（分析化学专业论文）智能激光扫描共聚焦显微镜的设计及其在微生物分析中的应用.pdf

摘要 本论文共分为六个部分。对近二十年来的微生物分析手段进行了综述，基于激光扫描 共聚焦显微镜技术，设计了一套用于微生物研究的自动化分析手段，提出了一种微生物记 数的数据修约算法，并分别探讨了它们的应用。 第一部分本节对不同的微生物分析手段展开了评述，包括直接检测法、菌落计数法、 最可能数法、浊度法和电化学方法，并对一些新兴的技术在该领域中的应用作了讨论。包 括荧光标记技术、激光扫描共聚焦显微镜、图象处理技术等，此外，针对现今的抗菌研究 热点，简要论述了介孔t i 0 2 光催化原理及其在抗菌研究中的应用。 第二部分在本节工作中，基于激光扫描共聚焦显微镜技术，针对微生物分析的需要， 开发了一种新的微生物自动分析技术，并将这一技术命名为“智能激光扫描共聚焦显微镜” f i n t e l l i g e n tc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y , i c l s m ) ，该技术主要包括3 个方面：微生物 的荧光标记、微生物的激光扫描共聚焦成像以及激光扫描共聚焦图象的信息提取与修约。 同时，针对细菌的分布特点，结合i c l s m 技术，对传统的权重平均法加以改进与简化，提 出了一种新的数据修约方法，该算法兼顾了数据的平均值和分布情况。相对于普通的算术 平均法，该算法可以提供更具代表性的细菌浓度值。 第三部分微生物活性的定量分析，是评价抗菌材料性能的常用手段。在本节工作中， 我们利用i c l s m 技术，研究了介孔结构t i 0 2 膜的抗菌性能。通过实验对比证明，i c l s m 技术的精确性、便捷性、可靠性与兼容性均要优于传统的平板记数法。 第四部分本章工作中，利用i c l s m 技术，我们通过介孔a g t i 0 2 材料与其他材料的 对比实验，研究了a g t i 0 2 在不同条件下的抗菌活性，为深入探讨沉积的纳米银颗粒与t i 0 2 各自在抗菌反应所起的作用，我们分别选择普通大肠杆菌株与耐银大肠杆菌株进行抗菌实 验，并综合实验现象，探讨介孔a g a i 0 2 材料的复合抗菌机理。 第五部分本章工作尝试通过i c l s m 代替人工获取细菌的特征参数，结合s p s s 统计 软件，对2 0 0 0 个乳酸菌的面积分布形式，以图表的方式加以描述，结果令人满意。 第六部分本章工作中，我们通过i c l s m ，选择青霉素和链霉素为模型，从细菌生长 动力学过程的角度，分别对这两种常见抗生素在乳酸菌发酵过程中的影响做了较为具体的 研究，并综合实验结果，推测其内在机理。 关键词：微生物分析；激光扫描共聚焦显微镜；图象分析；抗菌；荧光标记 t h ed e s i g no fi n t e l l i g e n tc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y 、a n di t s a p p u c a f i o ni nm i c r o b i a la n a l y s i s a b s t r a c t a ni m p r o v e dm e t h o df o rf a s tb a c t e r i a la s s e s s m e n tw i t hd e t a i l e di n f o r m a t i o ni sag r e a tc h a l l e n g e o fm i c r o b i a le x p e r i m e n tr e v o l u t i o no v m r ) f o re x a m p l e ，t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fac o m p o s i t e i sg e n e r a l l ye v a l u a t e db yi t sm i c r o b i a lt e s t t h et r a d i t i o n a lm e t h o di st h es t a n d a r dp l a t ec o u n t m e t h o d i ti sa ni m p r e c i s ea n dt i m e - c o n s u m i n gs u b j e c t i v ep r o c e s s ( 1d a y o rm o r e ) w h e nl a r g e n u m b e r so f b a c t e r i aa r ep r e s e n t ，f o re x a m p l e , u s i n gac o n c e n t r a t i o no f1 0 5c o l o n yf o r m i n gu n i t s ( c f u ) b a c t e r i a ld i l u t i o n , t h e r ea r en e a r l yt h o u s a n dc o l o n i e so ne a c hp l a t e ，t h er e l i a b i l i t yo f t h e r e s u l ti sam a j o rp r o b l e mo ft h i sm e t h o d i na d d i t i o n ；o n l ys e v e r a lh u n d r e dc e l l sa r eg e n e r a l l y c o u n t e di no n ep l a t e 。w h i c hm e a n ss t a t i s t i c a lc o n f i d e n c ei sl o w i np r i n c i p l e ，i m a g e - p r o c e s s i n g t e c h n i q u ei sc a p a b l eo fs o l v i n gt h e s ep r o b l e m s w h e na p p r o p r i a t ei m a g ep r o c e s s i n gp r o g r a mi s u s e d ，c o m p u t e ri sa b l et op e r f o r mi m a g ea n a l y s i sf a s t e rt h a nh u m a n sa l o n e , w i t hg r e a t e rp r e c i s i o n a n dm o r ed e t a i l e di n f o r m a t i o nt h e o r e t i c a l l y , w i t ht h ea i do fc o m p u t e r , a u t o m a t i cq u a n t i t a t i v e b a c t e r i a la s s e s s m e n ts h o u l db ef e a s i b l e ， h i g hq u a l i t yb a c t e r i a li m a g e i st h ef o u n d a t i o no fa c c u r a t em i c r o b i o l o g i c a la s s e s s m e n t tc o n f o c a l l a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ( c l s m ) ，an o v e lt e c h n i q u eo f o p t i c a ls e c t i o n i n gm i c r o s c o p y , p r o v i d e s ap o w e r f u lm e t h o dt oe l i m i n a t ef r o mi m a g e st h eb a c k g r o u n dc a u s e db yo u t - o f - f o c u sl i g h ta n d 锨l t t e tc l s mc a na l s oi m p r o v et h er e s o l u t i o no fal i g h tm i c r o s c o p ei m a g eb e y o n dw h a ti s a c h i e v a b l ew i t hn o r m a l f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y i na d d i t i o n ；d i g i t a l a c q u i s i t i o n o f h i g h - r e s o l u t i o ni m a g e sb yc l s me n a b l e sr a p i da s s e s s m e n to fb a c t e r i a lb yi m a g ep r o c e s s i n g t r e a t m e n t i nt h i st h e s i s ，b a s e do nt h eh i g h - r e s o l u t i o ni m a g ef r o mc l s m , as p e c i a li m a g ep r o c e s s i n g t r e a t m e n tw a sd e v e l o p e d 蠡f 氆em i c r o b a c t e r i a la s s e s s m e n t w en a m e dt h i sn o v e ls y s t e ma s i n t e l l i g e n tc o n f o c a il a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ( i c l s m ) t h ew o r ki sd i v i d e di n t os i xp a r t s i np a r to n e 。t h ed e v e l o p m e n to fm i c r o b i a l 必s e s s m e mw e r ei n t r o d u c e d 搬s t ，t h ec l a s s i c a l m e t h o d si n c l u d i n gd i r e c t m i c r o s c o p yc o u n t 、c o l o n yc o u n t ，m o s tp r o b a b l en u m b e rc o u n t , t u r b i d i m e t r ya n de l e c t r o c h e m i s t r yw e r er e v i e w e di nt u r n s m e a n w h i l e , , s o 腓l a t e s tm i c r o b i a l a n a l y s i st e c h n i q u ea sf l u o r e s c e n c ep r o b e s , c o n f o e a l l a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p ya n di m a g e p r o c e s s i n gt r e a t m e n tw e r ea l s od i s c u s s e di nt h i sp a r t 。f i n a l l y , ab r i e fi n t r o d u c t i o nw a sm e t i o n e d a c c o r d i n gt ot h eu s eo f t i t a n i u m d i o x i d ep h o t o c a t a l y s ti nm o d e r oa n t i b a c t e r i a lr e s e a r c h i np a r tt w o , t h em e c h a n i s mo fi c l s mw a sp r e s e n t e d 。t h ec o n t e n do ft h i ss y 姓e mc o n s i s t e do f t h r e ep a r t s ：t h ef l u o r e s c e n c el a b e l i n go ft h em i c r o b i a ls a m p l e s ；t h ea n a l y t ei m a g ea c q u i s i t i o n f r o mc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ；t h ei m a g ep r o c e s s i n gt r e a t m e n ta n dd a t aa n a l y s i s f u r t h e r m o r e , an o v e ld a t ac a l i b r a t i o nt r e a t m e n tn a m e dt a r g e ta v e r a g em e t h o dw a sd e v e l o p e dh e r e f o rt h eu s eo fc e l lc o u n t i n gt h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a t ，t h i sm e t h o di sm o r er e l i a b l et h a n c o n v e n t i o n a la v e r a g em e t h o d i np a r tt h r e e 。t ot e s tt h ef e a s 西i l i t yo fi c l s mi nm i c r o b i a lt e s t ，w ec h o s es i l i c o nd i o x i d e ( s “渤) a n dh o m e m a d em e s o p o r o u st i t a n i u md i o x i d ep h o t o c a t a l y s tf 骶0 9a sam o d e ls y s t e m t h e i r a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sf o re s c h e r i c h i a c o l i 蕊c o l ow e r ee s t i m a t e db yt h ed i f f e r e n ts u r v i v a la s c a l c u l a t e df r o mi c l s m sa n da l s of r o mt h ea a d i t i o n a lp l a t ec o u n t t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t c l s mc o m b i n e dw i t hi m a g ep r o c e s s i n gt e c h n i q u ew a sa ni d e a lt o o lf o rm i c r o b i o l o g i c a l a p p l i c a t i o n sa n db a dp o t e n t i a lf o rp r o c e s sb i o t e c h n o t o g yr e s e a r c h , e n v i r o n m e n t a la n a l y s i sa n d e v e no i ll i n ep r o c e s sd e t e c t i o ns t r a t e g yr e l a t e dt om i c r o o r g a n i s m s 。 t np a r tf o u r , u s i n gi c l s m , t h eb a c t e r i c i d a la c t m t yo fn a n o s i l v e r - - d e p o s i t e dm e s p o r o u st i t a n i u m d i o x i d ef a g t i 0 2 ) m e m b r a n ew a si n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tt r e a t m e n tt oe l u c i d a t et h er o l e so f t h ef i l mp h o t o c a t a l y s ta n dn a n o s i l v e ri na n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ，c e l l sf r o mas i l v e r - r e s i s t a n t 段c o l i s t r a i nw e r eu t i l i z e d 。t h ed e c a ye 荆eo fs u r v i v a lo na g f f i 0 2m e m b r a n ec o n s i 鼗e do fs y n t h e t i c m e c h a n i s m s ：t h ef i r s ts t e pi sd u et ot h ep a r t i a ld e c o m p o s i t i o no ft h eo u t e rm e m b r a n ei nt h ec e l l e n v e l o p eb yap h o t o c a t a l y t i cp r o c e s s , f o l l o w e db yp e r m e a t i o no f t h es i l v e rl l a n o p a r t i c l e si n t ot h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n e ，t h en e x ts t e pi sd u et oad i s o r d e ro ft h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n ec a u s e d b yt h es i l v e rn a n o - p a r t i c l e s 1 1 i l np a r tf i v e i c l s ma n ds p s ss o f t w a r ew e r ec o m b i n e dt oa c q u i r et h es i z ed i s t r i b u t i o no f2 0 0 0 l a c t o b a c i l l u s t h er e s u l t sw e r ep r e s e n t e db ys t a t i s t i c a lf o r m t h i se x p e r i m e n tp r o v e dt h a ti c l s m c o u l db ea r li d e a lt o o lf o ra u t o m a t i cd e t a i l e dm i c r o b i a la s s e s s m e n ta p p l i c a t i o n s i i lp a r ts i x t h ef e r m e n t a t i o no fl a e t o b a c i l l iw e r eu s e da sam o d e ls y s t e m t h ei n h i b i t i o na b i l i t yo f t w oc o m m o na n t i b i o t i cr e s i d u e s ( p e n i c i l l i na n ds t r e p t o m y c i n ) w a si n v e s t i g a t e dt h r o u g hi c l s m m e t h o d t h er e s u l t sf r o me x p e r i m e n ts h o w e dt h ea n t i b l a s t i ca b i l i t yo ft h et r a c es t r e p t o m y c i nt o t h eg r o w t hk i n e t i c so fl a c t o b a c i l l u s w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no fs t r e p t o m y c i n , b o t ht h e g r o w t hr a t ea n dt h en u m b e ro fl a c t o b a c i l l u sa r es h i f t e dd o w n w a r dc o r r e s p o n d i n g l y t h eg r o w t h k i n e t i c so fl a c t o b a c i l l ia f f e c t e db yp e n i c i l l i nw a sm o r ec o m p l i c a t ea n dc o u l ds e p a r a t ei n t ot h r e e t y p i c a ls i t u a t i o n s w i t ht h ea i do fs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ；t h em e c h a n i s m s o fe a c h p h e n o m e n o na l s oh a v e b e e nd e d u c e di nt h i sp a r t k e y w o r d s ：m i c r o b i a la n a l y s i s ；c o n f o c a l l a s e r s c a n n i n gm i c r o s c o p y ；i m a g ep r o c e s s i n g ； a n t i b a c t e r i a l ；f l u o r e s c e n c e 。l a b e l i n g 醛传二： 独创性声明 x9 2 8 4 3 5 本人声鹤所至交静学位论文楚奉人在罨帮籀善下遴孬懿磺襄工终及联褥蕊 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成暴，也不包含为获得壶量太堂或其他教育枫 稳夔擎霞域涯书嚣健愆过懿耪凝。与我一嚣工掺嚣弱恚对零鞭究囊徽靛强秘贡献 均已在论文中作了明确的说明并液示谢意。 学位论文作者笈名： 签字日期： _ ，二。j 年月j 箩 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解随昌太堂海关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构遴交论文的复印件和磁盘，允许论文被套阅和 氆灞。零久攫簌塞基太堂霹殴将攀位谂文戆全部或藩努瘛容编入有关数摅疼逮 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学饶论文。 ( 绦密的学位论文在解密艨通用本授权书) 学位论文 乍者签名：i 静舜签名 签字目期： t 月 湘 然字丑期： 学位论文 乍者毕业厨去向 工作鼙筏： 通讯地虫l ： 自g 编； 獬 l 崩年月缈 嚷话： 主要仪器 英文缩写 a o c c c d c f c f d a c f u c l s m d l a e b e c o b f c m f d a f 1 t c h g m f i c l s m l u p a c k a l l a b m e r c m 口n o d p i p 汀r r h l 2 3 r s d s a d s e m t e m 1 译p t r f i a 英文缩写一览表 英文全称 a 嘶d i n eo r a n g e c o o l e dc h a r g e d - c o u p l e , dd e v i c e c a r b o x y - f l u o r e s c e i n c a b o x y - f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e c o l o n yf o r m i n gu n i t c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y d i g i t a li m a g ea n a l y s i s e i l l i d i u mb r o m i d e e s c h e r i e h i ac o l i f l o wc y t o m e t r y f l o u r e s e e i n - d i a e e t a t e f l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t e h y d r o p h o b i cg r i dm e m b r a n ef i l t e r i n t e l l i g e n tc o n f o c a ll a s e fs c a n n i n g m i c r o s c o p y i n t e r n a t i o n a lu n i o nf o rp u r ea n da p p l i e dc h e m i s t r y k i 蛳o n - a r g o l ll a s e r l a c t i ca c i db a c t e r i a m i c r o b i a le x p e r i m e n tr e v o l u t i o n m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n m o s tp r o b a b l en u m b e rc o f s o p t i c a ld e n s t r y p r d p i d i r i l li o d i d e p h o t o m u l t i p l i e rt h b e r h o d a m i n e1 2 3 r c l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s e l e c t e da r e ad i f f r a e t i o n s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t i t a n i u ml s o p r o p o x i d e t i l i l or e s o l r e df l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y 2 中文全称 吖啶橙 冷电耦器件 羧基萤光素 羧基二乙酸萤光索 菌落形成单位 激光扫描共聚焦显微 镜 数字图象分析 溴化乙锭 大肠杆菌 流式细胞术 醋酸酯荧光素 异硫氰酸荧光素 疏水网膜过滤器 智能激光扫描共聚焦 显微镜 国际纯粹与应用化学 联合会 氪氩激光器 乳酸菌 微生物实验革命 最低抑菌浓度 最可能数法 光密度 碘化丙啶 光电倍增管 罗丹明1 2 3 相对标准偏差 选区电子衍射 扫描电子显微镜 透射电子显微镜 钛酸异丙脂 分辨荧光免疫分析 第一部分 微生物分析方法的研究进展 微生物是一群体形微小、构造简单的低等生物的总称，一般包括病毒、类病毒、立克 次氏体、细菌、酵母菌、放线菌、真菌、小型藻类和原生动物【l l 。微生物与人类息息相关， 在自然界中的分布极其广泛，空气、土壤、河流、海洋及自然物体中都可以发现微生物的 踪迹，绝大多数微生物对人类是有益的，只有极少数对人体健康有害【2 】。微生物在人们的 生活和生态环境中所起的作用非常重要，微生物的活动与人和高等动植物所需的关键营养 物质的循环密切相关，微生物也是地球上有机物质的主要分解者，甚至，人们日常呼吸的 氧气也离不开微生物的代谢p j 。 近2 0 年来，生物科学蓬勃发展。人们对生命现象的认识，己不能再停留在整体、组织、 器官的水平上，而是要探讨生命内部各个细微特质的结构与功能，同时也涌现出以此为核 心的各类生物技术，有些甚至已发展为产值高达百亿美元的新兴产业”j 。对于生命研究来 说，无论是基础研究还是高技术的开发都离不开分析科学的帮助( 分析化学发展为分析科 学f 。其中：随着纳米科学“，荧光标记”，现代图象分析”，激光扫描共聚焦显微镜【别等 新兴技术的发展，微生物的智能活性分析技术已经成为新世纪最为热门的生物技术行业之 一。人类的安全与健康迫切需要微生物分析的积极作用。每年我国都有大量人口死于细 菌引发的疾病，如何遏制这类疾病的发展并有效的降低其死亡率已是我国的一大战略课题， 也是世界科学界所面临的重大挑战之- - “l 。最佳的战略是对疾病进行预警，防患于未然， 实现对疾病的早期发现，早期治疗和早期诊断。病发的来源可能仅仅从环境中的几个致病 菌开始，如何才能快速、准确而详实进行高通量的微生物活性分析，是当代微生物实验的 首要命题。 1 1 传统的微生物分析方法 在微生物实验中，生物量( 或细胞浓度) 的测定是研究微生物生长动力学和深入研究微 生物代谢调控的基础1 3 1 ，传统的微生物分析法有直接计数法( d i r e c ti v n c m s c o p yc o u n t ) ，菌 落计数法( c o l o n yc o u n t ) ，最可能法( m o s tp r o b a b l e n u m b e rc o u n t , ，浊度法 ( t u r b i d i m e t r y ) t 1 4 1 以及电化学方法( e l e c t r o c h e m i s 时) 等1 圳。 1 1 1 直接计数法 在某些微生物检验中，微生物的存在可以直接通过显微镜来观察，利用特殊的细菌计 数板或血球计数板，在光学显微镜下计算一定容积的样品中的微生物含量，测得的是样品 中的总菌数。计数板是一块特制的载波片，上面有一个特定的面积为1 m r n 2 ，高为0 1m m 的计数室( 中央大格) ，1 r a m 2 的面积被平均刻分成4 0 0 个小格。其总体积为l m m 3 。在计数 室上盖上加厚的载波片，将稀释的样品滴在盖玻片的边缘上，使其自然渗入计数室中，沉 降一段时间后，在显微镜下数出具代表性的小格中的菌数，求出每一小格所含的平均菌数， 再按下面的公式就可以得出每毫升样品所含的菌数【”】： 每毫升原液所含菌数( 个，砒净辞小格平均菌数x 枷x 1 0 0 0 x 稀释倍数 1 1 2 菌落计数法 由于直接用普通显微镜统计样品中的微生物存在着准确性差、统计学置信度低等缺点， 因此在常规实验室中，检查细菌的方法常用菌落计数法，又称活菌计数法，其原理是每个 活细胞在适宜的培养基和良好的生长条件下，在固体培养基上会长成一个菌落。菌落计数 法主要包括倾注平板法u fp l a t em e t h o d ) i ”】，涂布平板法( s p r e a dp l a t em e t h o d ) i ”1 以及 m i l e s - m i s r a 液滴平板法1 1 9 1 ( m i l e s - m i s r am e t h o d ) 。 在倾注平板法中，样品体积通常为i m l ，将待测样品经一系列1 0 倍稀释，然后筛选3 个稀释度的菌液，分别取o 2 m l 注入无菌平皿，再与一定体积的，已熔化并冷却到4 0 - - - 4 5 0 c 的熔化琼脂培养基混合，冷却后培养，待长出菌落后计数，并按下面的公式计算出原菌液 的活菌数： 每毫升原菌液的活菌数( c f u m l ) = 同一稀释度3 苗次重复的菌落平均数稀释倍数5 涂布法则先在培养皿中倒入培养基，凝固后，加入0 1 m l 的稀释菌液，用无菌涂布器 均匀涂布在平板表面，然后再培养，计数，并按下面的公式计算出原菌液的活菌数： 每毫升原菌液的活菌数( c f u m l ) = 同一稀释度3 - - , 5 次重复的菌落平均数稀释倍数x l o 倾注平板法具有较高的灵敏性，即使对于含菌量很少的样品也可以计数，但是4 0 4 5 。c 的温度容易导致某些微生物( 如嗜冷菌) 出现热休克而不能形成菌落。涂布平板计数法虽然可 以避免这一闻题，但样品体积较少，所得结果的统计学可靠性低。在m i l e s - m i s r a 方法中， 每个稀释的样品体积通常为2 0 _ t l ，允许每个平板上有多个稀释度的菌液增长，具体操作时， 先将平板划分为若干区域，每个区域代表不同的稀释度，经过培养后计数。m i l e s - m i s r a 法 可有效改善传统平板计数法耗材多的缺点，但操作繁琐，对实验人员的要求较高【2 “。 对于均匀混合的菌液，平板中形成的菌落数服从统计学中的泊松分布，平板中菌落数 增加。计算的菌落数在9 5 的置信区问也随之变窄，数据也就越接近真实值。但是当平板 4 中的菌落数大于3 0 0 时，难以用人眼计数，而且由于细菌密度过高。菌体之间对有限营养 的竞争造成菌落很小，有些菌体甚至无法形成菌落。因此，从统计学和微生物学的意义上， 一般可以接受的平板菌落数为3 0 3 0 0 个。为了在平板中获得3 0 3 0 0 之间的菌落，通常需 要在计数前将样品稀释。使用最多的是1 0 倍级数稀释法。对于熟悉的样品，可以只做一个 或几个合适的稀释度的平板。但对于完全不熟悉的样品，一般需要做多个稀释度的平板， 以保证某些平板上的菌落数能够在要求范围内。此外，用于稀释菌体的稀释液不仅要经过 灭菌处理，也不能对微生物产生任何损伤，比如溶质浓度过高或过低，造成微生物渗透压 休克。所以无菌蒸馏水不适合作稀释溶液，常用的稀释液中都含有一定量的蛋白胨或氯化 钠。 1 i 3 m p n 法 m p n 法1 2 ”通常将待测样品分为3 个不同的稀释度，每个稀释度接种到几个( 通常为3 - - 5 个) 平行的试管中，试管中盛有定量的液体培养基，经过一定时间的培养后，观察每组 样品的阳性管数，据此通过m p n 表得出待测样品的微生物数目。m p n 方法的进一步发展 是基于疏水网膜过滤器( h y d r o p h o b i cg r i dm e m b r a n ef i l t e r , h g m f ) 的使用旧。h g m f 被网格 分成许多个( 通常为1 6 0 0 个) 小的细胞可生长的分隔间样品通过h g m f 过滤后，菌体被阻 留在膜上，将过滤器置于合适的培养基上培养后，统计已长菌和没长菌的格数，再通过统 计学的方法计算m p n 值。从理论上说，通过常规h g m f 所计算出来的m p n 值，等同于 用1 6 0 0 支试管获得的结果。表1 1 将m p n 法与直接显微镜计数法和平板计数法进行了比 较。 表l ，1 常规菌落计数法比较 1 1 4 浊度法 浊度法( t u r b i d i m e m y ) 是一种常用的测定微生物浓度的方法【2 ”，细胞是不透光的，光束 通过细胞悬浮液，由于散射或被吸收而降低透光率，因此悬浮液中细胞密度同光密度 ( o p t i c & ld e n s i t y ) 值成正比，同透光率成反比。基于这个原理，浊度法测定样品中的微生物 含量要求先做培养液的光谱扫描，确定出由细胞所造成的最大吸收峰，然后离心一定的培 养液或采用稀释平板等方法测定单位体积培养液的生物量，再把培养液稀释一定倍数在选 定的波长下( 一股选择在6 0 0 7 0 0 r i m 处) 测其吸光度，绘制出吸光度相对于细胞密度的标准 曲线，测定时再根据未知样品所测得的光密度值，从标准曲线查出细胞密度值。 1 1 5 电化学方法 当微生物生长时，会改变培养基的化学成分，导致微生物及其培养基体系的带电性质 发生变化。对于一个待测样品，当其中的微生物、所选用的培养基以及培养温度等参数确 定后，能检测出电化学信号的时间( 即培养时间) 就与初始样品中的菌体数目和活力有关，时 问越短，培养基内的微生物数目也就越多( 或活力越强) 。描述这类电化学特性的常用参数包 括电导率g 、电容c 和阻抗z 。阻抗z 受电阻r 、电容以及交流电频率f 的影响。电导率 则为电阻的倒数( g = l r ) 。 测定时，先要选择或设定一个培养基，使其既能保证微生物的正常生长，又能确保其 生长结果能够改变该培养系统的电活性，然后取两根电极插入培养微生物的培养基中，通 过获得的电化学信号，进行数据分析，从而得到培养基中的微生物浓度。 1 1 6 小结 显微镜直接检测法方便快速，但取样量少，视野内的微生物个体更少，因此样品中的 微生物浓度要大于1 0 6 个m l 时才能观察到。由于普通光学显微镜的放大能力有限，一些小 的细胞在显微镜下很难看清，有可能出现漏查，无法精确计算，且不能区分死细菌与活细 菌。因此，仅适用于定性检测样品中的微生物。菌落计数法的灵敏度较高，但要求对未知 样品连续做3 4 次的1 0 倍级数稀释，才能够得到合适的平板菌落数，计数时稀释倍数越大， 所得结果的统计学置信度就越低，偏差也随之增大。这一方面是因为吸取样品时会打散团 聚的菌落，并且在稀释度较高的平板上菌落间的竞争减少，增加了单菌体形成菌落的可能， 使所得菌落总数明显增加。另一方面，在菌落形成过程中，细胞的生长受营养条件和培养 条件的影响很大，并非所有活的微生物细胞都可以在实验条件下或培养期间生长并形成菌 6 落，而且，因为无法看出产生菌落的细胞，不能肯定一个菌落是来自一个细胞还是多个细 胞的聚集，造成实验结果偏低，这两种误差均属于方法本身误差，是不可避免的。此外， 每个样品往往需要做6 1 0 个平板，当样品数目较多时，检测工作量相当大。m p n 法尽管 较之有所改善，但仅适用于单细胞的细菌或酵母菌，且菌体数量较少的微生物计数，不适 合丝状真菌，或菌体数量较多时的检测。另外平板记数法和m p n 法都需要至少4 8 h ( 细菌 培养时间1 才能获得结果，不能满足快速检验的现代微生物分析要求。浊度法可以快速直接 的求得待测样品的微生物浓度，而且还具备不损伤或在较大程度上影响原样品的特点。但 该方法仅适用于培养液的滤液在某个波长下的吸光度比较固定，且体系中不能含有固体颗 粒、色素和絮凝物质时的测定。对菌体的浓度范围要求也比较苛刻，一般必须在1 0 7 个m l 以上时才能显示可信的混浊度，但在过高浓度的悬菌液中，光线被一个细胞散射出去后又 会被另一个细胞重新散射回来，造成细胞数目与浊度之间失去线性关系。电化学方法同样 可以比较快速的得到待测样品的微生物浓度，但要得到初始的电化学信号也需要一定的菌 体数量( 通常在1 0 5 1 0 7 个m l 之间) ，因此，该方法只适用于检测细胞进入对数生长期后的 微生物培养物。而且浊度法与电化学方法都是一种基于微生物生长时基体的理化性质的变 化而进行测定的生物计数法，是一种间接的、经验性的微生物检测技术，仅适用于估算样 品中微生物浓度，无法进行精确的测定。 1 2 荧光标记技术在微生物活性分析中的应用 显然，随着现代科学节奏的加快，耗时长、精度差和效率低的传统微生物分析方法无 法满足人们的应用需求。为此，世界各地的专家和学者们都在努力寻找一些新的方法来满 足微生物快速分析的要求1 2 4 - 3 1 】。自7 0 年代起，专家们和学者们开始研究通过荧光标记，使 死菌与活菌之间的荧光信号有所区别，从而直接检测死细菌和活细菌的数量0 2 。已经有 大量文献证明，在荧光标记物的帮助下，通过特定的荧光监测手段，就可以直接、准确、 迅速的分辨细菌的活性 3 5 - 3 9 l 。 1 2 1 荧光标记法的分类 荧光标记法分为两种，即荧光染料直接染色法( d i r e c ts t a i n i n gm e t h o d ) 和免疫荧光染色 法( i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y ) ，前者是用荧光染料直接结合细胞成份1 。1 ，后者又分直接法 和间接法两种，直接法指用标记有荧光索的特异性抗体与细胞表面或细胞内的抗原结合”1 ； 目前问接免疫荧光染色法应用较多4 2 。4 ，该法先使抗原与抗体结合，再加荧光素标记的抗 7 抗体，形成有荧光的抗原一抗体一抗抗体复合物。 1 2 2 荧光探针的分类 用来判断细胞死活的常用荧光探针可以分为两大类：一类是能透过活的细胞膜进入细 胞内而发出荧光的物质，例如下羧基二乙酸萤光素( c a b o x y f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ，c f d a ) f 4 钟， 醋酸酯荧光索( f l o u r e s c e i nd i a c e t a t o , f d - a ) 4 “，罗丹明1 2 3 ( r h o d a m i n e1 2 3 ，r h l 2 3 ) 4