（植物学专业论文）钙在蓝猪耳双受精过程中作用的研究.pdf

中文摘要 钙在被子植物双受精过程的作用一直是植物学家的兴趣热点。早期有关钙对植物有性生殖影 响的研究主要集中在研究钙对花粉萌发和花粉管生长的作用方面。与花粉萌发和花粉管生长过程 中的作用的研究相比，对雌蕊组织中，尤其是胚囊中的钙的作用的研究十分有限。到目前为止， 对植物胚囊中钙的研究也绝大多数局限于总钙和膜钙的的测定，而对于被子植物胚囊内胞质游离 钙的研究i j l l j l , 乎是空白。这方面的研究之所以比较滞后，一方面是由于大多数被子植物胚囊深藏 于子房内，为处理和观察带来很大困难。同时研究胚囊胞质游离钙的技术手段也有很大的局限。 囡此，材料本身的结构限制和研究手段的限制使得植物双受精过程中胚囊内胞质游离钙的研究相 比之下显得落后。 针对这种现状，本工作选用具有裸露胚囊的玄参科的蓝猪耳植物为研究材料研究c a 2 + 与 受精过程中相关的细胞学事件的关系，探索【c a 2 + 】c 。在被子植物双受精过程中的作用。工作之一 首先是检测受精过程中雌性生殖单位中发生的显著的细胞学变化，以此作为受精与否的标志：然 后经过外源导入钙( a 2 3 1 8 7 诱导) 研究【c a 2 + k 在受精过程中的这一细胞学事件发生中所起的作 用。另一相关的工作是构建转y c 2 1 基因的蓝猪耳植株( y c 2 1 是钙的荧光指示剂) ，然后对不 同发育时期的蓝猪耳胚囊中f c a 2 + 】。的动态变化进行研究。 通过荧光染色技术，我们首先观察了自然受精过程中胚囊内雌性生殖单位细胞壁的变化。 结果表明，开花前蓝猪耳的卵细胞的胞壁是完整的；开花时胚囊已发育成熟，此时卵细胞在舍点 端部分区域是裸的；受特后( 大约授粉后2 0 小时) 卵细胞的胞壁恢复完整。表明细胞壁的合成是受 精后早期发生的细胞学事件。在此基础上，我们分离了胚囊细胞的原生质体。通过外源导入钙离 子检查钙能否引发类似受精过程发生的细胞学事件。结果显示：外源钙的流入导致卵细胞内发生 了与钙有关的细胞学事件，但不同状态的雌性生殖单位的细胞原生质体对外源钙的流入产生不尽 相葡的反应。胚囊已发育成熟( 柱头己张开) 时期的未受精的卵细胞原生质体，钙离子载体a 2 3 1 8 7 处理后引发了卵细胞壁的形成。类似于发生在自然受糟过程中的现象，而在对开花前分离的卵细 胞鼹生质体以及受精后( 授粉后2 0 小时) 分离的卵细胞原生质体作相同的处理后则未发现细胞 壁韵再生：周作为双受精参与者之一的中央细胞经过处理后，无论受精前还是受精后( 授粉后2 0 小时) 均未发现细胞壁的再生。这些结果表明，外源钙流入导致的胞质c a 2 + 浓度的升高，有促进 卵细胞细胞壁快速形成的作用；而且，卵细胞对c 2 + 信号的反应与发育状态有关，可能仅成熟的 未受精的卵细胞处于一种特殊的“感受态”，能对c a 2 + 信号发生反应而快速形成细胞壁。 转基因蓝猪耳植株构建工作已取得阶段性结果。从质粒扩增、农杆菌转化、侵染一直到叶盘 法转化蓝猪耳，经过多次筛选，得到抗性苗，目前正在筛选表达y c 2 1 荧光指示剂的转基因苗。 关键词：蓝猪耳， 胚囊，双受精， 【c a 2 + 1 。雌性生殖单位 a b s t r a c t f u n c t i o n so fc a l c i u md u r i n gf e r t i l i z a t i o no fa n g i o s p e r mi so n eo fr e s e a r c hf o c u s e sf o rb o t a n i s t s p r i o rs t u d i e so fc a l c i u mo ns e x u a lr e p r o d u c t i o no fa n g i o s p e r mm a i n l yc o v e r e dt h e s ea b o u tp o l l e n g e r m i n a t i o na n dt u b eg r o w t hp r o c e s s e s ；t h e r ea r e ，h o w e v e r , f e ww o r k so np i s t i lt i s s u e s of a r , a c h i e v e d s t u d i e so nc a l c i u mi ne m b r y os a co fa n g i o s p e r mm o s t l yl o c a t e di nm e m e b r a n e b i n d i n gc a l c i u ma n d t o t a lc a l c i u mb u tl i a l ei nf r e ec y t o p l a s m i cc a l c i u m ( 【c 矿+ 】c n ) o b s t a c l e st op r o g r e s sa r e ：( 1 ) t h ed o u b l e f e r t i l i z a t i o no fm o s ta n g i o s p e r m so c c u r si n t e r n a l l y , d e e pw i t h i no v a r yt i s s u e s ，a sar e s u l ti ti s v e r y d i f f i c u l tt o i n v e s t i g a t et h et r u t h ( 2 ) t h e r ea r ef e wi d e a lt e c h n i q u e sf o rm e a r s u r i n g 【c 矛+ 】c i n c o n c l u s i o n ，b o t hl i m i t a t i o nd e l a ys t u d i e so f 【c a 2 + 】c ni ne m b r y os a cd u r i n gf e r t i l i z a t i o n t h et h e s i sw o r ki st o i n v e s t i g a t e t h ec o n n e c t i o no f c 一+ 】ma n df e r t i l i z a t i o n b ya v o i d i n g d r a w b a c k sn o t e da b o v e ，s a y , e m p l o y i n ga ni d e a le x p e r i m e n t a lp l a n t ，z h 旭脚口f o u r n i e r i ，w i t han a k e d e m b r y o s a ct h a tp r o t r u d e sf r o mt h em i c r o p y t e ，m e t h o d st ob ea p p l i e di n c l u d ee x t r a c e t l u l a rc a p + i n f l u x t r e a t m e n ta n di n t r a c e l l u l a rc a 2 + m e a s u r eb yt r a n s g e n i c a le x p r e s s i o no fc a 2 + f l u o r e s c e n c ei n d i c a t o r d u r i n gf e r t i l i z a t i o n t h ef o r m e ri s f i r s tt oo b t a i np r o t o p l a s mo ff e m a l eg e r m i n a t i o nu n i ti nd i f f e r e n t d e v e l o p m e n ts t a g e s ，t h e nc a 2 + l o n o p h o r ct r e a t m e n t ；t h e l a t t e ri st o e x p r e s st r a n s g e n i c a l l y t h e c a 2 + - s e n s i n g c a m e l e o n p r o t e i n i nt o r e n i a f o u r n i e r i , w h i c h a l l o w s l o n g t e r m m e a s u r i n g s t i m u l u s i n d u c e dc y t o p l a s m i cc a 2 + c h a n g e s f i r s tw ee m p l o y e dc w m 2 r , af l u o r e s c e n tf a b r i cb r i g h t e n e r , t oi n v e s t i g a t ec h a n g e so fw a l lo f f e m a l eg e r mu n i tb e f o r ea n da f t e rf e r t i l i z a t i o n b e f o r ea n t h e s i sw a l lo fe g ga p p a r a t u si s c o m p l e t e ； m o s tp a r to f e g gw a l la tt h ec h a l a z a le n dd i s a p p e a r sa tt h ed a yo fa n t h e s i s ；a f t e rf r t i l i z a t i o n ( 2 0 ha f t e r p o l l i n a t i n g ) e g gw a l lb e c o m e si n t a c t t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tr e b u i l d i n go fw a l li s o n eo ft h ee a r l y c y t o l o g i c a le v e n t sd u r i n g f e r t i l i z a t i o n b a s e do nt h e s eo b s e r v a t i o n s ，w ei s o l a t e dp r o t o p l a s t sf r o mf e m a l e g e r mu n i ta n dp e r f o r m e de x t r a c e l l u l a rc d + i n f l u xe x p e r i m e n ti no r d e rt oc h e c kw h e t h e rt h ec y t o l o g i c a l e v e n ts i m i l a rt ow h a th a p p e n sd u r i n gf e r t i l i z a t i o nw i l lb ei n d u c e db ye x t r a c e l l u l a rc a 2 + i n f l u x t h e r e s u l t so f e x l r a c e l l u l a rc a 2 + t r e a t m e n tr e v e a l e dt i l a ti n f l n xo f e x t r a c e l l u l a rc a 2 + i n d u c e ds o m ec e l l u l a r e v e n ta n dp r o t o p l a s mo ff e m a l eg e r mu n i ti nd i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e sr e s p o n dt ot h et r e a t m e n t d i f f e r e n t l y c 矿i o n o p h o r et r e a t m e n ti n d u c e do c c b r l e n c 2o f n e wc e l l u l o s i cw a l la r o u n dp r o t o p l a s l so f u n f e r t i l i z e de g gc e l l sf r o mm a t u r ee m b r y os a c ，w h i c h j u s td o e so c c u rd u r i n gf e r t i l i z a t i o n n e ww a l li n p r o t o p l a s t sf r o mf e r t i l i z e de g gc e l l so rf r o me g g c e l l sb e f o r ea n t h e s i s ，h o w e v e r , w e r e n td e t e c t e d ，a s w e l la sp r o t o p l a s t so fc e n t r a lc e l l t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ei n c r e a s eo f c y t o p l a s m i cc 一+ f r o m e x t r a c e l l u l a rc 一+ i n f l u xc o n t r i b u t e st ot h er a p i de s t a b l i s h m e n to fe e l l u l o s i cc e l lw a l l m o r e o v e r , t h e s e r e s u l t sa l s os u g g e s tt h a to n l ym a t u r eu n f e r t i l i z e de g gc e l l s ，w h i c ha r ea ta s p e c i a l ”s t a t e ，a r ea b l et o r e s p o n d t oc a z + s i g n a lt oe s t a b l i s hn e ww a l lr a p i d l y a sf o rc o n s t r u c t i o no f t r a n s g e n i ct o r e n i a f o u r n i e r i , s o m ef o u n d e r m a n i a lw o r k sh a v eb e e nd o n e i n c l u d i n gp l a s m i da m p l i f i c a t i o n ，a g r o b a c t a r i u mt r a n s f o r m a t i o n ，l e a fd i s kt r a n s f o r m a t i o n - r e g e n e r a t i o n ， e t c t h ew o r kf o rs c r e e n i n g t r a n s g e n i cp l a n tw h i c he x p r e s s e sy c 2 1i si np r o g r e s s k e yw o r d s ：t o r e n i a f o u r n i e r i , o v u l e ，d o u b l ef e r t i l i z a t i o n 。 c a 2 + 】q ，f e m a l eg e r mu n i t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 聚。尽我所知，除了文中特剐加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入己经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 丽使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 豸畚l 氮陵 时f j ：2 0 0 3年6 月1 8i = i 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保塑 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以甩不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：翁1 乳睃 时间：2 0 0 3年6 月1 8 闩 导师签名： 粤移侈嘭 时浏：2 0 0 3年6 月1 8n b s a ： s d s ： n l s ： c a m s m ： k a n ： c b ： b o v i n es e r u ma l b u m i n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 缩略词表 t r i h y d r o x y m e t h y ia m i n om e t h a n e c a m o d u l i n s t r e p t o m y c i ns u l f a t e k a n a m y c i n e c a r b e n i c i l l i n c w m 2 r ：c a l c o f l u o r w h i t e m 2 n ( c e f l o f l u o r ) i a a ： 6 - b a ： f c l 2 + i 哪 y c 2 1 ： 3 - 1 n d o l y l a c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e f r e ec y t o p l a s m i cc a l c i u m 第一部分文献综述 1 钙与信号转导 第一部分文献综述 1 0 0 年前，人们开始注意到c a 2 + 在生物学上的重要性。6 0 年代末期，美籍华人张槐耀( 1 9 6 7 ) 在动物细胞中发现钙调素，即钙的多功能受体蛋白后，人们才真正开始对钙的作用机理有了深刻 的认识提出了c 矿也可以像c a m p 一样作为细胞内第二信使起作用。这种观点自7 0 年代以来 在动物细胞上被大量实验证实，8 0 年代以后也相继在植物细胞中得到确认，而且。逐渐成为非常 活跃的研究领域，并且不断有新的有关综述总结这方面的研究成果( b u s h ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ： g i l r o yp f a 1 1 9 9 3 ；h a m o n ，1 9 9 7 ；m a l h 6e t a l ，1 9 9 8 ；s a n d e r se t a l 1 9 9 9 ；b e r r i d g ee t 口，2 0 0 0 ) 。 钙在细胞中以多种形式存在。细胞中的钙，即总钙( t o t a lc a l c i u m ) ，含量在o 1 1 0 r a m ( j a f f e “a ，1 9 7 5 ；n a g a ie a ，1 9 7 5 ) ，可分为结合钙( b o u n dc a l c i u m ) 、贮存钙( s t o r e d c a l c i u m ) ( c h a n d l e r a n d b a l t e r s b y 1 9 7 6 ；t a n d l e r e l a l ，1 9 7 0 ) 和自由钙( f r e e c a l c i u m ) 三种形式。结合钙和某些物 质的亲和力很强，在细胞中常与其他结构成分紧密结合；贮存钙占总钙的大部分，含量在1 旷m 以上常位于细胞器与细胞壁中，当细胞的生理活动需要增加钙浓度时，这些暂时贮存的钙就从 贮存位点释放出来，运输到细胞所需部位或个体的其他部位；自由态( c 扩) 在细胞中以自由态 存在，含量很低，在1 0 o m 以下，在静止状态时细胞溶质c f + 浓度为0 1 u m o l l 左右与一般认为 大多数细胞外自由钙浓度1 0 0 10 0 0 u m o l l 相差3 4 个数量级( t i e t a l 2 0 0 0 ) 。 细胞内的钙分布也不均匀。许多被称为钙库的细胞器。如液泡、内质网、线粒体等含量丰富， 其游离钙浓度也较胞质高( n a g a ie t a ，1 9 7 5 ) 。液泡是植物细胞内贮量最大的钙离子库。其游离钙 离子水平估计在l0 _ 3 m 左右，液泡膜上有可对刺激因子起反应的钙离子通道。受到刺激时释放钙 离子到细胞质中。提高细胞溶质内的 c a 2 + 】，这是植物信号转导过程中胞内信使c 2 + 的重要来源。 植物细胞内质网中【c 一+ 】估计在1 0 。6 m 左右，跨膜内质网膜的钙离子流动非常活跃。快速钙离子 内流和外流之问的动态平衡维持着内质网内外钙离子梯度的相对稳定，在某些因素刺激下钙离子 通道开放，向胞质释放c d + 。质体和线粒体中钙离子的浓度亦高于细胞质，这归因于光合和呼吸 引起的膜电位平衡，在光暗转变或氧气供应变化时跨膜质体和线粒体膜的钙离子流动非常迅速 参与调节包括能量转化在内的细胞反应和基因表达( 孙大业等，1 9 9 8 ) 。 不同形式的钙具有不同的生理功能，在组织、细胞中分布位点也不同。在一定生理条件下， 三者可相互转换( b u s he t a l ，1 9 9 3 ；f e i j oe t a l 。1 9 9 5 ：g i l r o ye a ，1 9 9 3 ；m c a i n s he l a l ，1 9 9 5 ； t r e w a v a sa n d m a l h o ，1 9 9 8 ) 。细胞自由钙的分布与转移是形成钙信号的基础，c a 2 t 作为细胞信使的 的基础，首先在细胞外与细胞质之间，胞内钙库( 某些细胞器) 或细胞质之间存在c 一+ 浓度梯度。 因此，当一种刺激到达细胞表面时，或少量的胞外c a ：+ 进入细胞溶质或使胞内钙库释放c a 2 + 至细 胞溶质导致细胞溶质c a 2 + 浓度大幅度增加产生钙信号；继而与和c a 2 + 有高度亲和的蛋白质或 酶结合，使其激活，经过一系列信号的传递与放大引发细胞反应。胞内钙库释放c a 2 + 和胞外 c 一+ 内流是胞质游离钙升高的两条重要途径( m e l d o l e s i 。1 9 9 8 ) 。 中国农业大学硕士学位论文 细胞内存在多种多样的信号途径，以便应答复杂的环境刺激。钙信号要准确传递各种复杂的 信号也同样不是简单的c a 2 + 浓度变化( 即调幅机制，a m p l i t u d e ) 所能完成。c 一+ 信号的多样性 首先表现在产生钙信号的钙通道及其调节因子的多样性上( e h l e r sa n d a u g u s t i n e ，1 9 9 9 ：p e n n i s t o n a n de n y e d i 1 9 9 8 ) 。此外更重要的是，钙信号的复杂性还在于其时空多样性。低水平的刺激仅诱 发基本单位( e l e m e n t a r yu n i t s ) 引起的局部钙信号；强烈刺激则由基本单位局部钙信号同步化形 成整体信号( g l o b l es i g n a l ) ( h a n c o c k1 9 9 7 ：b e r r i d g ee l a l ，1 9 9 7 ) 。 2 钙与受精的关系 钙与受精的关系的研究最早开始于动物受精方面，从此揭开了钙信号在有性生殖作用方面研 究的新篇章。植物中类似的研究滞后于动物领域不过最近的几年，借助于动物研究的成果，钙 在植物有性生殖过程中的研究也已取得了很大进展。 2 1 钙与动物受精的关系 在受精过程中可探测到的最早的反应是精卵的融合( m c c u l l o ha n dc h a m b e r s , 1 9 9 2 ) ：精卵融 合可能使得一个信号从精子向卵细胞扩散，从而引发钙波( w h i t a k e r e l 甜1 9 8 9 ；t a y l o r e t a l ，1 9 9 3 ) 。 在受精的早期阶段，除了少数脊椎动物以外，许多物种的动物在受精过程中都出现从精于进入位 点扩展到整个胞质的显著的钙波的产生。( w h i t a k e ra n ds w a r m ，1 9 9 3 ；b u s a e ta l ，1 9 8 5 ；m i y a z a k i e la l ，1 9 8 6 ；s h e n , 1 9 9 3 ，1 9 9 5 ；j a f f e ，1 9 8 5 ；g i l k e ye ta 1 ，1 9 7 8 ；e i s e na n dr e y n o l d s ，1 9 8 4 ：e i s e ne l a 1 ，1 9 8 4 ；y o s h i m o t oe lo l ，1 9 8 6 ；h a f n e re la l ，1 9 8 8 ；s p e k s n i j d e re la l ，1 9 8 9 ；s h e ne la l ， 1 9 9 3 ，1 9 9 5 ；m c d o u g a l le la l ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ；s t e p h a n oe la l ，1 9 9 7 ) 。海胆卵和大部分其他后i = i 动物 ( d e u t e r o s t o m e s ) 在受精过程中i t j - = c a 2 + 】州的升高导致卵激活，继而启动了胚胎细胞的分裂循环 ( 1 s a b e l l eg i l l o ta n dm i c h a e lw h i t e a k e r , 1 9 9 3 ：c r e t o ne la l ，1 9 9 5 ：j a f f e ，1 9 8 0 。1 9 9 9 ) 。这是后口 动物中普遍存在的高度保守的卵激活机制( j a f f e ，1 9 8 5 ) 。有趣的是，哺乳动物的受精卵也表现出 象在仓鼠( i g u s a a n d m i y a z a k i ，1 9 8 6 ；m i y a z a k ie l a l ，1 9 8 6 ) ，老鼠( k l i n ee l a l ，1 9 9 2 a ；l a w r e n c e 1 9 9 8 ；j o n e se la l 1 9 9 8 ；d o n ge la l ，2 0 0 0 ) ，猪( s u n e la 1 ，1 9 9 2 ) ，以及牛( f i s s o r ee la 1 ，1 9 9 2 ； s u ne la l ，1 9 9 4 ) 的受精卵所表现的短暂的钙升高，但不能确定的是短暂的钙升高的启动是在精卵 之间的胞质相连( c y t o p l a s m i cc o n t i n u i t y ) 之后还是之前。已有的有关海胆受精过程的电生理和形 态研究表明，配子之间产生的电位连续性( e l e c t r i c a lc o n f i n u i t y ) 早于配子之间的胞质桥的形成5 8 s e c ，早于精子的进入位点处的皮质颗粒的分泌6 8s e c ( m e c u l l o ha n d c h a m b e r s ，1 9 9 2 ：l o n g oe l a l ， 1 9 8 6 ) 。小的重复性的短暂钙升高在海鞘类受精卵中出现( s p e k s n j d e r e l a 。1 9 8 9 ) 。在棘皮类动物、 青蛙以及哺乳动物的研究表明。受精卵中短暂的钙升高的作用之一可能是引起皮质颗粒的分泌以 阻止多精子的进入( e p e l ，1 9 7 8 ：j a f f e ，1 9 8 5 ：y a n a g i m a e h i ，1 9 8 8 ) ：另一个作用是启动细胞循环 的进行但是机制还不清楚( w h i t a k e r a n dp a t e l ，1 9 9 0 ) 。后口动物在受精过程中【c 一+ 】。升高是由 胞内钙库的释放引起的( j a f f e ，1 9 8 5 ) 。有两种机制导致胞内钙库的释放：一种是i n s p ，介导的钙 释放( i i c r ) 另一种是c 一+ 诱导的钙释放化i c r ) 。 2 第一部分文献综述 _ i 置鼻置胃皇量曼芭薯_ 可见，受精过程中受精卵表现的【c f + 】c y t 升高在动物中是一种普遍现象。 2 2 钙与被子植物双受精的关系 双受精是被子植物特有的生殖方式。始于花粉落到柱头上并萌发出花粉管，在亲和条件下。 花粉管通过柱头、花柱、胎座、珠孔等雌蕊组织到达胚囊的退化助细胞中。在退化的助细胞中， 花粉管释放内容物( 包括两个精细胞) ，使一个精细胞与卵细胞相遇、融合而成合子，另一个精 子与中央细胞融合而成三倍体的胚乳，完成被子植物的双受精。这期间发生了一系列的雌、雄细 胞的相互作用，确保了花粉管准确到达胚囊，完成精卵结合( e p e l ，1 9 9 0 ：s u ne t a l ，2 0 0 0 ) 。在整 个过程中，钙在其中的作用已引起了研究者的广泛关注。事实证明。植物细胞的生长发育过程与 钙密切相关，钙在此过程中具有许多重要的生理功能。因此，有关钙在植物体内的功能一直是个 非常活跃的研究领域。其中有关钙在双受精过程中的作用机理研究十分吸引入( b u s h ，1 9 9 2 ，1 9 9 5 ： g i l r o y e t e t 口，1 9 9 3 ；m a l h o e l a 1 9 9 8 ) 。 2 2 1 钙与花粉萌发和花粉管生长 早期有关钙对植物有性生殖影响的研究主要集中在钙对花粉萌发和花糟管生长的作用方面。 b r i n k ( 1 9 2 4 ) 首先发现钙在花粉离体培养中的作用。接着b r e w b a c k e r h 和k w a c k ( 1 9 6 3 ) 用3 9 个 科、7 9 属的8 6 种植物检查外源钙对花粉萌发的影响时发现，外源钙可替代花粉萌发时的群体效 应。r e i s s 和h e r t h ( 1 9 7 8 ) 认为花粉萌发时萌发孔区域含较多的钙与形成花粉管极性有关。外源 钙不仅促进花粉萌发也促进花粉管生长( p i c t o na n ds t e e r , 1 9 8 3 ；o b e r m e y e ra n dw e i s e n s e e l ，1 9 9 1 ； r e i s sa n dh e r t h ，1 9 8 0 ；s t e e r a n ds t e e r , 1 9 8 9 ；k o h n oa n ds h i m m e n ，1 9 8 7 ，1 9 8 8 ； b e d n a r s k a , 1 9 8 9 a , 1 9 8 9 c 1 h e s l o p - h a r d s o na n dh e s l o p - h a t r i s o n , 1 9 9 0 ；r e i s sa n dh e r t h , 1 9 7 9 ，1 9 8 0 ，1 9 8 5 ；m i l l e r e la l ， 1 9 9 2 ；h e p l e r , 1 9 9 7 ；h o l d a w a y - c l a r k ee t a ，1 9 9 7 ；f r a n c l i n ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ，1 9 9 6 ，1 9 9 9 ) 。研究也表明 钙在花粉管中呈极性分布。顶端区域含量较高( j a f f e e l a ，1 9 7 5 ，r e i s se t a l ，1 9 8 3 ，b e d n a r s k a , 1 9 8 9 e , p i c t o na n ds t e e r , 1 9 8 3 ；r e i s sa n dh e r t h ，1 9 7 8 ) 。 随着研究技术的改进，有关花粉管中钙的作用机理的研究逐渐转移到钙的分布和功能方面 ( r e i s sa n dn o b i l i n g ，1 9 8 6 ) 。游离钙的研究也显示钙在生长中的花粉管中呈极性分布( r e i s sa n d n o b i l i n g 。1 9 8 7 ；o b e r m e y e r a n dw e i s e n s e e l ，1 9 9 1 ；m i l l e re la l ，1 9 9 2 ；p i e r s oe ta 1 ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ，1 9 9 6 ： f r a n k l i n - t o n g e l a l ，1 9 9 7 ；h e p l e r , 1 9 9 7 ：h o l d a w a y - c l a r k ee t a l ，1 9 9 7 ；m a l h oa n d t r e w a v a s ，1 9 9 6 ； m e s s e r l ia n dr o b i n s o n 。1 9 9 7 ) ，花粉管顶端局部区域游离钙浓度的变化引起了不对称钙通道活性 从而控制了花粉管的生长方向，而钙减少部位有利于花粉管向反方向弯曲( m a l h oa n dt r e w a v a s 1 9 9 6 ：m a l h o e l a l ，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ) 。 2 2 2 雌性生殖单位 雌性生殖单位的概念是由d u m a s 等( 1 9 8 4 ) 提出的。这一术语延伸了卵器( e g ga p p a r a t u s ) 的概念，卵罂作为一个结构单位，只认识到助细胞在配子融合中协助卵的功能( j e n s e n 1 9 7 4 ： 中圈农业大学硕士学位论文 w i l l e m s ea n dv a nw e n t 。1 9 8 4 ) ，而忽视了与形成胚乳的中央细胞的作用。j e n s e n 与其合作者的研 究( j e n s e na n df i s h e r ，1 9 6 8 ：f i s h e ra n dj e n s e n ，1 9 6 9 ) ，从卵和助细胞结构与功能统一的关系建立 了一个被子植物双受精作用中精子转移到卵和中央细胞过程的模型。这促进了其后对卵器细胞和 中央细胞结构的深入研究，以期了解这些细胞是如何协调作用去完成受精功能的( 胡适宜等 2 0 0 2 ) 。 雌性生殖单位是由卵细胞、两个助细胞和中央细胞组成。作为一个结构单位主要完成以下功 能接受花粉管释放精子到雌配子体的接收部分实现雌雄配子的融合。雌性生殖单位有助于 完成受精的其他一些结构特点是雌性细胞在精子到达的位置通常没有细胞壁，这排除了精子融 合时的障碍；卵核与中央细胞的极核( 或次生核) 的相向贴近，这保证了两个融合过程的同时 进行。雌性生殖单位是当胚囊发育到成熟，及准备受精之前才组成的一个暂时性的单位，一旦受 精完成，在原来壁消失的部位再生新壁。这样合子被完整的壁包围。此外，受精后合子核与初生 胚乳垓向相反的方向移动。( v a nw e n te a l ，1 9 8 4 ：f uye a l ，2 0 0 0 ：胡适宜等，2 0 0 2 ) 表明雌性生 殖单位暂时性的另一个证据来自于受精前和受精后雌性生殖单位内部之间的共质体联系的变化， 即开花前中央细胞与卵器之间有高的共质体联系，随着胚囊成熟，开花两天后这种联系下降( h a r t e ta l 2 0 0 0 ) 。 2 2 3 钙在雌性生殖单位中的分布及作用 对甘蓝型油菜( b r a s s i c an a p u sl ) ( 余凡立等1 9 9 8 ) 、水稻( o r 声as a t i v al ) ( 余凡立等，1 9 9 9 ； t i a na n dr u s s e l l 1 9 9 8 ) 和烟草( n i c o t i a n al a b a c u m 上h j 、白花丹( p l u m b a g oz e y l a n i c al ) ( t i a na n d r u s s e l l ，1 9 9 7 ，2 0 0 0 ) 、小麦( t r i t i c u ma e s t i v u r nl ) 、珍珠谷( p e a r lm i l l e 0 ( c h a u b l ea n dr e g e r , 1 9 9 0 , 1 9 9 2 a , 1 9 9 2 b , 1 9 9 3 ，1 9 9 4 ) 、矮牵牛( p e t i n i a h y b r i d a l ) ( t i r l a p u r e a ，1 9 9 3 ) 、太阳花( h e a n d y a n g , 1 9 9 2 ) 授粉前后的胚囊中的钙进行超徽细胞化学定位，结果显示，虽然钙分布是在胚囊中 的特定部位但随着发育的进行也在发生变化。授粉后，钙分布会重新分配。开花前后及授粉前 后表现出显著的动态变化。 2 2 。3 1 胚囊中的钙分布 刚开花或开花前一天的胚囊中含钙较少，珠心细胞中含较高含量的钙，特别是胚囊周围：细 胞分化后，胚囊细胞中钙含量增高。开花后珠孔端的胚囊壁富含钙。受精后胚囊中的富钙区在胚 乳，靠近珠心的胚囊壁钙含量下降( 余凡立等，1 9 9 8 ，t i a na n dr u s s e l l ，1 9 9 7 ) 。 2 2 3 2 助细胞中的钙分布 开花前两个助细胞中的钙含量没有显示出差别，但均比卵细胞与中央细胞的高( 余凡立 等，1 9 9 8 ，1 9 9 9 ) 。开花后两个助细胞中的钙含量出现差异，其中即将退化的那个含量更高，其 中一个钙含量增加明显，主要集中在核区，以及两细胞的公共壁、丝状器尤其是在它的端部( 余 凡立等1 9 9 8 。1 9 9 9 ：t i a na n dr u s s e l l 。1 9 9 7 ) ：( 虽然未授粉的两个助细胞中的钙含量均比开花前增 加但是两个助细胞之间没有明显差别( t i a na n dr u s s e l l ，1 9 9 7 ) 。助细胞在吸引花粉管长入胚囊 起关键作用。早在1 9 6 5 年，j e n s e n 就发现棉花助细胞中钙含量较高。近来由于技术上的改进， 对助细胞中钙分布特征的研究有了明显进展。在所调查植物中( 白花丹除外) ，助细胞是胚囊中 4 第一部分文献综述 钙含量最高的成员且呈极性分布，从珠孔端到合点端钙含量递减。尤其是丝状器中积累了丰富 的钙( 余凡立等1 9 9 8 ：c h a u b l ea n dr e g e r , 1 9 9 2 a , 1 9 9 2 b ，1 9 9 4 ；t i a na n dr u s s e l l ，1 9 9 7 a ) o 但在向 日葵助细胞中，钙的梯度分布呈现从珠孔端到合点端递增( h e a n d y a n g ，1 9 9 2 ) 。在小麦、珍珠谷、 油菜和向日葵的成熟胚囊中，姊妹助细胞的钙含量没有明显差异( 余凡立等1 9 9 8 ：c h a u b l ea n d r e g e r , 1 9 9 2 a , 1 9 9 2 b ，1 9 9 3 1 9 9 4 ：h e a n dy a n g 1 9 9 2 ) 。但在烟草和矮牵牛( p e t i n i a h y b r i d a lj 中， 姊妹助细胞的钙含量差异明显( h u a n g a n dr u s s e l l ，1 9 9 2 ：t i r l a p u r e l a l ，1 9 9 3 ) ，尤其是烟草退化 助细胞中的钙含量高于宿存的助细胞( h u a n g a n dr u s s e l l ，1 9 9 2 ) 。以后t i a n 和r u s s e l l ( 1 9 9 7 a ) 的研究证实，花粉管正是进入钙含量较高的退化助细胞中。 助细胞中的钙含量受花粉管的影响。向日葵成熟胚囊的姊妹助细胞的钙含量没有明显差异， 但传粉后退化助细胞中的钙含量剧增( h ea n dy a n g , 1 9 9 2 ) 。油菜传粉前两个助细胞中的钙含量和 分布相似，传粉后，两个助细胞中的钙含量增加了2 4 倍，同时。姊妹助细胞在钙沉淀颗粒大小 上显示出差异，接受花粉管的助细胞中钙沉淀颗粒较小( 余凡立等，1 9 9 8 ) 。另一方面在烟草去 雄后5 天的花中，助细胞丝状器仍含有丰富的钙只有花粉管进入胚囊后丝状器中的钙含量才 迅速降低( t i a na n dr u s s e l l ，1 9 9 7 a ) 。这些结果显示，花粉管与助细胞之间有一种相互作用的信号 传导机制：助细胞中的钙引导着花粉管的进入，而即将到达的花粉管又引起助细胞中钙含量与分 布的变化。很可能正是这种相互作用下，花粉管准确的进入助细胞。 烟草花粉管进入助细胞后，退化或宿存的劲细胞中的钙迅速扩散到珠心细胞中( t i a na n d r u s s e l l 。1 9 9 7 a ) 。与珠孔部位的钙分布动态相似，在一个花粉管进入后，助细胞中的钙含量迅速 降低可能也起着防止其他多余花粉管进入胚囊的作用( c h a n b l ea n dr e g e r , 1 9 9 0 ，1 9 9 2 b ) 。 助细