（外科学专业论文）kiss1蛋白和βcatenin在胃癌中的表达及临床意义.pdf

目录 | | | | i i i i l | i i f | i 舢删m 0 y 19 0 0 8 7 4 中文摘要1 英文摘要4 研究论文k i s s 1 蛋白和b c a t e n i n 在胃癌中的表达及临床意义 前言：8刚吾、8 材料与方法8 结果l l 附图1 3 附表1 5 讨论1 7 结：论2 0 参考文献2 1 综述k i s s 1 蛋白和b c a t e n m 在胃癌中的表达及临床意义的研究进展 ：2 3 致谢3 5 个人简历3 6 l 中文摘要 k i s s 1 蛋白和b c a t e n i n 在胃癌中的表达及临床意义 摘要 目的：恶性肿瘤已成为严重影响人类健康和生命的因素，目前全世界 每年死于癌症的病人高达七百万人，且每年呈上升趋势，其中死于胃癌的 患者占了7 0 万例。胃癌作为消化道肿瘤最常见的肿瘤，全球每年新发病 例九十三万四千例，4 2 ( 近4 0 万) 的新发病例数在我国，胃癌形势已 十分严峻。但是目前胃癌的确切发病机制尚不明确，随着分子生物学技术 的广泛应用，胃癌的分子遗传学特征逐渐被了解。目前，已经确认胃癌的 发生是一个多基因多因素多步骤的复杂过程。 k i s s 1 基因是一个肿瘤转移抑制基因，研究表明它与人类多种恶性肿 瘤发生发展相关在恶性肿瘤的浸润和转移过程中发挥重要作用。在人类多 种正常组织如心脏、脑、肝脏、胎盘、肾脏、骨骼肌和胰腺中均可检测到 k i s s 1 的存在。 b 链蛋白( b c a t e n i n ) 是e 钙粘蛋白连接素复合体( e c a d h 耐n c a t e - n i n s ) 的重要组成部分，它在维持正常上皮的极性和完整性中起重要作用， 表达异常时，细胞间粘附力下降，在转移灶中再表达，导致胃癌的发生发 展。b c a t 作为复合体功能调控的重要环节，不仅介导同种细胞间的粘附， 还可以通过w n t f r i z z l e d 受体通路，介导w n t 信号的核转移、原癌基因的 激活，进而诱导细胞恶变和肿瘤发生。 本实验通过对胃癌组织、癌旁组织、正常胃粘膜组织中k i s s 1 和b c a t e n i n 的检测，探讨l 【i s s 1 和b c a t e n i n 之间的关系，姑s s 1 和b c a t e l l i n 在胃癌的发生发展中起的作用及与临床病理特征之间的关系，从而为胃癌 的诊断、治疗提供依据及线索。 方法：应用免疫组织化学过氧化物酶标记链霉卵白素法( s p ) 法检 测4 5 例胃癌组织、4 5 例癌旁组织及2 0 例正常胃粘膜组织中飚s s 1 蛋白、 b c a t e n m 的表达并结合患者的年龄、性别、分化程度、淋巴结转移等临 床病理因素进行综合的分析。采用s p s s l 3 o 统计软件进行统计学数据处 理，计数资料用x 2 检验，p o 0 5 时为差异具有统计学意义。应用非参数 统计中s p e 锄a n 等级相关对二者在胃癌中的表达相互间关系进行分析。 中文摘要 所用试剂：鼠抗人k i s s 1 单克隆抗体购自美国s a n t ac i u z 公司，工 作浓度1 ：4 0 0 ，兔抗人b c a t e n i n 抗体购自b i o w o r d 公司，工作浓度为1 ： 1 5 0 。s p 免疫组化试剂盒购自北京博奥森公司。d a b 显色试剂盒购自北 京中杉金桥生物技术有限公司。 结果： 1 瞄s s 1 和b c a t e n 访在胃癌组织、癌旁组织及对照组织中的表达 1 1k i s s 1 在正常胃粘膜组织中为高表达，其阳性表达率为9 0 ( 1 8 2 0 ) ， 在癌旁组织阳性表达率为6 4 4 4 ( 2 9 4 5 ) ，在胃癌中表达率为4 8 8 9 ( 2 2 4 5 ) ，l ( i s s 1 蛋白在正常胃黏膜组织的阳性表达率显著高于癌旁组织， 有显著性差异( p o 0 5 ) ，在癌旁组织阳性表达率高于胃癌组织，结果有 显著性差异( p o 0 5 ) 。 1 2b c a t e n i n 在正常胃粘膜中正常表达率为l o o ( 2 0 2 0 ) ，在癌旁组织阳 性表达率为4 6 6 7 ( 2 1 4 5 ) ，在胃癌中表达率为3 3 3 3 ( 1 5 4 5 ) ，b c a t e n i n 在正常胃黏膜组织的表达率显著高于癌旁组织，差异有显著性( p o 0 5 ) ， 在癌旁组织中的表达率高于胃癌组织，差异有显著性( p o 0 5 ) 。 2 胃癌组织中飚s s 1 和b c a t e n i n 蛋白表达与临床病理特征之间的关系 2 1 h s s 1 在侵及浆膜层的胃癌中阳性表达率为3 4 6 2 ( 9 2 6 ) ，明显低于未 侵及浆膜层的胃癌中的阳性表达6 8 4 2 ( 1 3 1 9 ) ；s s 1 在有淋巴结转移 的胃癌中阳性表达率为3 5 7 1 ( 1 0 2 8 ) ，明显低于无淋巴结转移的胃癌中 的阳性表达7 0 5 9 ( 1 2 1 7 ) ( p o 0 5 ) 。 2 2b c a t e n i l l 在高中分化的胃癌中阳性表达率3 8 7 0 ( 1 2 31 ) ，高于在低分 化中胃癌的阳性表达2 1 4 3 ( 3 1 4 ) ( p o 0 5 ) ，b c a t e m n 在侵及浆膜层的 胃癌中阳性表达率为4 6 1 5 ( 1 2 2 6 ) ，明显高于未侵及浆膜层的胃癌中的 阳性表达1 5 7 9 ( 3 1 9 ) ( p o 0 5 ) ，b c a t l ：m n 在有淋巴结转移的胃癌中 阳性再表达率为1 7 8 6 ( 5 2 8 ) ，明显低于无淋巴结转移的胃癌中的阳性 表达5 8 8 2 ( 1 0 1 7 ) ( p o 0 5 ) 。 3 k i s s 1 和b c a t e n i n 在胃癌表达中的相互关系 运用s p e 锄a n 等级相关分析，结果飚s s 1 与b c a t e n i n 的表达呈正相关 ( r s = o 5 0 2 ，p o 0 1 ) 中文摘要 结论：( 1 ) k i s s 1 在正常胃粘膜组织中呈高表达且与肿瘤的浸润深度、 淋巴结转移密切相关。k i s s 1 在未侵及浆膜的胃癌中的表达明显高于侵 及浆膜的胃癌中的表达；在有淋巴结转移的胃癌中的表达明显低于无淋巴 结的胃癌中的表达。( 2 ) b c a t e n i n 在正常胃粘膜组织中定位于细胞膜， 呈高表达，且与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移密切相关。b c a t e n i n 在高中分化的胃癌中的表达明显高于在低分化胃癌中的表达；在 侵及浆膜的胃癌中的表达明显高于侵及未浆膜的胃癌中的表达在有淋巴 结转移的胃癌中的表达明显低于于无淋巴结的胃癌中的表达。( 3 ) k i s s 一1 和b c a t e n m 在胃癌中的表达呈正相关，二者在胃癌中的发生发展中起重 要的作用。s s 1 、b c a t e n i n 可能与胃癌的发生发展、浸润转移及预后密 切相关，联合评价其功能有重要的临床意义。 关键词：b 链蛋白；鼬s s 1 ；胃癌；免疫组织化学；基因表达。 a n d1 3 l c a t e n i n i m p a c to nh 啪a n y e a rd i eo f c a n c e r p a t i e m si n 也ew o r l d ，a n dt h en u m b e ri si n c r e a s i n ge a c hy e 碣i nw h i c h 也e p a t i e m s d i e do fg a s m cc a r c i n o m aa c c o u m e df o r7 0 0 ，o o oc a s e s g a s 仃i c c a r c i n o m aa s 也em o s tc o m m o nc a l l c e ri ng a s t r o i n t e s t i n a lm m o r s ，m e r ea r e 9 3 4t h o u s a n dc a s e sn e wc a s e se a c hy e a rw o r l d w i d e ，4 2 ( n e a r l y4 0m i l l i o n ) t h en u m b e ro fn e wc a s e si si nc h i n a ，m es i t u a t i o nh a sb e c o m ev e 拶 s e r i o u s b u tn o wm ee x a c tp a m o g e n e s i so f g a s t r i cc a r c i n o m ai su n c l e a r ，w i t h m e w i d e l y 印p l i c a t i o no fm o l e c u l a rb i 0 1 0 9 y m 0 1 e c u l a rg e n e t i c so fc a n c e rh a v e b e e ng r a d u a l l yu n d e r s t o o d 。a tp r e s e n t ，h a sc o n f i n n e dt h a t 血eo c c u r r e n c eo f g a s t r i c c a r c i n o m ai sm o r em a nag e n ef a c t o ra n dm u l t i - s t 印c o m p l i c a t e d p r o c e s s o k i s s - lg e n ei sat u m o rm e t a s t a s i ss u p p r e s s o rg e n e ，s t u d i e sh a ss h o w nt h a t i ti sr e l a t e dt 0m ed e v e l o p m e n ta n do c c u r r e n c eo fm a n ym a l i g n a l l tt u m o r s i t p l a y s 觚i m p o r t a n tr o l ei nm ep r o c e s so fi n v a s i o na n dm e t a s t a s i s av a r i e t yo f n o n n a lt is s u e s ，s u c ha si i lt h eh u m a l lh e a r t ，b r a i n ，l i v e r ，p 1 a c e n t a ，l ( i d n e y s k e l e t a lm u s c l ea n dp a n c r e a sc a nb ed e t e c t e di nm ee x i s t e n c eo f 姑s s - 1 p c a t e n 访( p c a t ) i s a n i m p 供t a n tp a r to fn l ee c 础1 e r i l l c a t e n i n c o r n p l e x ， i tp l a y sa ni m p o n a u l tr o l ei nt 1 1 em a i n t e n a n c eo fn o n n a le p i t h e l i a l p 0 1 a d 够2 u l di n t e g r i 够i t sa b n o 衄a le x p r e s s i o nc a nm a k e st h ed e c l i n eo f a d h e s i v ef o r c eb e 铆e e nc e i l sa 1 1 dr e e x p r e s s i o ni nm e t a s t a s i s ，1 e a d i n gt 0m e d e v e l o p m e n to fg 砌c c a n c e r a sm ei m p o 胁1 tl i n l ( o fc o m p l e x 胁c t i o n s ， p c a tc a tn o to n l ym e d i a t e d s 跃m e s i o nb e t w e e n 也es 锄ec e l l s ，b u ta l s oc a n i n d u c e sm en u c l e a rt r a n s f e ro fw n t s i g n a la n dp r o t o c a r c i n o g e l l i cg e n et h r o u 曲 w m f r i z z l e dr e c e p t o rp a t h w a y s ，a tl a s ti n d u c e sm ea c t i a t i o no fm a l i 萨a m c h a n g ea n dc a n c e rc e l l s 4 i nt h i se x p e r i m e n t b yd e t e c t i n gt h ee x p r e s s i o no fk i s s 1a n dp c a t e n i nm g a s 协cc a r c l n o m a ， c a n c e ra d ja c e n tt i s s u e sa n dn o 肌a lg a s t r i cm u c o s a t i s s u e ， t h l sp 印e rd i s c u s s e dt l l er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ek i s s 1a n dd c a t e n i n ，a n d d l s c u s s e dt h er o l eo fk i s s - 1a 1 1 d p c a t e n i ni n 也ed e v e l o p m e n ta n dt h e r e l a t i o n s h i pb 舐v e e nc l i n i c o p a m o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ， s o 舔t op r o v i d e d t h eb a s i sf o rd i a g n o s i sa n d 讹a ：t m e n to f g a s t r i cc a r c i l l o m a m e t h o d s ：i m m u n o h i s t o c h e m i c a l ( s t r 印t a v i d i n p e r o ) ( i d a s e ，s p ) t e c h n i q u e w a sa p p i l e dt 0d e t e c t e dm e e x p r e s s i o no fk i s s 一1a n dp c a t e n i ni n4 5c a s e so f g a s t n cc a r c i n o m a 、4 5c a s e so f 也ep r o x i i 工l a la d ja c e n tt i s s u e sa n d2 0c a s e so f n o n n a jg a s t n cm u c o s a ，a n dt h ec o m p r e h e n s i v e a n a l y s i so fc o m b i n e dw i t ht h e p a t l e n t s a g e ， g e n d e r ， i n f i l t r a t i o n d e g r e e ，l y m p hn o d em e t a 妣s i s c l i n i c o p a m o l o g i c a lf a c t o r sa 1 1 ds oo n u s i n gm es 枷s t i c a ls o 腑a r es p ssl3 0 跏i s t i c a ld a t ap r o c e s s i n g ，c o u n t w l m 贮t e s t ， p o 0 5i s 蚴i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t na n a i y s e dt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fb o mm g a s 仃i cc a r c 洫o m ab yu s i n gs p e a n n a nr a n k c 咐d l a t i o n g 、h i c hi so n eo fn o n - p 聪吼e t e rs t a t i s t i c s r e a g e n t su s e d ： m o u s e a n t i - h 啪a nk i s s - 1m o n o c l o n a la n t i b o d yw a s p u r c h a s e d 仔o ms a n t ac r u z c o r n p a u l y ， 1 t s w o r l ( 1 1 1 9c o n c e n n a t i o ni sl ：4 0 0 ，r a b b i ta n t i h u m a nb c a t e n i n a n t l b o d yw a sp u r c h a s e d 舶mb i o w o r dc o m p a n y ， i t s w o r k i n gc o n c e 删i o n i s1 ：15 0 s pi m m u n o h i s t o c h e m i s t 】秒h tw a s p u r c h a s e d6 o mb e i j i n gb o a os e n c o 印o r a t i o n ， d a bc o l o rr e a g e n tl ( i tw a s p u r c h a s e d 仔o mb e i ii n gz h o n g s h 锄 g o l d e nb r i d g eb i o t e c h n o l o 星c o ，l t d r e s u l t s ： 1t h ee x p r e s s i o no fk i s s 一1a n dp c a t e i l i ni n g a s t r i cc a n c e rt i s s u e s ，a d ja c e n t t i s s u e sa n dc o n t r 0 1t i s s u e s 1 lk i s s - 1 i nn o n i l a lg a s t r i cm u c o s as h o w e d h i g h e x p r e s s i o n ，t 1 1 ep o s i t i v er a t e w a s9 0 ( 1 8 2 0 ) ，廿1 ep o s i t i v ee x p r e s s i o n0 f 飚s s 1i nm ep r o x i m a la d i a c e n t t i s s u e sw a s6 4 4 4 ( 2 9 4 5 ) ，i 1 1g a 矧cc a r c i n o m aw a s4 8 8 9 ( 2 2 4 5 ) i n n o n n a lg a s t r i cm u c o s a ，也e p o s i t i v ee x p r e s s i 彻r a t eo f1 ( i s s 1w a s s i 鲥丘c a n t l y h i 曲e rm a nn l ep r o x i m a l a d ja c e n t t i s s u e sm ed i 妇凫r e n c ew a ss i g n i f i c a m ( p o 0 5 ) ，也ee x p r e s s i o ni nt h ep r o x i m a l la d j a c e mt i s s u ew a s h i 曲e rt h a n 4 6 6 7 ( 2 1 4 5 ) ，n o n n a l l ye x p r e s s e di ng a l s t r i cc a n c e rw a s3 3 3 3 ( 1 5 4 5 ) ， p - c a t e n i ni nt 1 1 en o 珊a le x p r e s s i o no fn o 肌a lg a s t r i cm u c o s aw a s s i g l l i f i c a n t l y h i 曲e rt h a n 如a to fm ep r o x i m a la 由a c e mt i s s u e s ，t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ( p o 0 5 ) ，t h ep r o 妇m a le x p r e s s i o ni nc a l l c e rt i s s u e si sh i 曲e rm a n 廿1 en o h n a l g a s 砸ct i s s u e ，也e r ew a sas i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p o 0 5 ) r 1 一叶1o 一 ：zin er e l a t l o n s h l pb e 觚e e nt 1 1 e e x p r e s s i o no fb o t l lk i s s 1a 1 1 db c a t e n i ni i l g a s t r i cc a n c e ra n dm e c l i n i c o p a t h o l o g i cf e a t u r e so fg a s t r i cc a n c e r 2 1n e p o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo fk i s s 1 i ni n f i l t r a t i n gs e r o s ao fm eg a s t r i c c a n c e rw a s 3 4 6 2 ( 9 2 6 ) ) ，s i g n i f i c a n t l yl o w e rm a l lt 1 1 a to f n o ti n v a d i n gt h e s e r o s a ， t 1 1 e p o s i t i v ee x p r e s s i o ni s6 8 4 2 ( 13 19 ) t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o n r a t eo fk i s s 一1i ng a s t r i cc a n c e rw i t l l 1 y m p hn o d em e t a s t a s i s 、v a s3 5 7 1 ( 12 17 ) ，、h i c hw a ss i g n i f i c a l l n yl o w e rm a nm a tw i t h o u t1 y m p hn o d e m e t a s t a s i s ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o ni s7 0 5 9 ( 1 o 2 8 ) ( p o 0 5 ) 2 2 t h e p o s i t i v e e x p r e s s i o n o f p c a t e n i l l i nd i 船r e n t i a t e da n d w e l l d i f j f e r e n t i a t e d g a s t r i cc a l l c e rw a s3 8 7 0 ( 1 2 31 ) ，s i g n i f i c a m l yh i g h e r 也a ni n p o o r l yd i 虢r e n t i a t e dg a s 仃i cc a n c e r ，t h ep o s i t i v er e e x p r e s s i o nw a s 2 1 4 3 ( 3 1 4 ) ( p o 0 5 ) ，n ep o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo fp c a t e n 洫i 1 1 i n f i l 仃a t i n gs e r o s ao fm eg a s t r i cc a n c e rw a s w a s4 6 15 ( 12 2 6 ) ，s i 趴i f i c a n t l y h i 曲e rt 1 1 a 1 1m a to fg a s t r i cc a n c e ri n v a d i n gt h es e r o s a ，m e p o s i t i v ee x p r e s s i o n w a sl5 7 9 ( 3 l9 ) ( p o 0 5 ) n ep o s i t i v ee x p r e s s i o nm t eo fb c a t e l l i ni 1 1 g a s t 订cc a n c e rw i t l ll y m p hn o d em e t a s t a s i sw a s17 8 6 ( 5 2 8 ) ，、v h i c hw a s s i g l l i f i c a n 廿y1 0 w e rt 1 1 a nt 1 1 a tw i 也o u tl y m p hn o d em e t a s t a s i s ，t h ep o s i t i v e e ) i p r e s s i o ni s5 8 8 2 ( 1 0 1 7 ) ( p o 0 5 ) r t lo 3lh er e l a t l o n s h l pb e t w e e n 血ee x p r e s s i o no fl ( i s s l a n dp c a t e n i l li i lg a s t r i c c a r c j n o m a 一 英文摘要 二工一一 u s i n gs p e a r m a nr a m ( c o r r e l a t i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm ek i s s 1a 1 1 d p 。c a t e n i ne x p r e s s i o ni ng a s t r i cc a r c i n o m aw a s p o s i t i v e l yc o 玎e l a t e d ( r s = o 5 0 2 ， p 0 ，0 5 ) c o n c l u s i o n s ：( 1 ) t h ee x p r e s s i o no fk i s s 1 洫n o n l l a lg a s t r i cm u c o s a s 上1 0 w e dh i 曲e x p r e s s i o na n di tw a s c l o s e l yr e l a t e dt ot h ed e p t ho fi n v a s i o na n d l y 1 p hn o d em e t a s t a s i s ；t h ee x p r e s s i o no fk i s s 1 协w i t h o u ts e r o s a l i n v a s i o n m g a s 仃l cc a l l c e rw a ss i g n i f i c a n t l yh i 曲e rt 1 1 a 1 1i ns e r o s a li n v a s i o n ：t h e e x p r e s s i o no fk i s s 一1i ng a s t r i cc a r c 访o m aw i t hl y m p hn o d e sm e t a s t a s i sw a s s l g n l n c 觚t l yl o w e rm a ni ng a s t r i cc a l l c e rw i t l l o u tl y m p hn o d e s m e t a s t a s i s ( 2 1 p c a t e n mw 2 u sl o c a t e di nm em e m b 啪ei nn o m a lg a s t r i cm u c o s a ， i tw a s h 1 曲i ye x p r e s s e da n dc l o s e l yr e l a t e dt ot h ed e g r e eo ft u m o rd i f r e r e n t i a t i o n d e p t 王1o fi 1 1 v a s i o na n dl y m p hn o d em e t a s t a s i s ；t h ee x p r e s s i o no fp c a t e n i ni i l d i 位r e n t i a t e da n dw e l l d i 讯i r e m i a t e dg a s 饿cc a n c e rw a sh i 曲e rt h a n t l a ti n p o o r l yd i 虢r e n t i a t e dg a s t r i cc a r c i n o m a ；t h ee x p r e s s i o no 邛c a t e n i n 加w i m o u t s e r o s a jl n v a s l o nm g a s t r i cc a l l c e r 、v a ss i g l l i 6 c a n t l yh i 曲e r 也a n 蛔s e r o s a i i i l v a s i o n ；t h ee x p r e s s i o no f p c a t e n i ni ng a s t r i cc 2 u r c i n o m aw i ml y m p hn o d e s m e t a s t a s l sw a ss i g n i f i c a m l yl o w e rt h a n i ng a s t r i cc a n c e rw i t h o u t1 y m p h n o d e s m e t a s 诅s i s ( 3 ) n l ee x p r e s s i o no fk i s s 1a n dp c a t e n i ni ng a 嘶cc 2 u l c e r w a s p o s l t l v e l yc o r r e l a t e db o t hp l a y 觚i m p o m l r i tr o l ei nm ed e v e l o p m e n to f g a s t r l c c a n c e rk i s s - 1a n d p c a t e n i nm a yb e c l o s e l y r e l a t e dt om e d e v e l o p m e n t 、 m v a s l o n 、 m e t a s t a s i sa n dp r o g n o s i so f g a s t r i cc a r c i l l o m a ，也e j o i n te v a l u a t i o no f m e i rm n c t i o nh a si m p o r t a n tc l i n j c a ls i g l l i f i c a n c e k e yw o r d s ：p c a t e n i n ；k i s s l i m m u n o h i s t o c h e m i s 乜y ；g a s t r i cc a r c i n o m a ；g e n ee x p r e s s i o n ； 研究论文 l ( i s s 1 蛋白和b c a t e n i n 在胃癌中的表达及临床意义 - 屿l 刖罱 胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国呈逐年递增， 已经成为影响人们身体健康的重要因素。迄今为止，胃癌的确切发病机制 仍不十分确定，大量研究已经表明，胃癌的发生、发展与抑癌基因的表达 下降有重要关系，胃癌的高死亡率与其复发、转移联系密切。 k i s s 1 是于黑色素瘤细胞株中发现的肿瘤抑制基因，在大部分的正常 组织及非转移性细胞中中均有表达，而在有转移的肿瘤组织中出现表达缺 失。研究证明，b 链蛋白( b c a t e n i n ) 在维持细胞正常上皮的极性和完 整性中有重要作用，它的异常表达，导致细胞间粘附力下降，进一步导 致胃癌的发生发展。 本实验采用了免疫组织化学的方法( s p 法) ，对4 5 例胃癌、癌旁组 织( 距癌组织5 c m ) 及2 0 例正常组织( 如溃疡病需手术切除) 进行瞄s s 1 及b c a t e n i l l 蛋白表达的检测，观察这两种肿瘤相关基因在胃癌组织中的 表达情况，探讨k i s s 1 及b c a t e n i ni 临床病理特征之间的关系，进一步研 究胃癌的发生发展机制。 材料与方法 1 标本收集 收集河北医科大学附属第二医院2 0 0 9 年3 月2 0 1 0 年3 月手术切 除的胃癌病理标本共4 5 例，取患者胃癌组织、癌旁组织( 距癌组织5 c m ) ， 2 0 例正常胃组织( 为外伤、溃疡病需手术切除的正常胃组织) 。4 5 例胃癌 中其中男15 例，女3 0 例，年龄3 6 7 8 岁，平均5 3 3 8 岁。4 5 例胃癌标本 中，按有无淋巴结转移分为：转移组2 8 例和无转移组1 7 例；按浸润深度 分为：浆膜层2 6 例和未达浆膜层1 9 例。所有入选病例皆未进行过放、 化疗，无长期服用非甾体抗炎药，皮质激素类药物史。 2 主要试剂 鼠抗人k i s s 1 单克隆抗体美国s a n t ac r u z 公司 免疫组化试剂盒 d a b 法显色试剂盒 3 主要仪器设备 石蜡切片机 电子显微镜 微量移液器一套 电热恒温干燥箱 恒温水浴箱 微量震荡器 医用微波炉 z p j 1 型展片机 离心机 医用冰箱 8 0 低温冰箱 自动三蒸纯水蒸馏器 电子天平 长沙e 1 e c t r 0 1 u x 公司 日本s a n y o 公司 上海亚荣生化仪器厂 德国s a n o r i u s 公司 4 实验方法：s p 免疫组织化学法 4 1 蜡块制作及试剂配制：所取的标本经福尔马林溶液( 1 0 0 m m o l l ) 固定 2 4 小时，修整组织块，依次放入乙醇甲醛液( a f ) 1 2 小时、7 0 乙醇6 小时， 8 0 乙醇6 小时、9 5 乙醇i1 2 小时、9 5 乙醇i il 小时、l o o 乙醇i1 5 小时、1 0 0 乙醇i i1 5 小时脱水，松节油i1 5 分钟、松节油i i15 分钟， 浸蜡i1 5 分钟、浸蜡i i3 5 小时，包埋，修整蜡块后，备用。 试剂：p b s 缓冲液：n a 2 m 0 4 1 4 5 9 ，n a h 2 p 0 4 1 5 9 ，氯化钠4 2 5 9 ，溶 于蒸馏水5 0 0 0 m l 。抗原修复液：柠檬酸o 1 9 ，柠檬酸三钠o 7 5 9 ，溶于2 0 0 m 1 蒸馏水中。3 双氧水：3 0 h 2 0 2 溶液6 础，甲醇溶液1 9 4 m 1 ，混匀。 4 2 蜡块经4 岬连续切片后，贴于载玻片( 预先涂有多聚赖氨酸a p e s ) 上，烘烤2 4 小时( 6 5 ) 。 4 3 脱蜡：二甲苯( 15 分钟3 ) ，分别置于酒精1o o i 、l o o i i 、 9 5 i 、9 5 i i 各5 分钟。 4 4 自来水冲洗5 分钟。 4 5 阻断内源性过氧化物酶的活性：将载玻片置于3 过氧化氢溶液室温 研究论文 孵育1 5 分钟。 4 6p b s 冲洗2 次，每次2 分钟。 4 7 抗原修复：将切片置于枸橼酸盐缓冲液( o 1 m ，p h6 o ) 中，微波炉加热 并保持9 2 9 8 1 5 分钟。取出，室温放置3 0 分钟使其自然冷却。 4 8p b s 溶液冲洗3 次，每次5 分钟。 4 9 滴加5 正常山羊血清封闭，置于保湿盒中室温3 7 孵育半小时，滤 纸吸净多余封闭液，不洗。 4 1 0 加一抗：用p b s 适当比例稀释一抗，其中k s s 1 工作浓度1 ：4 0 0 ，b c a t e n i n 为1 ：1 5 0 。空白对照：以p b s 溶液代替一抗，切片置于湿盒中3 7 恒温水浴箱中过夜。 4 1 1 第二天，取出切片p b s 冲洗3 次，每次5 分钟。 4 1 2 加入二抗：滴加生物素标记的二抗，置于保湿盒中水浴箱( 3 7 ) 孵 育3 0 分钟。 4 1 3p b s 冲洗3 次，每次5 分钟。 4 1 4 滴加辣根酶标记链酶卵白素，保湿盒中水浴箱( 3 7 ) 孵育3 0 分钟。 4 1 5p b s 液冲洗3 次，每次5 分钟。 4 1 6d a b 显色：先后取d a b 试剂盒中a 液、b 和c 液各一滴加入l m l 双蒸水中，振荡器混匀，显微镜下统一观察。 4 1 7 蒸馏水水终止显色。 4 1 8 苏木精复染2 分钟，蒸馏水充分洗涤，置于1 盐酸酒精中分化约2 秒，至入蒸馏水洗涤去分化，放入2 氨水返蓝2 5 秒，至蒸馏水洗涤后， 脱水：梯度酒精7 0 、8 0 、9 0 各5 分钟，l o o i 、1 0 0 i i 酒精各1 0 分钟，二甲苯透明2 次，每次5 分钟，最后树胶封片。 4 1 9o l y m p u s 光学显微镜观察结果并摄片。 结果观察及判定：k i s s 1 免疫组化染色胞质出现棕黄色颗粒为阳性， 显色强时为棕褐色。判定结果根据文献报道眨。1 ，采取综合计分的方法： 将阳性细胞占肿瘤细胞总数百分比和染色程度联合计分。阳性细胞比例计 分标准： 5 0 为3 分；染色强弱计分标准： 阴性为o 分，淡黄色染色为1 分，中度黄色染色为2 分，棕褐色染色为3 分。 二者之积计总分：总分 3 分为阴性，3 分为阳性。b c a t e 血主要表达于 上皮细胞细胞接触侧的胞膜上，免疫组化染色棕黄色细颗粒状为正常表 研究论文 达，p c a t e n i n 也可在胞质、胞核出现异常表达。判定标准【4 】为：把染色的 结果以o 3 分记录。o 分为细胞膜，细胞质均未染色；1 分：染色以细胞质 为主；2 分表现为细胞膜细胞质的混合染色；3 分为细胞膜的连续性染色。 将连续的细胞膜染色视为正常阳性染色，将染色不连续，明显减弱或缺失， 或出现胞浆、胞核染色情况的o 分2 分视为异常染色( 阴性) 。 4 2 0 统计学处理 应用s p s s17 o 统计软件包对所得数据进行统计学分析，使用贮检验 计算p 值，分析胃癌组织与正常组织表达的差异。检验标准仅= o 0 5 ，p o 0 5 为差异具有统计学意义。使用s p e 煳a n 秩相关分析，检验标准萨o 0 5 ， p o 0 5 为差异有显著性。 结果 1k i s s 1 和b c a t