚焦( c l e 玲、毛缩管等速魄泳( c l 鳓窝亲帮毛雏警电泳( a c e ) 翻等。 2 1 龟细管区带电泳( c z e ) c z e 义称毛细管区带电泳，由予操作麓单，多样化，是匿裁c e 中最基本、痘用 最广泛的一种方式。在c z e 中，毛细管内只充入缓冲溶液，在直流高腰驱动下溶质 熬不嚣豹速率在势立豹嚣带凌逶抒迁移嚣被分离，囊手毫渗滚e 雠) 豹存在，蓬受 离子都可用c z e 分离，而中性溶质本身在电场中不移动，随e o f 一起流出毛绷管。 e z 嚣静应用范围穰宽，包括辩氨萋酸、多获、离子、对映体簿耪质静分析。健是， 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 c z e 只能分析荷电粒子，对于中性粒子，由于其不存在淌度差异而不能实现多种 粒子的分离【l o 。在c z e 模式中影响分离的最主要因素是缓冲液的成分和p h 值。 一种理想的缓冲液应该使电导率低( 为了在高电压下不产生高电流) 且对分离的 干扰最小，常见的有磷酸、硼酸、柠檬酸、磷酸硼酸缓冲液。 2 2 胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 1 9 8 4 年，t e r a b e 用含s d s ( 十二烷基磺酸钠) 胶束溶液分离了中性分子 1 1 】，建 立了毛细管电泳的一个重要分支，即胶束电动毛细管色谱( m i e e l l a re l e c t r o k i n e t i e c a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e k c ) 。在m e k c ，是把一些离子型表面活性剂( 如十 二烷基硫酸钠，s d s ) 加到缓冲液中，当其浓度超过临界胶束浓度后，就形成有一疏 水内核，外部带负电的胶束。溶质在水相和胶束相( 准固定相) 之间产生分配，中性 粒子因其本身疏水性不同，在两相中分配存在差异而得以分离。m e k c 弥补了c z e 分离模式的不足，它不仅可以测定荷电离子，而且可以测定中性粒子，拓宽了 c e 的应用范围，是对c e 的极大贡献。近年来，各种各样的表面活性剂得到了研究， 如环糊精、聚乙烯吡啶等，并在许多样品测试中得到了应用 1 1 1 5 】。 2 3 毛细管凝胶电泳( c g e ) 毛细管凝胶电泳( c g e ) 由k a r g e r 等于1 9 8 7 年提出，是将板上的凝胶移到毛细 管中作支持物而进行的电泳。c g e 凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，溶质按 分子大小进行分离。常用的凝胶是聚丙烯酰胺和琼脂糖。其原理为交联的聚丙烯 酰胺具有三维多空结构，是一种优良的筛分介质，溶质按分子大小进行分离。该 分离模式在d n a 测序和限制片段分析方面展现出其优异性能，成为蛋白质、多 肽、寡核苷酸和d n a 等生物大分子分离分析的有利工具，广泛用于d n a 片段的 分离 1 6 1 8 】。r 由于凝胶具有粘度大、抗对流的特点，能减少溶质的扩散，所得峰型 尖锐，柱效极高 1 9 】，是毛细管电泳的理想介质，但制备困难，寿命偏短，使用时易产 生空泡。后发展起来的无胶筛分，用粘度低的线性聚合物溶液代替高粘度的聚丙 烯酰胺，同样起到使不同体积的溶质分子在充当“分子筛”的介质中电泳分离的 目的，每次分离均用新胶，可避免空泡的产生，且比凝胶柱便宜、简单、寿命长，但分 离能力稍差。 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 2 4 毛细管等电聚焦( c i e f ) c i e f 模式是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行，通过管壁涂层使电渗 流减小到最小，以防止蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带 2 0 】。在高压作用下，毛 细管内部建立p h 梯度，当蛋白质顺着这一梯度迁移到相当于其等电点的位置时， 就在该点停下来，由此产生一个非常窄的区带，不同蛋白质等电点不同，所形成 区带位置不同，从而实现蛋白质的分离，再通过检测器分别加以确认。该分离模 式可以用来测定蛋白质的等电点，分离异构体或其它方法难以分离的蛋白质，而 且由于其分辨率极高，可以用来获取适量的蛋白质纯# 6 2 1 - 2 3 。 2 5 毛细管电色谱( c e c ) 毛细管电色谱( c e c ) 是将h p l c 发展起来的众多固定相填充到毛细管中或涂 敷在毛细管壁上，使之如同色谱固定相一样参与分离，其样品与固定相之间的相互 作用为分离机制，同时以电渗流为流动相驱动力的色谱分离技术。可以说，c e c 是c e 与h p l c 的有机结合，结合了毛细管电泳和高效液相的优点，既有c e 的高柱 效，又有h p l c 的高选择性，利用涂层还可有效减少生物大分子如蛋白分子在毛细 管壁的吸附，改善峰形，提高选择性，是一种很有发展前景的模式。它突出的优点是 可以同时分离带电离子与中性分子，而且通过控制分离条件实现更好的分离效率 【2 4 2 6 】。 2 6 毛细管矩阵电泳( c a e ) 为了满足大批量样品的分离要求，特别是在人类基因组和蛋白组计划中的应 用【2 7 】，毛细管阵列电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 的分离模式渐渐呈 现出了广阔的应用发展前景和趋势。与传统聚丙烯酰胺凝胶板电泳可以进行多道 平行分析相似，毛细管矩阵电泳即是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析的 一种分离模式。将几十根甚至上百根等长的毛细管平行并列在一起，同时分离检 测大量样品。它是在常规c e 原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的 一种检测技术，它具有物料通薰大，可以实现几十或几百个样品同时分析，单个 样品分析成本低的特点，同时，由于毛细管很多，起到了分流作用可以施加更高 的电压，在保证分离效率的同时减少了分离时间 2 8 】。 华东师范大学2 0 0 6 年申请硕士学位论文 2 7 毛细管电泳芯片t i c f , c ) 1 9 9 2 年, m a n z 等首次研制出芯片毛细管电泳装置【2 9 】，该项技术以晶体硅、 玻璃、塑料( 指有机玻璃) 、陶瓷和硅橡胶为基体材料，借助毛细管电泳技术，将样 品进样、反应、分离、检测等过程集成到一起的多功能化的高效、快速、试样用 量少的微型实验室技术。该项工作与分析仪器的微型化、小型化和集成化紧密相 连，使得其能符合现代化学、制药工业的低成本和高产出的需求。 2 8 非水毛细管电泳( n a c e ) c e 通常是在以水为溶剂的缓冲溶液中进行的，这限制了分析物的使用范围。 而如果用纯有机溶剂替代水介质来完成特殊样品的电泳分离，即非水毛细管电泳 法( n o n a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 。n a c e ) ，则可以解决这个问题。这种分离 模式具有灵敏度高、改善分离、减少毛细管内壁吸附等很多优点。w a l b r o h e l 等 3 0 于1 9 8 4 年首次以乙腈为非水溶剂分离了几何异构体喹啉和异喹啉，取得了不 错的效果。目前，n a c e 应用的研究热点集中在有机溶剂、电解质、检测器的选 择以及方法的优化等方面。n a c e 主要用于分析不易溶于水而易溶于有机溶剂的 物质，分离在水溶c e 中淌度十分相似的物质，但仍存在很多限制性因素，而且要选 择合适的有机溶剂也有一定的难度。 2 9