（分析化学专业论文）分子印迹整体柱及溶剂萃取在手性拆分中的应用研究.pdf

中南大学硕十学位论文 摘要 摘要 本论文使用分子印迹整体柱和手性溶剂萃取技术对二苯甲酰酒 石酸和氧氟沙星外消旋体的手性拆分进行了研究。 ( 1 ) 以二苯甲酰d 酒石酸( d d b t a ) 为模板分子，丙烯酰胺 ( a m ) 为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯( e g d m a ) 为交联剂， 低极性的甲苯和十二醇为混合致孔剂，用原位分子印迹技术，合成了 d d b t a 分子印迹整体聚合物。在优化制备条件和色谱条件的基础 上，d b t a 外消旋体在2 5m i n 内基本可以实现在印迹整体柱上的手 性分离，分离度达1 2 5 。相比之下，非印迹整体柱对d b t a 外消旋体 无任何分离效果。色谱分离的热力学研究表明，在所考察的温度范围 内，分离存在两种不同的热力学过程，且二者均符合范特霍夫方程。 在这两种热力学过程的转换温度处，分离因子仅达最大值。s c a t h c a r d 分析表明印迹整体聚合物中只存在一类特异性结合位点，离解常数和 最大表观结合量分别为：kd = 5 4 5 7 1 0 4 m o l l ，q 一= 2 2 9 6 p m o l g 。 氮比表面吸附实验表明印迹聚合物的比表面积为1 0 5m 2 儋。扫描电镜 分析表明印迹整体柱中具有大的流通孔道。当使用流速为1 2m l m i n 的乙腈做流动相时，柱压仅为1 2m p a 。 ( 2 ) 以d d b t a 为模板分子，a m 为功能单体，e g d m a 为交 联剂，二苄基三硫代碳酸酯( d b t t c ) 为链转移试剂，低极性的甲 苯和十二醇为混合致孔剂，采用可逆加成一断裂链转移( r a f t ) 聚合 法原位制备了d d b t a 分子印迹整体柱，比较了其与传统自由基聚 合法制备的d d b t a 分子印迹整体柱的差异，结果表明：利用r a f t 聚合法制备的d d b t a 分子印迹整体柱的孔径分布更加均匀，对 d d b t a 分子显示出更高的结合性能。用于色谱手性拆分d b t a 外消 旋体时，可有效减小路径效应，提高色谱分离的柱效，缩短手性分离 时间。 ( 3 ) 以二( 2 乙基己基) 磷酸( d 2 e p h a ) 与酒石酸衍生物d b t a 和对甲基二苯甲酰也一酒石酸伍一d t t a ) 为混合复合手性选择剂，研究 了氧氟沙星( 0 f l x ) 对映体在正辛醇和水两相中的萃取分配行为。考 察了三d b t a 和三一d t t a 的摩尔浓度比、o f l x 初始浓度、萃取温度 对手性萃取分离性能的影响。结果表明：当d 2 e p h a = o 3m o l l ， d t t a ：三d b t a = 3 ：2 ，即d t t a = o 1 8m o l l ，d b t a = o 1 2m o l l ，氧 氟沙星初始浓度为o 2m g m l ，萃取温度为2 5 时，可取得较好的 中南大学硕士学位论文摘要 萃取拆分效果，此时对映体选择性达2 4 3 ，d 型和型对映体的分 配系数分别为l o 2 0 和4 2 0 。 关键词分子印迹，整体柱，h p l c ，i 认f t 聚合，手性萃取 中南大学硕十学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t c h r i a l s 印a r a t i o n s o fd b i aa n d0 f l o x a c i ne n a n t l o m e r sw e r e i n v e s t i g a t e du s i n gm o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u ea n ds 0 1 v e n te x t r a c t i o n r e s p e c t i v e ly ( 1 ) t h e d i b e n z o y l d t a n a r i c a c i d ( d - d b t a ) m o n o l i t h i c m 0 1 e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r( m i p ) w a s p r 印a r e db y i ns i t u p 0 1 y m e i l i z a t i o nu s i n gd d b t a a st h et e m p l a t e ，a c 巧l a m i d e ( a m ) a st h e 如n c t i o n a lm o n o m e r e t h y l e n e9 1 y c o ld i m e t h a c 叫1 a t e ( e g d m a ) a st h e c r o s s l i n k e r ， a n dl o w e rp 0 1 a rs 0 1 v e n t s ( t o l u e n ea n dd o d e c a n 0 1 ) a st h e p o r o g e n i c s o l v e n t s w i t ht h e o p t i m i z a t i o n o f p o l y m e r i c a n d c h i o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ， t h e e n a n t i o s 印e r a t i o n o fd b t aw a s s u c c u s s 凡1 1 ya c h i e v e d w i t h i n2 5m i no nt h eo b t a i n e dm i pw i t ha r e s o l u t i o nf a c t o rr s = 1 2 5 ，w h e r e a sn oe n a n t i o s 印a r a t i o ne f f e c to fd b t a w a s a c q u i r e d o nt h em o n o l i t h i c n o n i m p n n t e dp o l y m e r( n i p ) t h e 彻o d y n a m i cd a t ao fs e p a r a t i o nw e r ec a l c u l a t e d t h er e s u l t sr e v e a l e d t h a tt w od i f f - e r e n tt h e m o d y n a m i cp r o c e s s e se x i s t e dw i t h i nt e m p e r a t u r e i n v e s t i g a t e da n db o t hf i t t e dv a n th o f fp l o tv e uw e l l j u s ta tt r a n s i t i o n t e m p e r a t u r eo ft h et w ot h e 彻o d y n a m i cp r o c e s s e s ， t h em a x i m u mo f s 印a r a t i o nf a c t o r 及a p p e a r e d s c a t h c a r da n a l y s i si n d i c a t e dt h a to n l yo n e c l a s so fb i n d i n gs i t e se x i s t e di nt h eo b t a i n e dm i p ，w i t hi t s 玉0a n d ! 易甜 e s t i m a t e dt ob e5 4 5 7 lo 一耳m o l la n d2 2 9 6 p m o l 儋，r e s p e c t i v e l y n i t r o g e na d s o 巾t i o ne x p e r i m e n tp r o v e dt h a tt h ep r 印a r e dm i ph a d al a 唱e s p e c i f i cs u r f a c ea r e ao fl0 5m 2 g s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ys h o w e d t h a t1 a r g en o w t h r o u g hp o r e sw e r ep r e s e n to nt h ep r e p a r e dm o n 0 1 i t h ，a sa c o n s e q u e n c e ，t h eb a c k p r e s s u r ew a so n l y1 2m p a a tt h en o wr a t eo f1 0 m l m i nu s i n ga c e t o n i t r i l ea st h em o b i l ep h a s e ( 2 ) t h ed d b t am o n o l i t h i cm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp 0 1 y m e r ( m i p ) w a s p r 印a r e db y r e v e r s i b l e a d d i t i o n - 纳g m e n t a t i o n c h a i n t r a n s f e r ( r a f t ) p r o c e s su s i n gd d b t aa s t h et e m p l a t e ，a ma st h e 如n c t i o n a l m o n o m e r ， e g d m aa s t h e c r o s s l i n l 【e r ， d i b e n z y l t r i t h i o c a r b o n a t e ( d b t t c ) a st h er a f ta g e n t t h ed if i f e r e n c e s b e t w e e nd d b l am i p sp r e l ) a r e db yt h er a f tp r o c e s sa n dt h e t r a d i t i o n a lp 0 1 y m e r i z a t i o np r o c e s sw e r ec o m p a r e d i tt l j m e do u tt h a tt h e 中南大学硕士学位论文 a b s t r a c t n d b t am i pp r 印a r e db yr a f t p r o c e s sh a dar e l a t i v e l yn a r r o wr a n g e o fp o r es i z ed i s t r i b u t i o n ，a n dh a dab e t t e rb i n d i n gp r o p e r t yt od d b t a m o l e c u l e s w h e nu s e di n c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n o fd b t a e n a n t i o m e r s ，i tc a ni m p r o v et h ec o l u m ne 衔c i e n c ya n dr e d u c es 印a r a t i o n t i m e ( 3 ) t h ed i s 们b u t i o nb e h a v i o ro fo f l o x a c i n ( 0 f l x ) e n a n t i o m e r sw a s e x a m i n e di nat w o - p h a s ea q u e o u s o r g a n i cs o l v e n tm i x t u r ec o n t a i n i n g d 2 e h p aa n dt a n a r i ca c i dd e r i v a t i v e s 但d b t aa n d 三d t t a ) a st h e m i x e dc o m p l e xc h i r a ls e l e c t o r t h ei n n u e n c eo fc o m p o s i t i o no ft h em i x e d c o m p l e xc h i r a ls e l e c t o r i n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fo f l x ，p ho fa q u e o u s p h a s ea n dt e m p e r a t u r ew a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t a m a x i m u me n a n t i o s e l e c t i v i t vo f2 4 3w a so b t a i n e dw h e nt h em o l a r c o n c e n t r a t i o nr a t i oo f d b t at o d t t ai s2 ：3 f d t t ac o n c e n t r a t i o n o 18m o l l ，三一d b t ac o n c e n t r a t i o no 12m o l l ) a n dt h ep ho fa q u e o u s p h a s ei s6 8 6a t2 5 ，w i t h a n d 仇u p t oar e l a t i v eh i g hv a l u eo f1 0 2 a n d4 2 0 ，r e s p e c t i v e ly k e yw o r d sm 0 1 e c u l a ri m p n n t i n g ，m o n o l i t h i cc o l u m n ，h p l c ， r a f t p o l y m e r i z a t i o n ，c h i r a le x t r a c t i o n l v 中南人学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 手性对映体的定义和性质 化学上，将那些具有相同分子式，而具有不同结构的化合物称为异构体。异 构体主要分为两大类：构造异构体与立体异构体。构造异构是同分异构体的分子 式相同而分子中原子或基团排列顺序不同的现象，可进一步分为碳链异构、位置 异构和官能团异构。立体异构是指同分异构体的原子或原子团互相连接的次序相 同，但在空问的排列方式不同的现象，可进一步分为构象异构，顺反异构和旋光 异构。手性对映体属于旋光异构的范畴，特指一类互为镜像关系但不能完全重合 的异构体，就像人们的双手一样，彼此之间互为对映体，图1 1 所示为甘油醛的 一对手性对映体。对映体具有相同的物理性质( 如熔点、沸点、溶解度、折射率、 酸性、密度等) ，热力学性质( 如自由能、焓、熵等) 和化学性质，除非在手性环 境( 如手性试剂、手性溶剂) 中才表现出差异。对映体对偏振光的作用不同，早在 1 8 4 8 年，法国巴黎师范大学年轻的化学家p a s t e u r 就从外消旋混合物中分离了两 种酒石酸铵钠的晶体【，他第一个认识到手性对映体的光学性质。如果一个化合 物使偏振光按顺时针方向发生偏转，则称该物质为右旋，用正号( + ) 一或字母一一 “矿 表示；如果一个物质使偏振光的平面按逆时针方向发生偏转，则称该物质 为左旋，并标以负号( 一) 一或字母“，一。把一种手性物质和其对映体等物质的 量混合所得到的混合物将不具有光学活性，叫做“外消旋体”或“混旋体”。 c h o l h c i l o h c h 2 0 h c h o l h o i - c h c 心o h 图1 1 甘油醛手性对映体 1 2 外消旋体手性拆分的意义 手性是宇宙间的普遍特征，是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。随着 科技的发展和认知水平的提高，手性的重要性已经获得了人们的共识，手性与人 类的生产，生活已经密不可分，通过不同的方式影响着人类的生存和发展。当手 中南人学硕七学位论文 第一章文献综述 性化合物处于手性环境时，其对映异构体表现出不同的特征，导致不同的性能， 体现为手性药物分子的立体构型与受体之间的相互作用不同，与药理和药效之间 存在密切的关系；生化反应过程的立体选择性与手性分子的立体构型有关；各类 天然有机手性分子的立体构型与它们表现出的生物活性有关；还有高分子材料的 立体构型与性能之问的关系【2 1 。2 0 0 1 年1 0 月1 0 日，诺贝尔化学奖的桂冠，为美 国科学家威廉s 诺尔斯( w i l l i a l l s k j l o w l e s ) 、巴里夏普雷斯( k b a n ys h a 印1 e s s ) 和同本名古屋大学教授野依良治( 1 坶o j in o y o 一) 所摘取，以表彰他们在手性催化 领域内的长期探索和卓越贡蒯3 1 。由此可见，手性获得了世界性的关注，依然成 为了当今化学的一个研究前沿和热点。以下从医药领域，环境领域，生命科学领 域，材料研究领域四个方面阐述手性识别的重要性。 一手性在医药领域中的体现 在医药领域里，含有手性中心的药物，称之为手性药物。人们通过大量实验 发现：许多医药产品或其主要成分是具有手性的，许多中草药的有效成分都具有 光学活性。当手性药物进入生物体后，由于体内手性环境的存在，使其往往只能 利用其中一种异构体，故互为对映体的药物其代谢途径和药理作用常不同，生物 活性、药效、毒副作用也存在显著差异。在一些极端的情况下，手性药物的一种 对映体对治疗有效果，而另一种对映体没有药效甚至完全是一种副作用。最典型 的例子是“反应停 ( t h a l i d o m i d e ) 事件【4 叫。2 0 世纪5 0 年代中期，德国c h 锄i e g r u n e nt h a l 公司以消旋体上市t h a l i d o m i d e ，作为抑制孕妇妊娠反应的镇静剂。 1 9 6 1 年发现，服用此药可引起胎儿的海豹畸形。有文献报道，1 9 5 6 1 9 6 1 年间， 反应停导致有6 0 0 0 8 0 0 0 个类似“海豹”的胎儿没有胳膊和手l7 1 ，另有文献报 道反应停导致1 2 万名“海豹”畸形婴儿出生1 8 l ，这是2 0 世纪最大的药害事件。 1 9 7 9 年，德国波恩大学研究人员对该药物进行了拆分，研究表明其致畸性是由 该药的( 劝一异构体所引起，而( r ) 一异构体被认为即使在高剂量时在动物中也不 引起畸变。惨痛的教训使人们认识到，药物必须注意他们不同的构型。从此，手 性药物的丌发引起了人们的注意。比如氯霉素现在临床上只用其左旋体，其外消 旋体的产品现在己被淘汰1 9 j ；抗菌药左氧氟沙星与其右旋体相比，药效很高，且 毒性极小i l o 】，其在各国上市后，深受人们的欢迎。 近年来，药物学家普遍认识到手性药物的发展关系国计民生，与人们的身体 健康有着直接的联系。同时，许多国家的药政部门也采取了相应的措施，加强对 手性药物的开发、专利申请及注册的管理和控制。例如1 9 9 2 年3 月，美国食品 与药品管理局( f d a ) 在总结手性药物临床经验与教训的基础上，颁布了手性药物 指导原则。此项政策要求药物发展商在新药的使用说明中必须明确量化每一种对 映异构体的药效作用和毒理作用，并且当两种异构体有明显的药效和毒理作用差 2 中南人学硕十学位论文第一章文献综述 异时，必须以光学纯的药品形式上市】。f d a 的决定大大促进了手性药物的研 制和开发，使得世界药物市场中的药物销售类型发生了巨大的变化。我国食品药 品监督管理局于2 0 0 6 年1 2 月1 9r 也发布了手性药物质量控制研究技术指导 原则，使我国手性药物得到进一步的规范。 二手性在环境领域的体现 在环境领域，很多污染物也包含手性结构，比如多氯联苯( p c b s ) 、多环芳 烃( p a h s ) 、氟利昂替代品等。第一批持久性有机污染物( p o p s ) 中的农药是手性 的，现在所使用的杀虫剂中大约有2 5 是手性的，并且随着结构更复杂的化合物 投入使用，这个比率呈渐增趋势。手性污染物的影响主要体现为手性污染物潜在 的生物效应如毒性、致癌性、致内分泌紊乱性等大都具有对映体选择性。 ( 1 ) 手性污染物毒性的对映体选择性：例如杀虫剂育畜磷，尽管其两种光 学异构体都有活性，但其中一种的毒性高出四倍多，又如地虫磷和丙溴磷它们的 ( + ) 对映体比( ) 对映体对模式生物c d u b i a 和d m a 鲫a 的毒性强17 3 8 倒1 2 j 。 ( 2 ) 手性污染物致癌的对映体选择性：许多手性污染物的致癌性是经过一 定的代谢活化而产生的，而参与代谢活化的酶具有高度的专一性，这就导致了对 映体选择性的产生。例如，细胞色素p 4 5 0 ( c y p ) 对黄曲霉毒素( a f l a t o x i nb 1 ，a f b l ) 的转化，通过对其8 ，9 位上烯烃键的环氧化作用后，最终形成致癌产物。 ( 3 ) 手性污染物对内分泌干扰的对映体选择性：清洁剂、塑料制品和杀虫 剂中的某些人造化学物质能够干扰内分泌激素并扰乱两栖类、爬行类、哺乳类和 人类正常的生长和发育，引起神经系统紊乱、生长缺陷以及免疫系统的损伤等。 这些内分泌干扰物主要包括二嗯英类、多氯联苯、有机氯农药滴滴涕及其代谢衍 生物、树脂原料双酚a 以及各种增塑剂等。 由此可见，只有在对映体形态水平上研究手性污染物的环境问题才能弄清它 们在环境中的行为和效应，才能就其对人类健康和生态系统的风险性作出准确的 评价。 三手性在生命科学领域中的体现 生命物质如蛋白质、核酸、多糖( 如淀粉、纤维素等) 都是手性的，并且其 组成部分如氨基酸、核苷酸及单糖等也都是手性的，它们在生命体内几乎都是以 单一构型存在的。例如，组成蛋白质的氨基酸是己构型的，其旋光大多是左旋的， 构成纤维素、淀粉的糖都是d 型的，其旋光大多是右旋的。在生物体系中，手 性识别作用有时是非常明显的。就一般的手性化合物而言，其在生物体内可能有 四种不同的行为：只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一种没有显 著的生物活性：两种对映体都有等同的或近乎等同的定性和定量的生物活性； 两种对映体具有定量上等同的但定性上不同的活性；各对映体具有定量上 不同的活性。另外，生物体中的酶具有高度立体专一的催化特性，而人类新陈代 中南人学硕士学位论文 第一章文献综述 谢的过程是由一系列互相衔接的酶催化反应组成，可见生命的存在本身就包含着 许多复杂的手性识别过程。这也为生命科学家提出了一个重要的研究方向。 四手性在材料领域的体现 最近二十年来，手性在材料领域的发展主要集中在三个方面：高聚物材 料，由手性对映体单体聚合而成的旋光高聚物与相应的外消旋单体的聚合物相 比，许多性质比如熔点、溶解度、结晶速度、力学性能、分子识别性能、光学性 能和电学性能等都有较大差别。例如光活性俨三氯甲基丙内酯的聚合物熔点高 达2 7 5 ，而相应的外消旋体在同样的条件下得到的聚合物不到2 0 0 就分解 了【1 3 】。p 乳酸聚合物的熔点是1 8 0 ，但当三一乳酸中混有8 的伊乳酸时，相 应的聚合物熔点降至1 2 4 【1 4 】。争萘普生分子印迹聚合物对争萘普生的识别能 力明显高于月一萘普生1 1 5 】。因而有望通过高分子聚合物形成过程中的手性识别机 理研究，研制出新的具有特殊功能的旋光高分子材料。液晶材料由于在光信 号的记录、储存和显示方面的优势而已经受到世界各国科学家们的重视。“胆甾 型 液晶都是由手性分子构成的，而“向列型”液晶一般由内消旋体或非手性体 构成的，而且手性分子的加入会导致“向列型”液晶向“胆甾型”液晶转化，因 此进一步从分子水平上研究液晶的立体结构与性能之间的关系，在很大程度上促 进了新型液晶材料的发现和利用【16 。嵋】。非线性光学材料在磁光磁盘、激光唱 盘，激光打印、红外成像，纤维光学等领域都有重要应用，已经发展成一个高科 技竞争领域。对于这些料来说，极化性越好，二次谐波发生性( s e c o n dh a h n o n i c g 饥e r a t i o n ，s h g ) 越高，则其性能越好。为此，在已经提出的几种“分子和晶体 工程”的战略中，选择手性化合物可以保证生成的晶体是1 0 0 非中心对称的， 也就具有比较高的s h g 活性【l 9 1 。 综上所述，手性化合物的研究与医药、环境、生命科学和材料科学等领域紧 密相关，因而发展单一旋光性的手性对映体具有重要的理论和实际研究意义。获 得单一旋光性手性对映体的一个重要途径就是外消旋体的手性拆分，据统计，大 约有6 5 的非天然手性药物是由混旋体或中间产物的拆分得到的。 1 3 外消旋体的分离手段及其进展 1 3 1 外消旋体的结晶拆分 1 3 1 1 直接结晶拆分法 直接结晶拆分法【2 0 1 ( 又称晶体机械拆分法) ，如果对映体以晶体形式析出， 4 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 并且不同构型对映体的晶体有明显差异，则可借助于放大镜，将对映体晶体分别 拣出，达到拆分的目的。1 8 4 8 年，l 0 u i sp a s t e u r 用放大镜和镊子成功地分离了酒 石酸钠铵盐的外消旋体【2 l 】，这项先驱性工作标志着手性分离的丌始。但此法只 能应用在两种对映体晶体可以被明显区别的外消旋体混合物，事实上能符合这些 要求的例子很少，即使能找到这样的例子，操作起来也很麻烦，因而使用面较窄， 不利于推广。 1 3 1 2 接种品种拆分法 接种晶种拆分法【2 2 1 ，向外消旋混合物的热饱和溶液中加入纯对映体之一的 晶种，然后冷却，则同种对映体就可以优先附在加入的晶种上析出，且结晶量远 大于种晶量。将晶体滤出后，滤液中就含有过量的另一对映体，将滤液升温后， 加入外消旋体，冷却，再加入含量较多的对映体的种晶，从而使该对映体自外消 旋体混合物中析出。这种拆分方法只需要两种对映体的少量品种即可完成。倘若 外消旋体比其对映体的溶解度大，那么也可以用任一纯对映体晶体接种，而使该 对映体自外消旋体饱和溶液中析出。如果没有纯的对映体晶种，有时用结构相似 的其他手性化合物( 有时甚至用非手性化合物) 做品种来进行结晶拆分，这就是 近年来发展的所谓“干扰结晶拆分法”。接种结晶拆分法工艺比较简单，成本相 对较低，效果也较好。但合适的溶剂配比需要更多的探索实验获得，操作时的投 料量和温度等控制要求也相当严格。 1 3 2 外消旋体的化学拆分 化学拆分法简单易行，至今仍是最常被采用的重要拆分方法。其基本原理是 用手性试剂将外消旋体中的两个对映体转变成一对非对映异构体，然后利用非对 映体之间的物理性质，主要是溶解度不同，通过重结晶将其分开，再经过适当处 理生成光活性的两种对映体，从而达到拆分的目的【2 3 ，2 4 1 。化学拆分法更适于酸 或碱的外消旋体拆分，拆分酸时，常用的旋光性碱主要是生物碱，如( 一) 一奎宁， ( 一) 一马钱子碱等。拆分碱时，常用的旋光性酸是酒石酸，樟脑一伊磺酸等。拆分 既非酸又非碱的外消旋体时，可以设法在分子中引入酸性基团，然后按拆分酸的 方法拆之。化学拆分法的局限性在于拆分过程冗长、拆分产物的e p 常不高、适 用的底物类型不够普遍等。 中南大学硕十学位论文 第一章文献综述 1 3 3 外消旋体的包络拆分 2 0 世纪8 0 年代，日本化学家t o d a 首先发明了包络拆分法。这种方法利用 手性主体化合物通过氢键、7 【讯相互作用，选择性地将被拆物一外消旋客体分子 中的一个对映体包结络合，从而达到对映体的分离f 2 5 1 。由于拆分过程中，主客 体之间并不发生化学反应，也不要求被拆分物具有特定的衍生功能团，理论上适 于任何手性化合物的拆分。这种方法还具有高效、简单、条件温和等优点，因而 已经引起了人们的广泛兴趣。至今已有许多可用作手性主体的化合物，其中，甾 族化合物胆酸( c h 0 1 i ca c j d ) 及其衍生物是使用最多的有效主体化合物。此外，还 有不少有关酒石酸衍生物、联二萘酚等做主体化合物的报道，被拆分的客体化合 物包括内酯、醇、亚砜、环氧化物、环酮等【2 6 - 2 引。 1 3 4 外消旋体的动力学拆分 l8 5 8 年，p a s t e u r 在发酵消旋酒石酸铵时发现其右旋对映体的代谢要比左旋体 快，以此进行分离，可得到光学活性化合物，这大概是化学史上第一个动力学拆 分的例子，又称经典动力学拆分( c l a s s i c a l n e t i cr e s o l u t i o n s ，c 乇) ，这种方法 最多只能得到5 0 的理论产量。由于经济和环境的影响，人们不仅需要生产高纯 度的对映体，同时需要提高生产的理论产量，在此条件下，促进了动态动力学拆 分( d 、，1 1 锄i ck i n e t i cr e s o l u t i o n s ，d k r ) 【2 9 】的出现，动态动力学拆分要想得到较 高的对映体过量值( p p ) ，其反应的选择性必须很高，一般只有酶才有这样好的 选择性，从而将拆分技术引入了生物拆分方法的研究中p 叭。 1 3 5 外消旋体的生物拆分 外消旋体的生物拆分法是利用酶或含酶的生物组织在一定条件下只能催化 外消旋体中的一个对映体，发生反应而成为不同的化合物，从而分离两个对映体。 在应用中，用酶法拆分氨基酸具有特殊的重要性。d 苯甘氨酸是制备青霉素类抗 生药如氨苄西林( 锄p i c i l l i n ) 和头孢苄氨( c 印h a h e x i n ) 的重要中间体，用化学合成 法得到的是外消旋体。早先工业上用( + ) 一樟脑磺酸拆分，因为拆分剂的大量供应 有困难，导致这两种药的生产规模受到限制。后来改用酶法拆分，先将外消旋苯 甘氨酸用醋酸酰化，然后用氨肽酶水解，只有l 一乙酰苯甘氨酸被水解，经分离， 将伊乙酰苯甘氨酸在酸性条件下水解得到伊苯甘氨酸，一苯基甘氨酸经外消旋 化循环使用【3 。至今，绝大多数氨基酸都可用酶法拆分得到光学纯的对映体。 6 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 与化学拆分法相比，生物拆分法的优点体现为：选择性高；反应条件温和； 产率高，产品分离纯化简单；无毒、易降解、对环境友好。 1 3 6 外消旋体的色谱拆分 与经典的对映体拆分法相比，色谱法具有许多明显的优越性，可以满足各种 条件下对映体分离和测定的要求，能够进行渐变快速的定性定量分析，也可用于 大规模的制备分离和微量测定。目前，色谱法已成为光学拆分最有用的方法。 1 3 6 1 液相色谱手性拆分 ( 1 ) 手性固定相法 手性固定相法( c s p ) 是把手性源合成到固定相上，基于样品与固定相表面的 手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手性分 离，属于不经过转变成非对映体的直接拆分法。其优点是制备方便，能适用于各 类化合物的拆分。缺点是目前还没有一种通用的色谱固定相，需根据样品的结构 选择合适的手性柱。按手性固定相的结构不同，可以分为以下几种类型： 刷型手性固定相 刷型手性固定相是一种“独立型”的化学键合手性固定相。这类手性固定相 一般通过一定的问隔臂，连接一个单分子层的有机分子到硅胶载体上而制得。由 于p i r k l ewh 对该类固定相的发展有突出的贡献，所以又称为“p i r k l e ”型固定 相。此类固定相通常有两种键合途径：含末端羧基的手性选择剂与氨基键合 硅胶进行缩合反应，生成含酰胺型的手性固定相【3 2 1 。含异氰酸酯的手性选择 剂与氨基键合硅胶进行缩合反应，得到脲型结构。目前，此类固定相已被广泛用 于氨基酸、内酰脲、乙内酰脲、胺类、醇类及硫醇类药物对映体的拆分1 3 3 j 多糖衍生物手性固定相 多糖衍生物主要包括纤维素衍生物、淀粉类，纤维素本身虽然对某些对映体 显示出一定的手性识别能力，但由于其难溶性和非刚性，不适于直接用作c s p ， 大多是将其衍生化来使用1 3 4 。6 1 。相对于纤维素而言，淀粉及衍生物更适用于极性 芳香族化合物的分离，二者互为补充。多糖类衍生物c s p 的手性识别主要来自 衍生基团部位与被拆分物之间形成的范德华力、偶极一偶极作用或氢键、或通过 被拆分物分子进入纤维素网状腔，导致腔内立体环境的改变而实现。 环糊精手性固定相 环糊精( c y c l o d e x 倒n ) 简称c d ，是有葡萄糖单元通过a 【一1 ，4 一葡苷连接的环 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 状分子结构，通常含有6 8 个葡萄糖单元。分子整体上具有光学活性和立体识别 能力，其最重要的特点是能与许多有机分子、离子、游离基、无机分子等形成包 容配合物，并且这些包合物的性质比较稳定。在包合物中，环糊精被称为主体， 进入空腔中的分子或离子被称为客体。客体分子能进入空腔，主要是疏水亲酯作 用、范德华力作用、静电引力作用、释放出包容的高能水分子和体系张力能的作 用，而客体分子与环糊精空腔的体积匹配作用是最重要的。另外，环糊精分子中 的羟基为其衍生化、改性、键合提供了结构基础，正是由于这些特性和良好的手 性识别能力，在液相色谱固定相中已得到了广泛的应用【3 7 4 0 】。除用于分离芳香族 有机酸、醇、酯、氨基酸、糖类及其衍生物外，其应用研究最多的是各种手性药 物对映体的分离。 蛋白质手性固定相 蛋白质是一类复杂的高分子聚合物，所含手性亚单位三一氨基酸具有手性特 异性，能特异性地结合小分子，因此对手性分子具有很强的识别能力。由于蛋白 质本身固有的性质，使其对操作条件要求较为苛刻，如高的柱温、有机溶剂、盐 浓度、过低或过高的p h 都会破坏蛋白质手性固定相。虽然蛋白质手性固定相有 许多不足，但它拆分化合物范围广，效果好，因此它仍是对映体分离中应用最广 的固定相之一，往往可以成功地分离其他种类的c s p 难以分开的外消旋体。多 种蛋白质c s p 己用于手性分离，主要包括a 一酸性糖蛋白( a g p ) 【4 ，牛血清蛋白 ( b s a ) 【4 2 】，卵粘蛋白( o v m ) 【4 3 1 ，人血清白蛋白( h s a ) 【删等。 大环抗生素手性固定相 大环抗生素( m a a r o c y c l i ca 1 1 t i b i o t i c ) 类物质的分子中含有几个甚至几十个手 性中心，具有立体的环状结构、芳香基团、羟基、氨基等活性基团。糖肽类大环 抗生素还含有空穴结构，具有疏水作用、包合作用、觚电荷转移作用、形成氢 键、范德华相互作用等多种手性识别作用。1 9 9 4 年，a 册s 仃o n d 4 5 j 实验室首先制备了万古霉素( v a n c o m y c i n ) 、硫链丝菌素( t h i o s t 陀p t o n ) 和利福霉素 b ( r i f a m v c i n ) 抗生素作为h p l c 的手性固定相，并进行了一系列光学异构体的拆 分。此后，他们又报道了以游壁菌素( t e i c o p l a i l i n ) 、瑞斯托菌素a ( 一s t o c e t i na ) 和阿伏霉素( a v o p 砌n ) 为手性选择剂的h p l c 固定相。这类固定相既可以在正相 色谱条件下使用，又可在反相模式下进行，具有适应性强、拆分手性化合物范围 广等特点，因而，又被称为新一代手性固定相。其中糖肽类抗生素的对映体选择 性较高，显示出较广泛的识别能力，所以是大环抗生素手性固定相的研究重点， 其中，三种大环糖肽类抗生素一万古霉素、游壁菌素、瑞斯托菌素手性固定相已 经商品化i 制。 冠醚类手性固定相 中南人学硕十学位论文 第一章文献综述 手性冠醚是具有空腔的大环化合物，环的外侧是亲脂性的，内侧是富电子的 氧原子，与金属离子、氨阳离子等形成主一客体包容络合物是冠醚的重要特性。 c r 跏等首次合成手性冠醚，并用于光学异构体的分离。手性识别主要基于固定 相“空穴 的主一客体络合和氢键作用”。冠醚主体一般是取代联萘衍生物， 它们可键合在硅胶或聚苯乙烯基质上，其品种还极其有限，主要用于分离胺和氨 基酸及其衍生物的对映体。利用冠醚类手性固定相进行拆分时，一般都使用酸性 流动相【4 8 1 。在这类c s p 中，联萘基团是手性选择体，能够通过与芳香胺以氢键 或7 【兀作用形成络合物。改变冠醚中亚甲基的数目和联萘环上的取代基团，对对 映体的选择性都有很大的影响，含有较大取代基的冠醚有较好的手性识别能力。 手性配体交换固定相 手性配体交换固定相是将某种与金属离子结合的手性配体涂覆或键合到载 体上，其分离对映体是基于固定相手性配体、金属离子与被分离溶质对映体形成 的多元配合物热力学稳定性的差异和动力学的可逆性。其中c u ( i i ) 配合物通常是 最稳定的，在配体交换色谱中被广泛采用，其次是n i ( 1 1 ) 或c o ( 1 1 ) ，对映体选择 性和溶质洗脱顺序主要取决于键合配体的结构和金属离子，除配合物形成外，一 些附加作用力，如氢键、偶极一偶极作用、疏水作用办有影响。此类固定相是直 接分离手性化合物特别是氨基酸和羟基酸对映体的一种有效方法【4 9 5 0 】，其选择 性高，无需柱前衍生化，流动相多采用水，大大减小了对环境的污染，是一种高 效、绿色、实用的分离技术。 ( 2 ) 手性流动相法 手性流动相法是将手性添加剂( c h i r a lm o b i l ep h a s ea d d i t i v e ，c m p a ) 加入到 流动相中，与溶质的对映体生成一对非对映络合物，以达到在普通色谱柱( 如 c 1 8 、c 8 、硅胶柱等) 上进行分离的目的。其优点是可采用普通的非手性柱，操 作简便，分析过程较少发生消旋化，可通过改变c m p a 的种类、浓度及流动相组 成而优化分离条件。其缺点是该法体系的稳定性差，平衡时间较长，c m p a 选择 不当时会干扰溶质检测。对于进行前期研究或不易得到商品化的具有特定分离效 能的c s p 的工作者来说，此法仍具有较高的应用价值，液相色谱中用到的c m p a 按其类型和作用原理可分为以下几种： 手性氢键试剂 经修饰的氨基酸和二肽早先用于制备g c 和h p l c 的手性固定相，后来类似 试剂扩展到h p l c 的手性流动相添加剂，如_ 乙酰基一一结氨酸一四丁酰胺，( r ， 尺) 一( 一) 一，_ 双异丙基酒石酸铵等。药物对映体基于分子问的氢键作用而被分 离，但需使用低极性的有机流动相。日本药学研究者d o b a s h i 【5 l 】以三( + ) _ ，- 二异丙基酒石酸铵( ，- d i i s o p r o p y l t a n r 锄i d e ，d i p t a ) 为手性试剂，添加到正 9 中南人学硕士学位论文 第一章文献综述 己烷和氯仿混合的流动相中，使用硅胶柱对多种氨基酸衍生物对映体进行了拆 分，并取得了良好的效果。h e l d i n 【s 2 】等选用( 刀，3 曲一酒石酸二环己酯( ( 强 3 劝d i c y c l o h e x y l t a n r a t e ) ) 作为流动相添加剂，确定了( 劝一阿托品药片中的光学异 构体的纯度。 手性离子对试剂 这种方法是在离子色谱法的基础上发展起来的，用于有机酸碱等带电荷对 映体的分离。其基本原理为在h p l c 流动相中添加手性离子对试剂，对映体分子 与手性离子对试剂间发生作用生成非对映体复合物( 离子对) ，离子对复合物之间 具有不同的稳定性和分配性质，并可与固定相发生不同的静电、疏水和氢键作用， 进而差速迁移得以分离。由于水能与离子对组份的氢键基团反应，故流动相中微 量水的存在可影响系统的立体选择性。常用的手性反离子有奎宁，奎尼宁等，使 用的固定相有硅胶，c n ，d i o l 等【5 3 】。 蛋白质 蛋白质作为手性添加剂可通过静电、氢键、疏水性和电荷转移等反应与对映 体生成蛋白溶质复合物，从而使得对映体分离。如白蛋白和仅a g p 曾被用作手 性添加剂拆分某些精神药物如异丙嗪，甲硫哒嗪及双异丙吡胺等。常用的固定相 是经修饰的中等粒度的硅胶，已用于分离氨基酸、羧酸、疏水性胺类等m 1 物质。 手性包合型添加剂 这类添加剂中最常用的是环糊精和手性冠醚。环糊精对疏水性和亲水性药物 对映体都具有很强的包合作用。d e b o s k i 【5 5 】对伊c d 拆分扁桃酸作了系统研究。 s y k i s k a 等以伊c d 对甲基苯妥因酮及手性巴比妥类药物做了反相h p l c 拆分研 究，发现只有嘧啶环上有不对称碳原子的巴比妥如美芬妥因，甲基苯巴比妥和海 索巴比妥可以拆分。另外，此法还用于分离氯胺酮、哌嗪类镇痛药、伪麻黄碱、 去甲羟基安定等，用的固定相常为o d s 、c n 、c 8 、苯基、硅胶等。检测手段多 为u v 和e c d 。 配体交换型手性添加剂 19 6 8 年，d a v a i l l ( o v 等报道了用配位体交换液相色谱( c h i 豫l “g a n de x c h 锄g e l i q u i dc h r o m a t o 酉a p h y ，c l e c ) 法分离光学异构体。此后，c l e c 方法获得了广 泛应用，其机理也相对比较成熟。金属离子( 如c u 2 + 、z n 2 + 、n i 2 + 、c 0 3 + 等) 与手 性配体( 如一脯氨酸、一苯丙氨酸等) 形成螯合物，以适当的浓度分布于流动相 中，待拆分物与其形成三元非对映体配位化合物，由于结构稳定性和能量的差异， 并与固定相发生立体