（分析化学专业论文）新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测.pdf

硕上学位论文 摘要 蛋白质和核酸是生命体中最重要的两类生物大分子，对人类的遗传疾病和新 陈代谢有重要影响，因此建立简单、灵敏、高效的蛋白质、核酸分析方法对临床诊 断、药物筛选等医学研究具有重要的意义。针对当前对蛋白质和核酸检测技术提 出的高灵敏、高选择、高通量、高特异性和操作简便的要求，本论文建立了一系 列新的电化学生物传感方法用于检测蛋白质和核酸，为蛋白质和核酸分子检测提 供高性能的技术平台，并通过对实际样品的分析以及与经典检测方法的结果对照， 初步验证了这些技术的实用性。 ( 1 ) 本章建立了一种用于目标核酸分子检测的表面邻近杂交电化学传感技术， 进一步拓展了表面邻近杂交分析的应用范围。与蛋白分子表面邻近杂交不同的是， 核酸分子邻近杂交可利用待测核酸序列本身构成一对邻近探针。为此，我们设计 了一个寡核苷酸检测探针，其5 末端修饰二茂铁，3 半片段与目标核酸分子互补 且具有较高熔链温度，若目标核酸分子存在，检测探针与其杂交形成稳定的杂交 体，杂交体一侧检测探针与目标核酸分子其余序列邻近，促进与电极表面固定的 巯基短链寡核苷酸杂交，并使末端标记的二茂铁与电极充分接近，从而产生显著 的氧化还原电流。结果表明，该方法的检测线性范围宽，为1f m 到1n m ，而且 能够成功地识别不同碱基数错配的序列。与传统夹心式杂交分析相比，该法保证 了末端标记的二茂铁与电极充分接近，电子转移效率提高，灵敏度得到了显著改 善。而且由于邻近分析使用了更短的互补序列，有效提高了其选择性。 ( 2 ) 基于一对亲合性核酸适体探针同时识别目标分子而空间邻近导致与某一 互补序列杂交使稳定性提高这一邻近效应，提出了一种高灵敏的用于检测模型分 析物一血小板源性生长因子b b ( p d g f b b ) 的表面邻近杂交分析电化学适体传感 方法。该方法利用该核酸适体探针可成对地与二聚体目标蛋白p d g f b b 同时结 合，由于邻近效应促进两尾端序列同时与电极表面固定的两条短链寡核苷酸杂交， 使得适体探针末端标记的二茂铁与电极充分接近而发生高效电子传递，从而产生 显著的氧化还原电流。该法可实现对p d g f b b 的高特异性地检测，动态响应范围 可从1 0p g m l 到2 0n g m l ，检测限可达1 0p g m l 。 ( 3 ) 构建了一种脂质体滚环扩增免疫传感技术用于超灵敏地检测目标蛋白 p s a ，通过在脂质体中包埋引物探针和滚环扩增反应两步放大，使得灵敏度大大提 高，显示了很好的线性范围和重现性，高选择性，检测范围从0 1f g m l 到0 1 n g m l ，使检测下限大大降低，达到0 0 8f g m l 。 关键词：适体传感器；邻近分析；p d g f b b ；滚环扩增；p s a 新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的榆测 a bs t r a c t p r o t e i na n dn u c l e i ca c i da r et h em o s tt w oi m p o r t a n tm a c r o - b i o m o l e c u l e s ， p l a y i n ge s s e n t i a lr o l e si nt h ef i e l d so fg e n e t i cd i s e a s ea n dm e t a b o l i s m t h e r e f o r e ，i ti s h i g h l ys i g n i f i c a n tt h a tc o n s t r u c t i n gs i m p l e ，s e n s i t i v ea n de f f i c i e n ta n a l y t i c a lm e t h o d s f o rd e t e c t i n gp r o t e i na n dn u c l e i ca c i di nt h ea r e ao fc l i n i c a ld i a g n o s i sa n dd r u g s c r e e n i n g t os a t i s f ya n da c h i e v et h ed e m a n do f t h es i m p l e ，h i g hs e n s i t i v i t y ，s e l e c t i v i t y a n da f f i n i t y ，a n dh i g ht h r o u g h o u tf o rt h ed e t e c t i o no fp r o t e i n sa n dd n a ，w ed e v e l o pa s e r i e so fn o v e le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rm e t h o d sa n dp r o v i d eah i g hp e r f o r m a n c e p l a t f o r m t h e s er e s u l t sp r i m a r i l yp r o v e dt h a tt h ep r o p o s e dt e c h n o l o g yi sr e a s o n a b l y c o m p a r a b l ew i t ht h et r a d i t i o n a l d e t e c t i o nm e t h o d s ，i n d i c a t i n gt h ep r a c t i c a b i l i t yo f u s i n gt h ep r o p o s e dm e t h o di nc l i n i c a ld i a g n o s i s t h ed e t a i l e dc o n t e n td e s c r i b e da s f o l l o w s ： ( 1 ) w ed e v e l o pan o v e le l e c t r o c h e m i c a ld n a ( e - d n a ) b i o s e n s o rf o rs i m p l e ， r a p i d ，a n ds p e c i f i cd e t e c t i o no f n u c l e i ca c i d sb a s e do nt h ep r o x i m i t y - d e p e n d e n ts u r f a c e h y b r i d i z a t i o na s s a yi no r d e rt ow i d e n i n gt h ea p p l i c a t i o na r e a t h i se - d n a b i o s e n s o r w a sc o n s t r u c t e db ys e l f - a s s e m b l yo fa3 s h o r tt h i o l a t e dc a p t u r ep r o b eo nt h eg o l d e l e c t r o d e d n ad e t e c t i o nw a sr e a l i z e db yo u t p u t t i n gar e m a r k a b l er e d o xc u r r e n to f5 f e r r o c e n e ( f c ) t a i ll a b e l e dp r o b e w h e nt h et a r g e td n a w a si n t r o d u c e di n t ot h es y s t e m ， i tw a sc o m p l e m e n t a r yt ot h e5 f cl a b e l e dp r o b ea tt h eo n eh a l f - s e g m e n ta n d c o m p l e m e n t a r yt ot h e5 s h o r tt h i o l a t e dc a p t u r ep r o b ea t t h eo t h e rh a l f - s e g m e n t ， r e s u l t i n gi nf o r m i n gas t a b l ed u p l e xc o m p l e x a sar e s u l t ，t h ef cp r o b ew a sp r o x i m a t e t ot h ee l e c t r o d es u r f a c ea n dt h ef a r a d a i cc u r r e n tw a so b s e r v e d t h i se d n ab i o s e n s o r w a sp r o v e dt oh a v eal o wd e t e c t i o nl i m i t ( 1f m ) a n daw i d ed y n a m i cr a n g e ( f r o m1f m t o1n m ) d u et ot h es t a b l eh y b r i d i z a t i o nm o d e i na d d i t i o n ，t h es e n s i n gs y s t e mc o u l d d i s c r i m i n a t et h e c o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e f r o mm i s m a t c hs e q u e n c e s ，w i t hh i g h s e n s i t i v i t y ，s t a b i l i t y ，a n dr e u s a b i l i t y c o m p a r e d w i t ht h ec o n v e n t i o n a ls a n d w i c h h y b r i d i z a t i o na s s a y , t h i sa p p r o a c he n s u r e dt h ef e r r o c e n em a r k e rt oe n o u g hc l o s et h e e l e c t r o d es u r f a c ea n di n c r e a s e dt h ec h a r g et r a n s p o r te f f i c i e n c ya sw e l la si m p r o v e dt h e s e n s i t i v i t yr e m a r k a b l y ( 2 ) w ed e v e l o pas u r f a c ep r o x i m i t y d e p e n d e n th y b r i d i z a t i o ne l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o rm e t h o df o rt h eh i g hs e n s i t i v ed e t e c t i o no fm o d e la n a l y t ep d g f b bb a s e d o nt h ep r o x i m i t ye f f e c t ，t h a ti st os a yap a i ro fa f f i n i t ya p t a m e rp r o b e ss i m u l t a n e o u s l y i i i r e c o g n i z et h et a r g e t m o l e c u l e sa n df o r mt h e p r o x i m i t yp r o b e s s ot h a ts o m e c o m p l e m e n t a r ys e q u e n c eh y b r i d i z a t i o ne n h a n c e dt h es t a b i l i t y w h e na p t a m e rp a i r s s i m u l t a n e o u s l yb i n d i n gt ot h eh o m o d i m e ro fp d g f b b t h et a i ls e q u e n c ea r eb r o u g h t i n t oc l o s ep r o x i m i t yw i t ht h e i rl o c a lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e ds u b s t a n t i a l l yt oa l l o wt h e p a i ro ft a i ls e q u e n c e st oh y b r i d i z et o g e t h e rw i t ht h es u r f a c e t e t h e r e dd n as t r a n d s t h e nt h ef e r r o c e n el a b e l so ft h et a i ls e q u e n c ea r ed r a w nc l o s et ot h ee l e c t r o d es u r f i a c e a n d p r o d u c ead e t e c t a b l er e d o xc u r r e n t i nc o n c l u s i o n ，t h i sm e t h o dc a nb ei m p l e m e n t e d t ot h eh i g ha f f i n i t yd e t e c t i o no fp d g f b b ，d y n a m i c a l l yi n c r e a s e dd p v c u r r e n tw i t h i n c r e a s i n gp d g f - b bc o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m1 0p g m lt o2 0n g m l ，w i t ht h e d e t e c t i o nl i m i to f1 0p g m l ( 3 ) an o v e lr o l l i n gc i r c l e a m p l i f i c a t i o n ( r c a ) i m m u n o a s s a y b a s e do n d n a 。e n c a p s u l a t i n gl i p o s o m e s ，l i p o s o m e r c ai m m u n o a s s a y 。w a sd e v e l o p e df o r u l t r a s e n s i t i v ep r o t e i nd e t e c t i o n t h i st e c h n i q u eu t i l i z e da n t i b o d y m o d i f i e dl i p o s o m e s w i t hd n a p r i m ep r o b e se n c a p s u l a t e da n dal i n e a rr c ar e a c t i o nf o rt h ed e t e m i n a t i o n o fp r o s t a t e s p e c i f i ca n t i g e n ( p s a ) ，t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h et e c h n i q u ee x h i b i t e da d y n a m i cr e s p o n s et op s ao v e ras i x d e c a d ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m0 1 f gm l 。1t o o 1n gm l qw i t hal i m i to fd e t e c t i o na sl o wa so 0 8f gm l a n da h i g hd o s e r e s p o n s e s e n s i t i v i t y k e yw o r d s ：a p t a s e n s o r ；p r o x i m i t y - d e p e n d e n ts u r f a c eh y b r i d i z a t i o n a s s a y ； p d g f - b b ；r o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ；p s a i v 硕士学位论文 第1 章绪论 早在2 刚世纪生命科学就取得了巨大的进展，许多科学家都曾预言2 1 世纪将是 生命科学的世纪。在现代生命科学研究和医学临床检测中，往往需要对一些生物 大分子如蛋白质、核酸等进行选择性测定，因而生命科学与分析化学发生了交叉 融合。随着多种学科不断交叉、融合，产生了新一代的传感装置一生物传感器 ( b i o s c n s o r ) ，从而导致了生命科学技术和分析化学技术的一场空前绝后的革命。 由于生物传感器具有较高的灵敏度和较好的选择性，所以它得到广大分析工作者 的青睐，已经发展成为现代生化分析的重要手段之一。生物传感器( b i o s e n s o r ) 是以生物学组件作为主要功能性元件，能够感受到特定的靶分子并按照一定规律 将这种感知转换成可识别信号的器件或装置【l 也j 。 自1 9 6 2 年c l a r k 提出设想，1 9 6 7 年u p k i k e 和h i c k s 首次研制出生物传感器以来， 生物传感器这一新技术已引起生物医学、环境科学、农业科学等领域科学家的重 视，使之在国际上开始广泛研究。生物传感器不仅在分子生物学、医学检验、食 品工业、环境检测以及国防军事方面有着广阔的应用，而且还发展成为了二十一 世纪生命科学和信息科学的一个重要方法。近年来，由于新理论、新技术的不断 发展，生物传感器得到了越来越广泛的应用，特别是电化学生物传感器的研究工 作更是取得了巨大的进步，其性能和种类也得到了很大的发展。 1 1 电化学生物传感器 生物传感器是指用固定化的生物材料作为敏感元件的传感器。根据用不同的 基础传感器件，生物传感器可分为六大类型【3 】：电化学生物传感器、介体生物传 感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器、半导体生物传感器和光生物传感器。 其中，电化学生物传感器占有重要位置。 电化学生物传感器是指由生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素等) 或生物体本身 ( 细胞、细胞器、组织等) 作为敏感元件，电极( 固体电极、离子选择性电极、气敏 电极等1 作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。近十年来，电化 学生物传感器的研究工作取得了巨大的进步，其性能和种类也得到了很大的发展。 其检测对象【4 0 】从单糖、氨基酸、酶等发展到更为复杂的多糖、蛋白质、核酸等多 种生物大分子。在功能方面已从单一检测发展到多通道的多功能生物传感器 i s ( m u l t i f u n c t i o nb i o s e n s o r ) 和集成生物传感器1 9 l ( m u l t i b i o s e n s o r ) 。 新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测 1 1 1 电化学生物传感器的原理 电化学传感器主要由识别待测物的敏感膜和将生物量转化为电信号的电化学 转换器两部分组成。电化学生物传感器一般采用固体电极作基础电极，将生物敏 感分子固定在电极表面，然后通过生物分子间的特异性识别作用，生物敏感分子 能选择性地识别目标分子并将目标分子捕获到电极表面，基础电极作为信号传导 器将电极表面发生的识别反应信号导出，变成可以测量的电信号如电流、电位等， 从而实现对分析目标进行定量或定性检测。 1 1 2 电化学生物传感器的分类 根据敏感元件所用生物材料的不同，电化学生物传感器分为酶电极传感器、 微生物电极传感器【1 0 m 】、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器f 1 3 小】、 电化学d n a 传感器等【1 6 】；根据生物材料的修饰( 或固定) 到电极上的方法不同， 现有的文献报道主要集中在共价键结合法【1 7 。1 9 】、l b 膜法【2 0 1 、自组装膜法、化学 免疫法、静电吸附结合法、表面富集法等【2 。 1 1 3 基底电极的选择 物质在电极上不管是发生氧化反应，还是发生还原反应都与其自身的电极电 位相关，控制电极电位可以有选择地使溶液中某种成分发生氧化还原反应。当电 路中有电流通过时电极将发生极化现象，使得电极电位偏离平衡电位。为了有效 测量和控制研究电极的电位，电化学实验中通常采用三电极系统，分别是工作电 极、参比电极和辅助电极。常用的参比电极有饱和甘汞电极( s c e ) 和银氯化银 ( a g a g c l ) 电极。辅助电极采用有较大面积的惰性材料，常用铂片或铂丝电极。 制备最常见的电化学生物传感器第一步是把生物分子固定在基底电极上，所 以基底电极的性质决定了固定的方式、难易程度和效果。几十年来，多种电极被 人们用来做基底电极，它们的性质也得到多方面的研究。此外，新的基底电极材 料和制备方法也是科学工作者近几年来一直研究的热点。总的来说，常用的基底 电极主要有碳质电极( 包括玻碳电极、石墨电极、碳糊电极等) 、金属电极( 包 括汞电极、金电极、铂电极等) 和特殊电极。 1 1 4 检测技术 电化学传感器的另一关键技术是所产生的信号的检测技术，其作用是感知生 物分子与待测物质特异性结合产物的微小变化，并把这种变化转变为记录的信号。 根据电化学检测方式的不同主要可分为伏安法2 2 粕l 、计时电位法【2 7 1 、电化学阻抗 法【2 8 锄1 和电致化学发光法 3 4 3 7 1 等。 1 2 电化学酶传感器 电化学酶传感器又称酶电极，是最早研发的一种生物传感器。它是在固定化 酶的催化作用下，生物分子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定 待测物浓度。早在1 9 6 2 年，c l a r k 3 8 】等人就提出了把酶和电极结合起来检测酶的底 物的初步设想，直到1 9 6 7 年，u p d i k e 与h i c k s t 3 9 l 研制出来世界上第一支酶电极，用 于测定血清中葡萄糖的含量。从此，酶传感器引起了广大科学工作者的重视，并 进行了广泛研究，得到了迅速发展。酶传感器的研究发展大致经历了三个阶段： ( 1 ) 以自然界存在的氧作为媒介体来沟通酶与电极之间的电子通道，直接检测酶的 反应底物的减少或产物的生成的第一代酶传感器。这种酶传感器工作电位通常比 较高，因而干扰比较大。( 2 ) 为了降低工作电位，减少干扰，人们就采取人为加入 某种电子媒介体的方法来代替氧来沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道，通 过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化【4 舭4 ”，这就是目前广泛使用的第 二代酶传感器。这种酶传感器可以不受测定体系的限制，测量浓度线性范围较宽， 干扰少。( 3 ) 而第三代酶传感器就是所谓的无介体传感器，这种传感器无需加入其 他试剂，酶自身与电极之间能直接发生电子转移。这是一种非常理想的酶传感器， 人们也一直致力于这方面的研究。目前也有少量报道【4 4 4 6 】：如董绍俊【4 6 】等采用自 组技术将纳米金组装到带巯基的溶胶凝胶网状结构上，再将h r p 吸附到纳米金上， 借助纳米金的催化性能实现了h r p 的直接电化学检测。p o l s k y t 4 7 】等通过共价交联法 在h r p 酶上修饰上重氮基团后，通过循环伏安法将修饰有重氮基团的h r p 电沉积 到玻碳电极上，实现了对h r p 的直接电化学测定。 1 3 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是免疫传感器中研究最早，种类最多，也是较为成熟的一 个分枝。电化学免疫传感器是一种将免疫技术与电化学检测技术相结合的一种免 疫分析方法。它是以抗原一抗体间特异性的免疫反应为基础，将抗原抗体反应达 到平衡状态后的生物反应信号转换成可测量的电信号并通过基础电极将其导出。 当采用某种电化学检测方法测量时，其信号大小与目标分析物在一定浓度范围内 成线性关系，从而实现对目标检测物的分析测定。根据抗原抗体间的免疫反应的 类型，电化学免疫传感器的分析原理也可以分为两种：即基于竞争反应的竞争法 和基于夹心反应的夹心法两种。 因为抗原和抗体本身的电活性很弱或者根本不具有电活性，所以在实际分析 检测过程中，能够直接检测的抗原和抗体并不是很多的，因此往往要采用一些具 有电活性的外源性标志物来对抗原或者抗体进行标记，通过检测这些外源性标记 物产生的电信号来提高对目标分析物的检测灵敏度。采用不同的电分析检测技术 新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测 来检测标记物产生的电信号时，可得到如电流、电位、电容等不同的电信号。因 此，根据所检测到的电信号的不同，电化学免疫传感器又可分为电流型免疫传感 器、电位型免疫传感器、电容型免疫传感器以及电导型免疫传感器。 1 3 1 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是在恒定电压的条件下，通过测量信号分子在传感器表面 发生的氧化还原反应过程中所产生的电流的大小，来实现对目标分析物的检测。 由于这种传感器具有较高的灵敏度，因而它在电化学免疫传感器的研究和实际应 用中，占有十分重要的地位。酶作为一种生物催化剂，其催化产生的各种产物大 多具有氧化还原性，能产生明显的氧化还原电流。而且，酶能很容易地与各种蛋 白质分子结合并能很好的保持其催化活性。因此，以酶为标记物的电流型免疫传 感器已得到广泛的应用。最常用的酶主要包括h r p 、g o d 、碱性磷酸酯酶( a l p ) 等【4 8 踟】。a i z a w a l 5 1 】等人在1 9 7 9 年就用h r p 标记的人绒毛膜促性腺激素( h c t 3 ) 与 没有酶标记的h c g 竞争结合固定的抗体，构建了最早的安培型酶免疫传感器用于 h c g 的检测。此外，除了酶作为标记物外，研究人员还将一些具有电活性的物质 用于电流型免疫传感器的构建，这些电活性物质主要包括一些药物、染料小分子、 金属复合物以及纳米颗粒等【5 2 柳l 。 1 3 2 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器兴起于2 0 世纪7 0 年代，它测量的是敏感膜与目标物发生 选择性作用后在膜上产生的膜电位变化。在零电流条件下，膜电位与目标物浓度 存在着对数关系。电位型免疫传感器结合了酶免疫分析的高灵敏度和离子选择电 极、气敏电极等的高选择性，可以直接或间接检测各种抗原、抗体，具有可实时 检测、响应时间较快等特点。 最早的电位型免疫传感器是j a n a t a 5 8 】在1 9 7 5 年报道的，他利用聚氯乙烯膜把抗 体固定在金属电极上，当待测抗原与固定在电极表面上的抗体结合后，电极上的 膜电位发生相应的变化，而膜电位的变化值与待测抗原浓度之间存在对数关系。 但是，这种传感器稳定性不是很好，而且灵敏度也不太令人满意。因此，研究工 作者就改进了分析方法来提高传感器的性能。如袁若【5 9 l 等在铂电极表面涂覆上一 层n a t i o n 膜后，通过n a t i o n 膜带负电荷的磺酸基团与乙肝表面抗体分子中带正电的 氨基之间的静电作用，将抗体固定到电极表面，从而制备了一种高灵敏、高稳定性 的电位型免疫传感器。唐点平【6 0 j 等则研制了用纳米金修饰的玻碳电极来固载抗体 的电位型免疫传感器并用于白喉类毒素的检测，其结果同样也令人满意。而f u i 5 】 等则先在金电极表面固定巯基乙胺，然后再吸附一层纳米金，在纳米金上再静电 吸附免疫球蛋白抗体( i g g ) ，从而制得电位型免疫传感器。这些方法有效解决了 电位型免疫传感器中灵敏度低，线性范围窄等方面的问题。 硕l ：学位论文 1 3 3 电容型免疫传感器 电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术。在电容型传感器的 制作过程中，绝缘界面的构建和生物识别分子( 抗体) 的固定是影响其性能的重 要因素。关于绝缘层的构建和抗体分子的固定目前也已有不少报道，如通过共价 键合的作用把抗体固定在s i 0 2 和t i 0 2 等半导体氧化物薄膜上，实现对相应抗原的 测定。j i a n g 6 1 1 等在丫a 1 2 0 3 溶胶凝胶中包埋抗体来制备电容型免疫传感器，由于这 种丫a 1 2 0 3 超薄且渗透性好，有着较高的时间常数，因而具有较高的灵敏度，对人 i g g 检测下限可以达到ln g m l 。b a i n 6 2 1 等采用硫一金体系的自组装单分子膜绝缘 性能好，室温时在水、有机溶剂中很稳定，而且制作简单，已成为制备电容型免 疫传感器的常用方法。 1 3 4 电导型免疫传感器 电导型免疫传感器是基于化学反应过程中产生或消耗的离子使溶液的导电能 力发生改变的一种电化学检测技术。y a g i u d a 6 3 】用电导法测定了尿中的吗啡，解决 了原来吗啡测量技术中设备昂贵、费时、麻烦的问题。由于待测样品中的离子强 度与缓冲液电容的变化会对这类传感器造成影响，加之溶液的电阻是由全部离子 移动决定的，使得它们还存在非特异性问题，因此电导型免疫传感器发展比较缓 慢。 1 4 电化学d n a 传感器 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 是一切生物的基本遗传物质，因 此对d n a 的研究是生命科学领域中极为重要的内容。随着分子生物学研究的深 入，对d n a 的检测手段变得越来越重要，尤其是对人体组织、血液、微生物、病 毒等样品中特定d n a 序列的定量检测有着十分重要的意义【“舶l 。 近年来，d n a 生物传感器对基因序列的明确分析得到了快速发展，随着d n a 合成技术与微电子技术的发展，d n a 生物传感器的发展更趋于完善。电化学d n a 生物传感器f 6 7 】是近年来发展起来的一种新型的生物传感器，它能将目标d n a 分子 的存在转换为电信号，比较容易实现微型化、集成化以及原位、在体、实时、在 线的检测，而且具有体积小、花费低、并能与其它仪器兼容的特点【6 8 , 6 9 l ，因此采 用电化学测定d n a 序列便成为许多科研工作者的研究热点，这使得分析化学和生 命科学相结合成了当代科学跨领域研究的新方向。 1 4 1 电化学d n a 传感器原理 电化学d n a 传感器利用单链d n a ( s s d n a ) 作为敏感元件通过共价键合或化 学吸附固定在固体电极表面，加上识别杂交信息的电活性指示剂( 称为杂交指示剂) 新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测 共同构成的检测特定基因的装置。 其工作原理( 如图1 1 所示) 是利用固定在电极表面的某一特定序列的单链 d n a ( s s d n a ) 与溶液中的互补序列d n a 的特异识别作用( 分子杂交) 形成双链 d n a ( d s d n a ) ，同时借助一个能识别s s d n a 和d s 。d n a 的杂交指示剂的电化学 响应信号的改变来达到检测基因是否存在，达到定性的目的。同时，当互补序列 d n a 的浓度发生改变时，指示剂嵌入后的响应信号也会发生相应的变化。一定范 围内指示剂的响应信号与待测d n a 物质的量浓度成线性关系，从而得以检测基因 含量，达到定量检测的目的。 电极预处理 互补的j l i 堪莲d n a _ - _ _ - _ _ _ 杂交 o 掣 单链d n a 片新 图1 1 电化学d n a 传感器的原理示惹图 1 4 2 电化学d n a 传感器的种类 信号转换是指将目标d n a 分子的化学反应信号转换为电信号，通过电信号的 变化来判断杂交发生的程度。一般情况下电信号的转换是通过在d n a 分子上标记 活性基团或使用电活性杂交指示剂，这些指示剂可以是酶，二茂铁，也可以是纳 米粒子等，这种方法称为标记检测；另一种方法是无指示剂标记检测，这种检测 方法是利用鸟苷代替探针中的鸟嘌呤，由于鸟苷和鸟嘌呤的电活性不一样，因此 我们可以通过检测靶序列中鸟嘌呤的氧化信号来检测杂交。 1 4 2 1 标记检测 ( 1 ) 用电活性的杂交指示剂( h y b r i d i z a t i o ni n d i c a t o r ) 来作为识别元素：电活 性杂交指示剂是一类能与单链d n a ( s s d n a ) 和双链d n a ( d s d n a ) 以不同方式如 沟槽结合【7 们、嵌入【7 1 】等相互作用的电活性物质。当杂交发生时，杂交指示剂能够 更好地嵌入双链d n a ，而不嵌入单链d n a ，从而使得指示剂的浓度在电极表面提 高，进而使得电化学信号上升。因此，它可以有效的区别s s d n a 和d s d n a 。目 硕l ：学位论文 前，最常用的杂交指示剂包括葸环类的抗生素( 道诺霉素、阿霉素等) 1 7 毛 j 、染 料( 如亚甲基蓝、麦尔多拉蓝、溴化乙啶等) 【7 4 - 7 6 1 和金属配合物( c o ( b p y ) 3 ”，h o e c h s t 3 3 2 5 8 ，r u ( b p y ) 3 3 + 等) 【7 7 ，7 引。 道诺霉素是一种葸环类化合物，是平面分子结构，可以插入d s d n a 相邻碱 基对之间并与d s d n a 双螺旋产生强烈作用，这使它成为众多抗癌药物中应用较 多的一种杂交指示剂，尤其用于急性白血病的治疗。b a r t o n 7 9 】等证明道诺霉素是 一种插入式氧化还原杂交指示剂。亚甲基蓝属于酚噻嗪类，由于它与鸟嘌呤有明 确的反应，所以它可以作为一种很好的杂交指示剂。麦尔多拉蓝是一种有效的电 子接受体，它的酚噻嗪结构能使电子在双核苷酸和电极表面穿梭，它能插入 d s d n a 中，但是并没有封闭它的电活性，所以它可以作为一种杂交指示剂。对于 金属配合物，主要是利用它的氧化还原电位，它能与d n a 有强烈的亲和作用，并 具有化学稳定性，通过它在电极上的反应电流或电位强弱来判断是否杂交。 ( 2 ) 在寡聚核苷酸上标记电化学活性的官能团作为识别元素：带有电化学活性 基团( 如二茂铁、亚甲基蓝) 8 0 , 8 1 】的寡聚核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进 行杂交反应，在电极表面形成带有电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号 便可以识别和测定目标d n a 分子。t a k e n k a 【8 2 】等人成功地在d n a 的5 端磷酸基 上标记具有电化学活性的羧基二茂铁，制成二茂铁d n a 用来检测目标d n a 。 ( 3 ) 利用酶的化学放大功能在d n a 分子上标记酶作为识别元素：标记酶( 如 h r p 、g o d 、p a l ) 8 3 罐5 】的s s d n a 与电极表面的互补s s d n a 发生杂交反应后，实 际上相当于在电极表面修饰了一层酶，而酶具有很强的催化功能，通过测定反应 生成物的变化量可以间接测定目标d n a 。 ( 4 ) 在寡聚核苷酸上标记纳米粒子作为识别元素：标记了纳米粒子( 如纳米粒 子【8 6 , 8 7 】、聚合物微珠【8 引、半导体量子点f 8 9 1 和磁性纳米粒子【9 0 1 ) 的s s d n a 与电极 表面的s s d n a 进行杂交反应后，通过四种方式来进行检测：( a ) 直接检测1 9 l j ；( b ) 纳米粒子被酸溶解后通过阳极溶出伏安法来检测【9 列；( c ) 通过将电极表面的纳米粒 子进行银染后再通过溶出伏安法检测【9 0 1 ；( d ) 通过测定电导率来检测【9 3 1 。 1 4 2 2 无指示剂检测 无指示剂检测是通过控制杂交中电化学参数的变化来完成的。这种无指示剂 传感器设计方案简单，检测安全，由于这种方法不采用指示剂，所以可以消除指 示剂引起的毒性污染，而且还避免了与致癌性物质的接触。世界上最早的无指示 剂杂交方案由w a n g l 9 4 】等人提出。p a l e c e k t 9 5 】等提出了d n a 和r n a 在杂交后是电 活性物质能够产生氧化还原信号，即使没有形成d s d n a 【9 引，a 、c 、g 的信号也 能够通过s s d n a 的示波极谱观察到。在d n a 的四种碱基中鸟嘌呤g 是最具有氧 化还原特性的氨基碱基，通过用次黄嘌呤来代替鸟嘌呤g ，次黄嘌呤也能与胞嘧 新型生物传感技术用于核酸和蛋白质的检测 啶c 形成碱基对，但它电活性比鸟嘌呤g 低三个数量级【9 1 7 1 。因此可利用d n a 中 核苷残基的这种天然的电化学活性对d n a 进行计时电位分析【9 引、电化学阻抗分析 【9 9 1 和差示伏安分析【1 0 0 】等方法的检测。 1 4 3d n a 探针及其固定方法 目前所使用的d n a 探针大多为人工合成的短链d n a ，长度从十几到上千个 碱基不等，一般使用已被公认的可识别出靶序列所需的最短序列。d n a 探针在电 极上的固定是电化学d n a 传感器制备中的关键步骤。探针的有效固定不仅能够提 高传感器的灵敏度和选择性，还能避免非特异性的吸附，有效地控制探针在电极 表面的覆盖度、固定方向及其稳定性，并保持其与待测分子结合的活性和特异性。 d n a 在传感器表面的固定方法主要有：吸附法、共价键合法、生物素一亲和素法、 自组装法和组合法等。 ( 1 ) 吸附法：吸附法是一种最简单的固定d n a 的方法，因为它不需要进行任 何核酸链的修饰，而且速度快，不需要特殊的试剂，无需对固定的d n a 进行修饰 衍生化，费用低廉，且电极表面易于更新。但是它不是共价键合，很难消除非特 异性吸附，且在杂交过程中可能脱附，而且d n a 结构会发生扭曲，使固定的d n a 无法进行杂交，因而杂交效率很低，甚至使正确杂交变得困难。 吸附法通过非共价键作用将d n a 直接吸附或恒电位吸附固定在电极表面，或 由d n a 的磷酸根负离子与电极表面带正电荷的修饰层通过静电作用而固定。主要 包括以下几种方法：静电吸附法【1 0 1 1 、物理、化学吸附法【1 0 2 1 、电化学富集【1 0 3 】以及 l a n g m u i r b l o d e g e t t ( l b ) 膜【1 0 4 1 。 ( 2 ) 共价键合法i 共价键合法是固定探针比较理想的方法，在制备d n a 电化 学生物传感器中得到广泛应用。目前共价键合法已普遍用于d n a 传感器的研制， 即在电极表面上引入活性基团，也可对d n a 进行修饰，在d n a 末端引入活性基 团，然后通过共价键合将d n a 固定到电极上。根据不同的电极表面，可以采用不 同的键合方法。 对于金电极，主要是通过化学吸附作用，利用巯基基团与贵金属表面的高亲 和力在金硫原子之间以共价结合的形式结合。 r _ s h + a u _ k s a u + e - + h + 一种方法是在金电极表面通过带有巯基的小分子形成一层单分子膜，通过此 单分子膜与标记探针进行化学键合，将探针固定到电极表面1 1 0 5 】。另一种方法是将 巯基标记的探针直接固定到金电极表面【1 0 6 j 。 共价键合法制备的d n a 修饰电极具有明显的优越性，比如修饰层稳定有序， d n a 分子与电极单点连接，运动灵活度较高，易于分子杂交，而且固定的探针往 往可通过热解再生。但是也存在缺点，由于电极表面活性位点较少，表面键合又 硕上学位论文 是异相反应，因而电极表面固定的d n a 量较少，所以响应信号较小。而且经化学 修饰的碳质电极表面易被玷污，电极表面的更新处理步骤繁琐。 ( 3 ) 生物素一亲和素法：生物素一亲和素体系( b a s ) 是通过生物素一亲和素的 特异性结合，在一定范围内敏感膜可制成有序的层次结构，生物素一亲和素偶联 固化单链d n a ( s s d n a ) ，具有较高的识别灵敏度。b a s 的固定化有多种形式：亲和 素可直接不可逆地吸附至j j a u 、a g 等电极表面形成亲和素单分子层；生物素也可以 吸附在电极表面形成生物素分子固定层。一般情况下是将亲和素共价偶联或通过 静电吸附到支持物上，随后将生物素连接的d n a 通过生物素和亲和素之间的专一 性亲合作用而固定 1 0 7 , 1 0 5 】。该法制作的传感器一致性、特异性都较好，杂交后的电 极再生可重复使用，因此在生物传感器领域中越来越受到重视。 ( 4 ) 自组装膜法：基于分子的自组装作用，在固体表面自然形成高度有序的单 分子层的方法，一般以金电极为基体电极，在探针上衍生s h 基团，利用s h 在干 净的金电极表面的化学吸附来固定d n a 分子。h a s h i m o t o l l 0 9 】等首次在含2 0 个碱 基s s d n a 的5 端修饰h s ( c h 2 ) 2 一，将预处理过的金电极浸入连有巯乙基的d n a 探针溶液中，4o c 连续搅拌1 2h ，将d n a 探针固定到金电极表面，对目标d n a 的检出限可达1 0 以6g l 。自组装膜法得到的s s d n a c m e 表面高度有序，稳定性 好，在适当的固定密度下，对互补d n a 有很好的杂交效率；但它对巯基修饰的 d n a 纯度要求较高，分离提纯操作繁琐，并且有一定非特异性吸附结合。 ( 5 ) 组合法：组合法即将上述两种或两种以上的固定方法结合起来固定d n a 分子，如自组装法与吸附法、吸附法与共价键合法相结合等。利用组合法在电极 表面固定d n a ，结合了各固定方法的优点，制备的d n a 化学修饰电极有