（微生物学专业论文）pseudomonas+spdsdy0501菌株的选育及其phb解聚酶酶学性质的研究.pdf

东北师范大学硕士学位论文 引言 在科技高度文明的现代社会，环保和节能成为社会发展的重要课题，可降解塑料以 其诸多优点走进人们的生活，逐渐替代传统塑料。2 0 世纪以来石油化工的飞速发展使塑 料成为人们同常生活和生产中必不可少的材料。它与钢铁，木材，水泥并列成为四大支 柱材料。随着其产量与日俱增和用途不断扩大，其使用后产生的塑料废弃物造成的“白 色污染”成为困扰人们的一大问题。目前全世界每年生产约1 4 0 万吨【l 】，用后废弃的量大 约是生产量的5 0 _ 6 0 。在我国城市垃圾中塑料废品约占7 ，有的地区高达1 5 ，这 些废弃塑料不易或不予回收且不易降解，一方面对于石油，天然气等一次性资源日益枯 竭的今天，造成了原材料和能源的巨大浪费：另一方面越积越多的废弃物成为污染环境 的有害垃圾，造成生态平衡的破坏。比如若将废旧塑料制品随意扔弃会对农田旅游等自 然环境造成污染；这些废弃物燃烧时将产生大量有毒气体，从而导致酸雨和臭氧层的破 坏形成二次污染；埋入地下时，又因其化学性质极其稳定而不容易腐烂变质，严重时可 影响植物根系生长；如果倾注到海洋中，则会严重破坏海洋中的生态平衡。 由于上述原因，随着一些发达国家先后制定了限用非降解塑料的法规的同时，从2 0 世纪6 0 年代以来歼始了对降解塑料的研究开发工作。我国“八五”和“九五”规划期间 也立项开发研制生产可降解塑料。 1 降解塑料的种类阁 降解塑料至今世界上也还没有统一的国际标准化定义，但美国材料试验协会( a s t m ) 通过的有关塑料术语的标准a s t m d 8 8 3 9 2 对降解塑料所下的定义是：在特定环境条件 下，其化学结构发生明显变化，并用标准的测试方法能测定其物质性能变化的塑料，这 个定义基本上和国际标准i s 0 4 7 2 ( 塑料术语及定义) 对降解和劣化所下的定义相一致【j 】。 对降解塑料的分类原则较多，按引起降解的环境条件分类较为合理且便于理解，可 分为光降解塑料、生物降解塑料、化学降解塑料和三类组合降解塑料。 1 1 光降解塑料 光降解塑料就是靠吸收太阳光，引起光化学反应而分解的塑料。目前，国外已被采 用的光降解技术有合成型和添加型，前者是在烯烃聚合物主链上引入光增敏基团，后者 在聚合物中添加有光敏作用的化学助剂。国内采用的技术路线主要是在聚烯烃中添加有 光增敏作用的金属络合物等化学添加剂。 1 2 生物降解塑料 1 2 1 生物降解塑料及试验评价方法 东北师范大学硕士学位论文 目前国际上对生物降解性高分子材料已经基本形成了共识。我国国家质量监督检验 检疫总局和国家标准化管理委员会于2 0 0 6 年2 月2 1 日发布，2 0 0 7 年1 月l 同实施的降 解塑料的定义、分类、标志和降解性能要求中对生物降解塑料的诠释为：在自然界如 土壤和或沙土等条件下，和或特定条件如堆肥化条件或厌氧消化条件下或水性培养液 中，由自然界存在的微生物作用引起降解，并最终完全降解变成二氧化碳或和甲烷、水 及其所含元素的矿化无机盐以及新生物质的塑料【4 1 。 专利和文献中所采用的生物降解性分析方法很多，目前主要采用美国材料试验协会 ( a s t m ) 在1 9 9 1 年提出的一系列的试验方法。其中包括在不同条件下好氧、厌氧生物的 降解、掩埋、堆肥、海水、废水以及污水、淤泥处理系统等作为试验评价方法。通过测 定单位时间内的c 0 2 排除量，或在一定时间内材料重量的减少值，来确定该种材料的生 物分解速度。但是，现有的测试方法还存在许多弊端，例如不能准确地判断酶是否能促 进生物降解，以及如何准确测量这种作用。美国和日本已承担了制定生物降解性的标准 试验测试方法的任务。 生物降解塑料可分为完全生物降解塑料和崩坏性生物降解塑料。 1 2 2 完全生物降解塑料 完全生物降解塑料在细菌或其水解酶作用下，最终分解成二氧化碳和水等物质回归 自然。按制备方法上可分为3 种：微生物发酵法、化学合成和天然高分子共混。 ( 1 ) 微生物发酵法一是指以有机物为碳源，通过微生物的发酵而得到的生物降解 塑料。主要以聚烃脂肪酸酯类较多，其中最常见的有聚3 羟基丁酸酯( p h b ) 和聚羟基 戊酸酯( p h v ) 及其共聚物( p h b v ) 。 ( 2 ) 化学合成法化学合成高分子型降解塑料大都是在分子结构中引入能被微生 物降解的含酯基结构的脂肪族聚酯，目前具有代表性的工业化产品有聚己内酯( p c l ) 、 聚丁二酸丁二醇酯( p b s ) 、聚乳酸( p l a ) 等多种产品。 ( 3 ) 天然高分子共混一利用化学合成高分子，混入具有生物降解性的天然高分子 ( 如淀粉、甲壳素、木质素、纤维素及动物胶等) ，以使产品具有降解性。主要品种有 p h b p c l 、糊化淀粉p c l 、糊化淀粉p h b v 等。 1 2 3 崩坏性生物降解塑料 崩坏性生物降解塑料是指塑料的一部分受微生物作用而失去原有形状的一类塑料。 它属于不完全生物降解塑料。目前已有日本美国意大利等研究成功淀粉含量在9 0 一 1 0 0 的全淀粉塑料。我国开展此工作较晚，近十年来，在开发和研究上，一些研究所 和高校取得了可喜进展。 1 3 化学降解塑料 化学降解塑料包括氧化降解和水解降解塑料【5 1 。聚乙烯醇( p v a ) 是一种具有环境 友好性能的水溶性聚合物，用途广泛，已有大规模生产。目前研发和工业化生产p v a 2 东北师范大学硕士学位论文 水溶性薄膜的公司有美国a i rp r o d u c tc h e m i c a l s 公司、c m sc r a f l s 公司、法国( h e n s c l 公司和我国的某些大学及研究所。英国的帕罗格安公司研制成功一种可水解的塑料薄 膜。它具有普通薄膜的力学性能和印刷性能，可有效保证包装袋内的农药气味不外泄及 耐碳氢类化学品的腐蚀。用后可水解而降解，解决了农药包装膜污染环境的难题。 1 4 复合型降解塑料 目前丌发的复合型降解塑料主要是光生物降解塑料、光碳酸钙降解塑料和光氧 生物降解塑料。 光生物双降解塑料是兼备光与生物双重降解功能的新型高分子材料，其降解过程是 先伎聚烯烃光降解，相对分子质量下降到能被微生物消化的水平后再生物降解。由于光 生物双降解过程受环境影响小，世界各国都投入大量人力和物力进行开发研究，并取得 一定成功。随着无机矿物粉体材料高性能技术的提高，出现了许多无机填充型多功能化 改性塑料。近年来福建师大充分利用了无机矿物粉体的“来源于自然回归于自然的特 殊的环境协调性，采用无机矿物粉体材料部分代替高分子材料，在光钙型环境友好塑料 材料领域进行了深入的研究，已取得了系列成果l o j 。 2 聚3 羟基丁酸酯( p h b ) 简介 生物可降解塑料通过产品整个周期分析，已确认为环境低负荷材料，它的主要原料 是来自可再生自然资源，为主要以有限的日趋枯竭的石油资源为基础的塑料工业开辟了 取之不尽的原料资源。在众多生物可降解塑料中，聚羟基烷酸酯( p h a ) 脱颖而出成为 研究的热点。聚羟基烷酸酯( p h a ) 是一类许多细菌不平衡生长即当碳源过剩而生长受 另一种营养物质( 如氮源) 限制时积累的一种聚合酯。根据链的长短可以分为短链p h a ( 单体碳原子数4 5 ) 、中链p h a ( 单体碳原子数6 1 6 ) 以及短链和中链共聚或混合的p h a 三种类型。在p h a 家族中最受瞩目的、最具工业前景的是聚3 羟基丁酸酯( p h b ) 、聚羟 基戊酸酯( p h v ) 以及它们的共聚物p h b v 。目前，材料领域研究最多的是聚3 - 羟基丁酸 酯( p h b ) 。 1 9 2 3 年，法国巴斯德研究所m l e m o i 印e 在巨大芽孢杆菌中发现了p 船。1 9 2 7 年又首 次从细胞中分离出了p h b 。四年后，阐述了该菌形成孢子时产生p h b 。其后观察到褐球 固氮菌产生p h b 并在包囊形成之前降解f 7 1 。5 0 年代末研究了生长条件对p h b 代谢的影响， 发现p h b 生成的量随生长培养基中碳氮比的增加而增加，即p h b 的积累是在某种营养物 受限制的不平衡生长条件下发生的。1 9 7 4 年观察到含3 h b 和其它3 羟酰基单体的杂聚物 【8 j 从而研究领域由p h b 扩展到p h a 。1 9 8 3 年有专利报道微生物合成p ( h b c o h v ) 共 聚物，而且它较p h b 均聚物有某些更好的特性。此后又出现了3 一羟基丁酸和3 一羟基己酸 的共聚物( p h b h h x ) ，相关的工作越来越多川。 2 1p h b 的结构和性质【l l - 1 2 】 3 东北师范大学硕士学位论文 p h b 是聚羟基丁酸酯( p h a ) 中的一员，也是最早发现和最主要的成员。其化学结 构式为：【- c h ( c h 3 ) c h 2 c o o n 。p h b 的核磁共振图谱指出，纯净的p h b 是一种 高度等规立构硬而脆的物质，而不同的扫描量热图谱则表明p h b 是晶体结构。p h b 的 分子量和聚合度随微生物的种类、限制性碳源的种类及浓度、培养条件、发酵时间、提 取方法等的不同而异。如果单体的碳链长度增加，其柔韧性将大大增加，而熔点与结晶 度下降。p h b 是l o o 的立体专一性的，所有的不对称碳原子都是d ( ) 构型，因而是 高度结晶的晶体，结晶度的范围在5 5 8 0 。p h b 分子结构的高度立体规整性，决定 了p h b 分子的特殊溶解性。p h b 不溶于甲醇、水、乙醇、丙酮、醚、己烷、无机酸等： 部分溶于二氧六环、甲苯、辛醇、吡啶：而溶于氯仿、二氯乙烷、二氯乙酸、三氟乙醇 等。p h b 与聚丙烯在分子结构和物理性质方面有许多相似之处，它们具有相近的熔点， 玻璃态温度，结晶度和抗张强度【l3 1 。由于3 羟基丁酸同时存在羟基和羧基，因此可进行 两种基团的各种典型反应。例如：与碱发生成盐反应，与酸发生酯化反应等。由于3 羟基丁酸分子内含有理氢原子，受热或与硫酸共热时容易进行分子内脱水反应，生成不 饱和酸，通常为0 【，b 不饱和酸与d ， r 不饱和酸的混合物。 2 2p h b 的生理作用 2 2 1 作为碳源储存能源 生理学研究表明，p h b 是细胞内一种内源性贮藏物质，当环境中营养缺乏时，p h b 象淀粉和糖原一样，作为营养和能量的来源。已经有大量的实验证实：p h b 是在碳源和 能源过量或氮源、磷源缺乏时形成的。好氧菌在限氧( 静止培养) 和c _ n 高时形成p h b ， 在碳源和能源缺乏时形成p 舳的量较氮源缺乏时少得多；在外加碳源、能源缺乏时，p h b 可以分解，好氧下p h b 分解为二氧化碳和水及少量乙酰乙酸，厌氧下分解产物为乙酰乙 酸和3 羟基丁酸。这两种情况都发生在对数期末；p 耶分解产物可以作为碳源和能源被 细胞利用，以防止细胞自溶和死亡。积累p h b 的细菌存活率高于不积累的细菌。有芽孢 细菌p h b 降解发生在芽孢形成前期，积累p h b 是在对数生长期持续几小时，到对数期末 细胞内p h b 达到最大量，随后p h b 逐渐减少，同时芽孢形成，到芽孢成熟时，细胞内p h b 消失。还有实验证明，强因子作用如紫外线、干燥、渗透压等因素作用，富含p h b 的细 胞死亡较慢。 2 2 2 共生固氮作用 对于豌豆根瘤菌( 砌拓d 6 f “，l e 鲥聊拥口删聊) ，p h b 对氮的固定起重要作用。p h b 不 仅作为能源，而且作为碳架来源，是同化氨形成氨基酸所必须的。 2 2 3 位于原核膜与真核膜中p h b 的作用 p h b 不仅存在于胞内，而且同样存在于膜物质中。在革兰氏阴性和阳性菌的原生质 体膜，真核生物的膜组分如微粒体膜。微粒体膜中发现有大量p h b 存在，p h b 与膜中 无机磷酸盐有密切关系。p h b 分子横跨膜结构作为细胞内维持c a 2 十浓度的调控因子及钙 4 东北师范大学硕士学位论文 信号。 2 3p h b 的应用 p h b 除具有质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等高分子化合物的基本性质外， 还具有良好的生物相容性和可生物降解性，压电性，光学活性等特殊性质。广泛应用于 医学、药物、工业、农业等领域 1 4 。引。 ( 1 ) 塑料领域。p h b 既有与塑料相似的理化性质和加工性能，又能被微生物完全 降解，因而在可降解塑料工业发展中必将占据首要地位。用p h b 制成的一次性塑料制品， 在自然环境中很容易被微生物分解为c 0 2 和h 2 0 ，不污染环境。 ( 2 ) 医学领域。由于p h b 具有良好的生物相容性，避免了人工合成时引发剂或单 体等残留于生物材料中引起毒性等问题，引起了医药学界广泛的关注。生物机体对其不 具有强烈的排斥作用，在机体内容易被水解成单体3 羟基丁酸，最后通过酮代谢成为c 0 2 和h 2 0 。p h b 最初被用于可吸收缝线，目前已广泛应用于组织工程，整形外科，载药控 缓释微球等领域i i 州。 ( 3 ) 纺织领域。p h b 可用于制造能分解的纤维和纺织品。 ( 4 ) 造纸领域。p h b 具有气体阻隔性质( c 0 2 和h 2 0 只能缓慢透过) ，适合做包装 材料。可利用这些材料制成防漏纸杯，纸碗，还可以制造面粉袋及其它口袋。 ( 5 ) 环境监测领域。p h a s 可以作为环境的标记。在对河湾沉积物中的微生物进行 研究表明，通过比较其中磷脂和p h a s 的合成比例，可以监测外界因素对沉积物的影响 程度，并且由于碳源较丰富的环境大多数细菌都具备将过量的碳源转化为p h a s 储存的 能力。在原油生产地，通过在活性污泥及富含碳源有机物的环境中大多数嗜冷海洋微生 物在限氮条件下胞内积累p h a s 的情况，确定该地的污染程度。 ( 6 ) p h b 的高结晶特性。这种特性导致聚合物的压电性质，故可以制成压电元件， 用于压力传感器、点火器、声学仪器和振荡发生器。 ( 7 ) p h b 单体的应用。它的每一个结构单元都有一个手性碳，可用于色谱分析， 以分离光学异构体；另外，p h b 水解后得到的3 羟基丁酸单体可作为有机物合成的原料， 制备手性衍生物。和常规药物相比，手性药物更安全，有效，使用剂量也更小：而p h b 的手性单体3 羟基丁酸可被广泛用于化学药品合成的结构元件，例如抗生素，维生素， 芳香素和信息素【l 。 3 p h b 的代谢途径 3 1p h b 的合成 3 1 1 合成p h b 的主要微生物 能产生p h a s 的微生物分布极广，包括光能自养菌，化能自养菌及异养菌计6 5 个属 中的近3 0 0 种微生物。积累有p h a s 的微生物能容易通过用苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。 目前研究得较多的用于合成p h a s 的微生物有【l s 】：产碱杆菌( 彳砌纽，l 嚣) 、假单胞菌属 东北师范大学硕士学位论文 ( r p “如以d ，z a s ) 、甲基营养菌( 拖砌y 肠f ，印凰) 、固氮菌属( 彳z o f d 6 口c 胞，) 和红螺菌属 ( r d 如印删砌珑) 等，它们能分别利用不同的碳源产生不同的p h a s 。常用的发酵底物 主要为c 1 c 5 化合物，如简单糖类( 如葡萄糖、蔗糖、木糖) ，有机酸( 如丙酸、丁酸、 戊酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、衣糠酸) ，醇( 如甲醇、乙醇、戊醇) 以及烃等。其中真 养产碱杆菌是研究最多的p h b 生产菌种。早期研究真养产碱杆菌中p h b 代谢的主要目的 是将p h b 消除以便利用该菌产生单细胞蛋白，后来才转向p h b 的生物合成和积累的研 究。 3 1 2p h b 的生物合成 目前我们获得的很多关于p h b 的合成的认识都来源于对尺a 厶幻甩谊p “f 唧j l i 口 ( f o r n l e r l y 彳配口姆甩嚣p “f 唧矗淞) 的研究。用于p h b 生物合成的碳源在细胞内通过各种途 径转化为乙酰c o a 。在微生物细胞内乙酰c o a 积累过剩时将转变成p h b 。在对许多细菌 的研究中发现，由乙酰c o a 合成p h b 是通过三酶合成途径，三酶即b 酮硫解酶，n a d p + 专一的乙酰乙酰c o a 还原酶和p h b 合成酶。三酶合成途径为两部分：d ( ) 羟丁酰c o a 底物的合成和聚合反应。在根瘤菌中首先形成l ( + ) 3 羟丁酰c o a ，然后被两个烯酰 c o a 水解酶作用转变成d ( ) 异构体f 1 9 】。 糖、有机酸、甲醇、c 锄 上 t c al 盾环一c b co s c o a p h b i 胁c o a _ 上 | h s c o a -l 上 l m 啦弧虻豳六吼渊洲m c 西 n a d p h 2 n a d p + n a d p + 专一的 目一酮硫解酶 2 乙酰辆酶a 乙酰乙酰辅酶a圣壁圣墅翌蔓垒至堕堕一d ( ) 3 羟丁酰c 。a 。、 n a d p 飓n a d p + 图1p h b 的合成途径 p h b 合成酶 p h b 由上图可以看出，当碳、氮丰富时，微生物正处于旺盛生长期，乙酰c o a 优先进入 t c a 循环，用于产生能量，合成氨基酸。结果游离出大量c o a ，后者抑制p 酮硫解酶活 性，阻碍了p h b 的生物合成。而当氮被限制时，蛋白质合成停止，细菌生长也停止，t c a 循环中产物过剩，乙酰c o a 量增加，游离的c o a 下降，p 酮硫解酶活性显现出来，p h b 合成开始。 2 0 世纪8 0 年代后期开始人们将重组d n a 技术应用于生物合成p h b ，来自于多种 细菌的p h a 生物合成酶( p h a 生物合成途径的关键酶) 已被在分子水平进行了详细的研 究，它们的p h a 生物合成酶基因已被克隆成功。三个实验室独立地将真养产碱杆菌h 1 6 的p h b 生物合成基因肋鲥( p 酮硫酯酶) 、肋6 口( 依赖于n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还 6 东北师范大学硕士学位论文 原酶) 和p 勋c ( p h b 合成酶) 克隆并在大肠杆菌中表达【2 0 】。研究发现，在真氧产碱杆 菌中，p h a 合成酶的结构基因排列在称为肋6 c a b 的一个操纵子上，分别编码p h a 合成酶6 酮硫酯酶和依赖于n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶( 如图2 ) 。 抛 竺兰竺、。! 竺竺竺i 竺竺竺 t t g a c a 。脚脚1 堂竺竺生 一 竺! ：! 竺二 一l 些! 竺： 脚 ，脚 嗍脚 图2 真氧产碱杆菌中聚羟基烷酸生物合成操纵子的排列顺序 3 2p h b 的胞内降解 p h b 的胞内降解是合成细菌自身内源储存物的活性转移。胞内p h b 是非晶态，由 一层蛋白质和磷脂膜包被。一些物理作用( 如反复冻融、离心) 和化学作用( 如有机溶剂、 碱溶液) 能够破坏这层膜。所以，在细胞破裂及密度梯度离心等过程中，要十分注意， 才能保持p h b 的天然性。 最早研究胞内p h b 降解的是m e 研c k 和d o u d o r o 仃在1 9 6 4 年进行的。他们从b 口c f 淞 肘堙口f 仃觑肌体内分离的天然p h b 作为降解的底物，颗粒本身自溶率很低，而被 r 矗d 如印洲舰，z 朋6 m ，z 粗提液水解成3 h b 的速率很快。尺 d 咖印f 砌仇所朋6 川所粗提液中 包含对热敏感的胞内p h b 解聚酶，对热稳定的活化因子和酯酶。活化因子的作用是去 除p h b 表面被膜中的蛋白，使之更易与解聚酶靠近。这个作用也可以由少量的胰蛋白 酶完成。在由表面活性剂包被的人工p 船水解时，就不需要活化因子的作用。活化因 子的分子片段很大，不能被蛋白酶抑制剂所抑制，在氯仿、苯酚等有机溶剂中稳定【2 。 胞内p h b 的代谢是个循环过程，通过对真氧产碱杆菌0 倒肌猡 淞) 、生枝动胶菌 ( z d 叫d p 口阳聊辔p ，口) 和拜氏固氮菌( 4 z d 幻6 口c 据r6 p 耖p r 觑嘲f ) 等菌株的研究，发现p h b 的代谢主要过程如图所示，不同的菌种间可能略有差异。 包，7 蝴 嘲7 獭姥缓 图3p h b 的代谢过程 7 礅擎岐 = 毒 峰 黼 一黝一旦删 嘲一 东北师范大学硕士学位论文 图中是降解过程。首先( 第步) 胞内无定形p h b 颗粒在解聚酶作用下降解， 形成单体和二聚体的混合物。只有在真氧产碱杆菌中才形成d 3 羟基丁酸( d 3 h b ) 。 二聚体随之在二聚体水解酶作用下形成单体。随后，3 羟基丁酸在脱氢酶的作用下氧化 成乙酰乙酸，再生成乙酰乙酰c o a 及乙酰c o a 。 在p h b 的代谢中，3 酮硫解酶是一个关键的酶。它既参与合成，又参与分解，催化 合成时被高浓度的c o a 抑制，催化分解时，为乙酰乙酰c o a 抑制，c o a 激活，使p h b 的 代谢受到三羧酸循环的调控，将p h b 的合成和分解与细胞的代谢和碳源的流加通过中间 代谢物连接起来。p h b 在细胞内的合成与降解条件，为发酵生产和应用提供了理论依据。 4 p h b 的发酵生产 目前，国内外对可降解塑料p h b 的研究主要集中于p h b 的合成和降解。对于p h b 合 成的研究更多，而其产业化技术已十分成熟。 1 9 8 5 年奥地利的生物技术研究有限公司( b tfb i o t e c l l n o l o g i s c h ef o r c h u n g s g e s e l l s c h a r m b h ) 和林兹化学有限公司( c h e m i ol i n za g ) 等成功开发出中试规模生产的 第一代生物塑料p h b 。他们使用肥大产碱杆菌，利用蔗糖发酵，年产p h b 2 0 t 。由于基因 工程菌具有生长迅速，培养基原料来源广，可利用廉价原料和废弃物来大量产生p h b ， 从而降低生产成本等突出优点，受到人们的关注f 2 2 1 。 英国帝国化学公司( i c i ，现在叫z e n e c a ) 从1 9 7 6 年开始研究，于1 9 8 7 年成功开发了 第二代生物塑料p h b v ，命名为b i o p o l 。他们曾就工业规模生产p h b 的技术和经济问题 进行估价。最后从固氮菌、甲基营养菌、真养产碱杆菌三个候选菌株中选择了真养产碱 杆菌，他们以葡萄糖作为碳源，用磷酸盐消耗做限制生长因子，采用两步法生产，找到 解决p h b 挤出和纯化的较好方法。 我国降解塑料的研究开始于2 0 世纪7 0 年代后期，8 0 年代也仅有少数单位进行实验 室研究，9 0 年代才掀起研究开发的热潮。研究开发的降解塑料品种有：光降解、光生 物降解( 国家“八五九五”重点攻关) 、光氧化生物降解( 环境降解) ( 国家“八五”“九 五”重点攻关) 、光碳酸钙降解、完全生物降解( 国家“八五”“九五”“8 6 3 ”重点攻关) 、 崩坏性生物降解、高填充碳酸钙环境友好材料。从2 0 0 0 年以来清华大学用自己开发的 傅立叶红外无损探测技术快速筛选出了可生产第三代生物塑料的菌种，实现了第三代生 物塑料生产过程菌体高密度培养以及无机法和有机法下游后提取新工艺。在国内外首次 开发成功第三代生物塑料：3 羟基丁酸和3 羟基己酸共聚物( p h b h h x ) 的小试，中试 和大规模生产工艺，并对材料进行了生物降解性能的评估【2 3 】。产品出口美国，取得良好 的经济效益。这说明我国降解塑料研究开发进程与世界同步，技术水平与国外先进技术 接近或相当。 目前真正实现了大量生产的p h a 并且工艺发展较快的有p h b 2 4 2 5 】、p h b v 和 p h b h h x 【2 6 】，还有很多种的p h a 没有被大量生产出来，由于不能提供大量的新型p h a ， 限制了这些p h a 的应用开发。 东北师范大学硕士学位论文 5 p h b 的胞外降解 p h b 的胞外降解有两种机制，一种是在无菌条件下通过水解进行。这种机制对于 p h b 在医疗方面的应用( 如作为药物的缓释载体、手术缝线等) 特别重要【2 7 之引。在自然 环境中是另外一种机制酶降解机制。许多细菌和真菌可分泌p h b 胞外解聚酶，有些 甚至可以利用p h b 作为唯一碳源生长。 5 1 降解p h a s 的微生物 天然的、具有完整被膜的胞内p h a 颗粒称为n p h a ( 相应的降解酶为n p h a 解聚 酶) ；处于部分结晶状态的胞外p h a 称为d p h a ( 相应的降解酶为d p h a 解聚酶) 。p h a 降解菌能在以d p h a 为唯一碳源的固体培养基中富集。在这种选择性培养条件下，首 先获得的是那些具有最快生长速率的菌株。这些不一定都是高效降解d p h a 的菌种。 一些杂菌，虽然并没有降解d p h a ，但它们能够利用最初的降解产物( 一些寡聚物) ，因 而长得很快，而且很难去除。更好的办法是把土壤稀释液涂布于以d p h a 乳化液为唯 一碳源的固体培养基上。降解菌能分泌特殊的d p h a 降解酶，这种酶能在胞外水解聚 合物，使之成为水溶性的产物，在菌落的周围形成透明圈。这种方法在有氧、厌氧及摇 瓶条件下完成，以分离出好氧菌、厌氧菌及微好氧菌。最早关于p h a 降解的研究是1 9 6 3 年由h g s c h l e g e l 学院的a a c h o w d h u r y 进行的。 j m e r g a e n d 等在土壤中发现有2 9 5 种微生物可降解p h b 和p h b v ，包括1 0 5 种革 兰氏阴性菌，3 6 种芽孢杆菌属，6 8 种放线菌和8 6 种霉菌【2 9 1 。环境中的p h 、温度等不 同，降解p h b 的主导微生物也不同。在酸性土壤中，革兰氏阴性菌很少：高温时，霉 菌多属烟曲霉印p 呼，淞向m 枷f 淞) ，而低温时多属马昆德拟青霉( 砌p c 如，缈邸 ，z 口w “以，z 讲f ) ( 砂土、黏土中) 或青霉( 砌f c f 盯觑聊) ( 其他土壤中) 。 通常情况下，p h a s 厌氧降解比有氧降解快【3 0 】。真氧产碱杆菌在厌氧条件下，p h b 的主要代谢产物是乙酸和( r ) 一3 羟基丁酸，乙酰c o a 转变成乙酸的同时生成a t p 。而 在有氧情况下，乙酰c o a 完全分解成c 0 2 和h 2 0 ，产生1 2 个a = r p ，这是一种对p h b 更为经济的利用。 5 2 影响p h a s 降解的因素 5 2 1 聚酯的物化性质 聚酯本身的物化性质对其生物可降解性具有很大影响。包括聚酯的立体规律、结晶 度、聚合体表面的可进入性及聚合物的组分等。 5 2 2 环境条件对聚酯降解的影响 在不同的环境条件下由于温度、p h 值、和土壤成分等因素条件的不同，导致生长 在此环境的优势微生物种群不同，从而使环境对p h a s 膜的降解的快慢不同。从环境的 角度看，高聚物的降解性不是其所固有的，而是环境状态表现的结果，改变了环境状态， 9 东北师范大学硕士学位论文 本来难降解的高聚物变得易于降解了。环境条件的变化是通过控制微生物的活性或者改 变化合物的生物可得性而影响化合物的生物降解性的。 5 3p h a s 降解性能的评价方法 随着降解塑料在世界范围内成为研究开发的热点，如何评价生物降解塑料的降解性 能显得十分重要。生物降解性评价及试验方法要求与生物降解性定义一致地评价生物降 解性，要有可重复性，简便性和定量性。目前主要是通过一些生物化学和微生物学的方 法来实现。标准的试验方法有： ( 1 ) 视觉的观察。通过观察可降解材料的粗糙的表面、形成的裂纹和孔洞、降解 的碎片及颜色的改变等等。这些变化虽不能证明生物降解的代谢过程，但是可以作为由 微生物引起的侵蚀作用的最初的表征。目前普遍采用的高级的观测方法有借助于扫描电 子显微镜、原子力显微镜、核磁共振、傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热分析、x 射 线能谱技术、x 射线衍射技术等进行分析【3 l 】。 ( 2 ) 透明圈法。该方法是一种半定量的方法。将聚酯的精细粉末混入以该聚酯为 唯一碳源的培养基中制成琼脂平板，平板是不透明的，在接入微生物以后，如果菌落周 围出现了透明圈，则表明该菌株可使聚酯解聚，透明圈的大小可表征该菌株的降解能力。 这种方法通常用来筛选可降解某一种聚酯的微生物，但它也可通过分析透明圈生长的情 况获得半定量的评价结果。 ( 3 ) 测量聚酯薄膜的失重率【3 2 3 3 1 。在降解试验中，通过测量聚酯薄膜的失重率也 是种用来评价聚酯降解性能的常用方法。将聚酯材料制成的薄膜置于不同的环境中 ( 如土壤、湖泊、海水等) ，定期观测聚酯薄膜的失重率，对聚酯的降解性能进行评估。 ( 4 ) 放射性1 4 c 示踪物法。将1 4 c 标记的塑料试样研磨成细粉，与新鲜园林土混合并 装入简内，使脱除c 0 2 经水饱和后的空气通过此筒后再通入盛有2 m o l lk o h 溶液的容 器，吸收由微生物作用所产生的1 2 c 0 2 和1 4 c 0 2 。经3 0 天后，用1 m o l l 的h c l 溶液滴定至 p h 8 3 5 ，由此计算所产生的c 0 2 总量。将部分k o h 滴定液加入i n 烁计数器内，检测每分 钟产生的1 4 c 量。通过与标记试样的原始放射性相比较，可以确定试样被分解成c 0 2 的碳 重量百分数。此法不受试样或土壤中可生物降解杂质或添加剂类的干扰，故即使系统内 存在其它( 未标记) 碳源，同样可证明微生物对塑料试样的降解作用。 ( 5 ) 酶促降解法。聚酯的酶促降解首先是酶与聚酯底物结合，随后催化水解分裂。 在可降解p h b 的细菌和真菌中，既有胞内解聚酶又有胞外解聚酶。p h b 的胞内降解是细 菌水解自身的内源性碳源存储，而胞外降解是菌株利用外源性的非微生物自身所积累的 碳源。解聚作用是微生物分泌的胞外酶将聚酯分解成短链、小分子、寡聚体、二聚体或 单体，这些小分子可以穿过细菌的半透膜。这些短链的分子通过矿化作用被最终分解为 c 0 2 、h 2 0 或c h 4 。 ( 6 ) 可控的堆肥试验。将聚酯的固体废弃物置于可控的堆肥设备或厌氧消化器可 对有机废弃材料进行处理和再利用。堆肥试验的环境条件是：高温( 5 8 ) 、需氧条件、 适当的水含量( 约5 0 ) 。成熟的堆肥营养丰富，适合于微生物生长。测试的方法是基 1 0 东北师范大学硕士学位论文 于测定c 0 2 的净排放量，也就是聚酯一堆肥混合物的c 0 2 排放量与空白( 纯堆肥) 的c 0 2 排放量之差。一个非常重要的前提是，用于测试的包装材料在降解过程中不能释放一些 可通过进入食物链而对植物、动物和人类产生毒害作用的化合物【3 4 】。 5 4p h b 的环境微生物菌群降解试验 对于在不同环境( 如：土壤、湖泊、海水、沼泽等) 中的微生物菌群对p 船薄膜 的降解情况的研究，m e r g a e r t ，j 等的研究较为系统。研究者将p h b 和p h b v 分别置于 1 5 、2 8 、4 0 的土壤中，保持恒温放置2 0 0 天；并将同样的材料置于无菌缓冲液中，测 试的温度范围为4 5 5 ，恒温监测9 8 天。结果表明无菌缓冲液中的聚酯没有降解，而 土壤中的聚酯以0 0 3 0 6 4 唰天的失重率被土壤微生物降解，温度越高降解速度越快， 并且共聚物要比均聚物降解的快p 5 1 。他们还采用了家庭用的小型的堆肥对p h b 及其共 聚物进行降解性评估【3 们。p h b 及其共聚物在水环境的降解研究表明，海水中要比淡水 中降解的快，降解速率随季节性变化，温度高时降解速率快1 3 m 引。 国内学者也对不同环境中如土壤、好氧污泥、厌氧污泥和水体；不同条件如p h 、 温度和湿度下的降解进行了相关的研究发现：在河水的表层水中，4 0 时p h b 膜比3 0 时降解得快，而深层水中却相反，并且可降解p h b 膜的菌体比较适合于p h 8 的条件【) 圳。 污泥中p h b 的降解能力比p h b v 高，不同p h 、温度对污泥中微生物降解p h b 的能力 有着不同的影响。制品形态，特别是添加量，与降解率有很大关系，添加量越大降解率 越高。降解化学合成p h b 薄膜的微生物分布比较广泛，降解程度强于生物发酵法制 备的p h b 【4 1 4 2 1 。水解作用和酸解作用在p 册生物降解过程中对其失重率影响很小，p h b 薄膜的结晶度增加则生物降解性降低。细菌p h b 由单一的r 型单体构成，化学合成的 p h b 由r 型和s 型混合单体构成，p h b 降解酶对r 型单体活性最高，对s 型单体则无 活性，所以化学合成的p h b 中s 型单体的存在将明显降低其生物降解性【4 3 埘j 。 5 5p h b 解聚酶的酶学研究 对于p h b 解聚酶的分离，国外从6 0 年代开始陆续展开，直至9 0 年代成为研究的热点， 并取得一些进展。19 6 6 年c j l u s s t y 和m d o u d o r o f f 最早描述了两p 掰如珑绷黜 ，绷d 拗p f 可以产生一种胞外解聚酶将p 耶水解成二聚酯，然后由胞内水解酶进一步水 解。他们将该解聚酶分为两个部分，并对其性质进行描述和比较【4 5 1 。7 0 年代初期， m w s t i n s o n 和j m m e 玎i c k 发现风p “如m d ，l 船沱聊d 如弘“的p h b 解聚酶的分泌受琥珀 酸的抑制的作用机理是培养基的p h 值f 4 6 1 。随着研究的不断深入，人们发现咫p 砌历d 打船 彪，z o f j 即“至少含有五种可以降解胞外p h b 、p 皿v 及其它短链p h a 的p h a 解聚酶结构基 因。有四个基因p h a z l 、p h a z 2 、p h a z 3 和p h a z 5 分别编码p h b 解聚酶c 、b 、d 、a 。另 一个基因p h a z 4 曾被推测是编码p h v 解聚酶的基因，后来通过研究证实它编码另外一种 p h b 解聚酶，而p h a z 6 才是真正的编码p h v 解聚酶的基因【4 7 1 。 关于粪产碱杆菌，日本的学者研究较多。1 9 9 5 年k e i k 0 飚t a 等从海水中分离出一株 粪产碱杆菌a e l 2 2 ，并将p h b 解聚酶分离纯化。发现该酶包含一个分子量为9 5 5 k d a 的小 l l 东北师范大学硕士学位论文 亚基，其氮端氨基酸序列为g a w q n n l a g g f n k v 。二聚体和三聚体为主要降解产物， 该解聚酶在p h 9 o ，5 5 时活性最耐4 8 1 。此后，他们将该解聚酶的基因进行克隆【4 9 j 。 日本学者曾对p 砌行d 而印e f ( p h a z 5 ) 和彳廊g c 口胁的解聚酶进行比较研究发现两者都有 一个严格保守的五肽序列，这个序列与p h b 解聚酶的结构和功能有关【5 0 j 。随后，d o iy 等人对p h b 解聚酶的底物结合结构域和p h b 表面之间的作用进行研究【5 1 。5 2 1 。最近研究者 发现水解活性受干扰的突变株p h b 解聚酶会影响3 羟基丁酸在聚合体松散链附近的包 装。并推论野生型菌株的p h b 解聚酶对3 羟基丁酸的单晶体的降解分三个阶段：( 1 ) 酶 在单晶体表面的吸附。( 2 ) 干扰聚合物链的包装。( 3 ) 对干扰的聚合物链进行水解【53 1 。 另有一些学者展开了对真菌的研究，b m c a t o 和w o n g 等从n ，z f c 砒册廊，l f c “，“，z 中分离出胞外p h b 解聚酶。此酶为单体，分子量为3 7 k d a ，最佳活性在p h 6 o ，等电点为 5 8 ，k m 为o 1 7 m g 俩l 。各种表面活性剂能竞争性的抑制酶的活性【5 4 】。s a l 【i em i y a z y k i 等 对尸切记f 玩川忽，l f 甜 粥甜聊分泌的p h b 解聚酶的性质进行研究发现该酶的分子量为 3 3 k d a ，最适p h 和p i 均为6 5 。d f p ( 二异丙基氟磷酸盐) 和d t t ( 二硫苏糖醇) 会抑制酶 的活性【5 5 】。从污水中分离的西托p c p ，厶哪括所觑f 聊口w 2 菌株，其解聚酶分子量为4 8 k d a ， 等电点为4 4 ，最适p h 为9 0 ，最适温度为5 5 ，降解产物为3 羟基丁酸的二聚体【5 6 】。国 内学者通过紫外诱变的方法获得p h b 解聚酶的高产菌株，并对p h b 解聚酶的酶学性质进 行表征【5 m 8 1 。 真菌所产p h b 解聚酶的这些特征和从细菌中提取出来的进行比较，发现有许多相同 之处： ( 1 ) 在广泛的p h 、温度、离子强度下具有很高的稳定性。 ( 2 ) 相对分子质量很小( 小于7 0 l ( d a ) ，大多数的d p h a 解聚酶的相对分子质量为 4 0 5 0 k d a ，并且大部分解聚酶仅由一条多肽链构成。 ( 3 ) d p h a 解聚酶并不能结合阴离子交换剂，如：d e a e ( 在自然p h 下) ，但对疏水 性化合物有很明显的亲和力。 ( 4 ) 最适p h 值在碱性范围内( 7 5 9 8 ) ，仅r p f c 娩f 玎f 和p 绷f c f 豇f c 聊乒行f c 甜五粥甜朋中解 聚酶的最适p h 分别为5 5 和6 0 。 ( 5 ) 大部分d p h a 解聚酶能被丝氨酸水解酶的抑制物所抑制。如：二异丙基氟化 磷酸盐( d f p ) 和磺酸基化合物。它们与丝氨酸水解酶活性位点上的丝氨酸以共价键相结 合。 而不同之处则表现在以下几个方面：从青霉中分离出的p h b 解聚酶是糖蛋白，分子 量低，表观k m 值不同，而从细菌中分离出的p h b 解聚酶是非糖蛋白，分子量较高。 5 6 降解过程和降解机理的研究 5 。6 1 生物降解过程中发生的作用【5 9 】 ( 1 ) 生物物理作用：微生物细胞的生长对塑料材料起到物理性的机械破坏作用： ( 2 ) 生物化学作用：微生物产生的某些物质对塑料起化学作用； ( 3 ) 酶的直接作用： 微生物的酶的本质是蛋白质，而蛋白质是由2 0 种氨基酸组成的，氨基酸分子里除含有氨 1 2 东北师范大学硕士学位论文 基和羧基外，有的还含有羟基或巯基等，这些基团既可作为电子供体，也可作为氢受体。 它们能和塑料分子或氧分子发生吸附作用。这些带电质点构成了酶的催化活性中心，使 被吸附塑料分子和氧分子的反应活化能降低，从而加速了塑料的生物降解反应。 5 6 2p h b 降解机理的研究【】 国内学者通过扫描电子显微镜观察不同降解时间的p h b 膜结构，对p h b 的降解机理 进行了研究。研究表明：p h b 的结晶部分具有较高的有序性和较大的密度，p h b 解聚酶 不能有效的进入到p h b 的结晶中而引起降解，而是首先进攻密度低、松散的非晶部分。 当非晶部分降解后，p h b 结晶表面便会形成很多的自由端基，这些自由端基具有较大的 活动能力，导致p h b 的结晶表面形成结构过渡层，p h b 结晶逐渐被破坏，并且破坏作用 首先发生在球晶的中心部分。随后p h b 解聚酶继续对非晶部分降解，直至使p h b 完全降 解。 通过进一步的研究发现：不同温度下结晶的p h b 膜，虽然结晶度相近，但是结晶规 整性是有差别的。结晶温度越高，结晶规整性越好，越难于降解。这再一次证明了上述 对p h b 降解机理的阐述。 6 本论文的工作目的 聚3 羟基丁酸酯( p h b ) 做为胞内碳源和能源的储存物，在细胞内易于被自身产生的 胞内酶降解，但将其从细胞内分离出后，生化条件和聚集状态都会发生根本变化，其降 解性随之发生相当大的改变。将p 耶作为完全生物降解材料使用，消费后必然要求对 p h b 采取生物方法进行处理，既要求有降解p h b 的优良菌种，又要有相应的降解技术， 满足对p h b 生物方法处理的需要。因此深入研究p h b 的胞外降解特性，具有十分重要的 学术价值和应用价值。 对于p h b 的生物降解，国外从六十年代起陆续开展了研究，直至九十年代初期才有 了比较系统的工作发表。目前，已分离出数十种可降解p h b 的菌株，并对p h b 的降解特 性进行了研究。然而在我国由于到目前为止还没有切实可行的p h b 生物合成技术，所以 研究的热点仍然集中在p h b 的合成方面。仅有的一些关于p h b 的生物降解的研究主要是 针对真菌和环境微生物菌群的研究，而没有对可降解p h b 的细菌菌株的细致全面的性质 研究。由于细菌生长周期短，基因组小，分类较清楚，人们对它的遗传背景比较熟悉。 所以对可降解p h b 细菌菌株的研究是十分有意义的。 本论文工作将从分离菌种出发，筛选出高效可降解p h b 的菌株进行p h b 降解试验； 研究p h b 的降解规律及最佳发酵条件；对p h b 解聚酶进行分离，纯化和表征，并探讨p 耶 的降解过程和酶作用机理，以期对它的生物降解性作以正确评价，加速p h b 快速降解性 和完全降解性的研究，真正实现p h b 的环境友好化，并对其合成工艺的改进提供理论依 据。 p h b 的研究开发，需要材料、高分子、化学、医学、电子、物理、微生物、分子生 东北师范大学硕士学位论文 物学、发酵工程和化学工程领域的专家合作，甚至需要工业界的参与，才能产生效果， 得到真正有市场应用前景的新材料。随着对p h b 降解研究的一步步深入，降解的内部 机制逐渐展现在人们面前。深入进行以p h b 为代表的生物可降解塑料的生物可降解性 的评价，以及开发高效的降解p h b 的