（分析化学专业论文）yvo4eu荧光纳米粒子的合成及其在生物分析中的应用.pdf

j-1， at h e s i si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y 删嬲 s y n t h e s i so fy v 0 4 ：e uf 1 u o r e s c e n tn a n o p 抓i c l e s a n di t sa p p l i c a t i o ni i lb i o l o g i c a la n a l y s i s b yc h e n gl i y a n s u p e r v i s o r ： c ep r o f e s s o r ly o n 9 1 i n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i 坶 j a n u a r y2 0 0 8 1 夕 一 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得的研 究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过的研 究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：成幸丑手匕 日期：o 口g 二加 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论文 的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北大学可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： ，k，；一 -， ，呵 东北大学硕士学位论文 摘要 w 0 4 ：e u 荧光纳米粒子的合成及其在生物分析中的应用 摘要 近年来，纳米生物标记技术的研究十分引人注目。纳米生物标记技术在人类重大疾 病诊断、生物芯片技术、细胞和生物成像技术、强致病性病原菌的快速检测与预警、生 物领域反恐等诸多领域已显示出很好的应用前景。稀土荧光纳米粒子由于具有s t o k 骼 位移大、荧光发射强度高、半峰宽窄和荧光寿命长等独特的光谱特性，将稀土荧光纳米 粒子作为标记物应用于生物分析可以显著提高检测的灵敏度，因此具有很好的应用前 景。 本实验采用水相法合成y v 0 4 ：e u 荧光纳米粒子，考察了反应温度、时间、反应物 的p h 值和摩尔比、铕离子的掺杂百分比和最佳使用浓度等实验条件对合成粒子荧光性 能的影响，并对合成的w 0 4 ：e u 粒子进行了) ( 】m 、t e m 、双表征和粒度分析，最后用 制备的纳米粒子标记了牛血清白蛋白和亲和素。 研究结果表明，合成y v 0 4 ：e u 纳米粒子的最佳条件为：反应温度9 0 ，反应时间 1 2 0 分钟，稀土离子、柠檬酸钠和偏钒酸钠溶液的p h 值分别为1 o 、6 5 和1 2 7 ，稀土 离子、柠檬酸钠和偏钒酸钠的摩尔比为4 ：3 ：3 ，掺铕百分比为2 0 和粒子的最佳使用浓 度为3 1 0 。4 m o l l 1 。合成粒子的x r d 和t e m 的结果表明，合成的w 0 4 ：e u 纳米粒子 粒径小于4 0l l i i l ，结晶度和分散性良好。 用该粒子通过静电作用成功标记了牛血清白蛋白，当牛血清白蛋白浓度在o 2 2 o p g m l 1 时，w 0 4 ：e u b s a 和w 0 4 ：e u 粒子溶液的荧光强度之差与牛血清白蛋白的浓度 成正比，线性方程y - _ 5 6 9 6 c + 2 6 7 7 ，相关系数0 9 9 8 5 。在p h 值为7 4 的磷酸缓冲溶液 中，用y v 0 4 ：e u 纳米粒子通过静电作用成功标记了亲和素，标记亲和素保留了原有的 反应活性，可以和生物素发生特异反应。实验结果表明，合成的w 0 4 ：e u 荧光纳米粒 子可以作为通用的荧光标记物用于生物分子检测。 关键词：y v 0 4 ：e u 荧光纳米粒子；标记；静电作用；牛血清白蛋白；亲和素 i堆；01 ir，气： 东北大学硕士学位论文 a b s n a c t s y n t h e s i so fw 0 4 ：e u f l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e sa n di t s a p p l i c a t i o ni nb i o l o g i c a la n a l y s i s a b s t r a c t i i lr e c e n ty e a r s ，t l l ea c l l i e v e m e i l t sd b o u tt l l e s t u d yo fn a i l o p a n i c l e su s e df o rm 矾( e 馏i n b i o l o 百c a la r e aa r en o t i c e a b l e t h et e c i u l o l o g yo fn 肌o p a n i c l e sm a r k e ri nb i o l o 百c a la r e ah a d s h o w ng o o dp r o s p e c t si nm ea r e 勰o fd i a g n o s i so fm 旬o rd i s e a s e so fm a r l k i n d 、b i o c h i p t e c i u l o l o g y 、c e l l u l a r 锄db i o l o 西c a li m a 百n g 、m er a p i dd e t e c t i o no fs 仃d n gp a t l l o g “cp a t l l o g e i l a n de a r l yw 锄i n g 、a n da n t i - t e r r o r i s mo fm e b i o l o 百c a la r r a r ee a m l1 u m i n e s c e n tm a f k e r s ha _ v em ea d v a l l t a g e so fl 盯g es t o k e ss l l i f t 、l l i g l lf l u o r 懿c e i l c ee m i s s i o ni n t e i l s i t y 、n a r r o wh a l f 锄i s s i o np e a k sa i l dl o n gf l u o r e s c e l l c el i f e t i m e u s i n go ft l l 伪es p e c i a ln 觚o p a n i c l e s 鹪 b i o l o 百c a la n a l 如c a l lm a r k e r sc 觚i m p r o v em ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fb i o l o 百c a lm o l e c u l e s ，s o 1 e yh a v ea b r o a dp r o s p e c ti n 印p l i c a t i o n h e r e ，t l l ew 0 4 ：e un u o r e s c 饥tn 趾o p 矾i c l e sw e r es y n m e s i z e db yaw a t e rb a m 1 1 1 ee 仃e c t o fe x p 嘶m 肌t a lc o n d i t i o n s ，s u c h 觞t l l er e a 砸o nt 伽l p 蹦抛r e 觚dr e a c t i o nt i m e ，m ep hv a l u 骼 a 1 1 dm o l a rr a t i oo fm er e a c t a i l t s ，m ep e r c e n t a g eo f 伽r o p i u mi o nd o p i n gc 0 n c 朗仃a t i o i l s 锄dm e b e s tc o n c e i l 仃a t i o no fw 0 4 ：e un a n o p a n i c l 髓s o l u t i o 玛o nn u o r e s c e n tc h a r a c t 懿o fw 0 4 ：e u n 觚o p a n i c l 鹪w e r es t u d i e d t i l ep r 印砌w 0 4 ：e uf l u o r e s c 饥tr 姗0 p a r t i c l 鹤w e r e c h a m c t e r e db y ，t e m ，p a n i c l es i z ed i s t r i b 砸o na n d 瓜f i n a j l y ，t l l ep r 印a r e dy v 0 4 ：e u f l u o r e s c e n tn a i l o p a r t i c l e sw e r eu s e dt 0l a b e lb ov i s e m ma l b 疵na n da v i d i i lb ye l e c 缸0 s t 撕c ，7 1 1 1 e r e s u l t ss h o w e dm a tm eb 髓tc 0 n d i t i o n st 0s y i l m 懿i z ey v 0 4 ：e un a i l o p a r t i c l 髓w e r e 勰 f o l l o w s ：t h er e a c t a n t sr e a c t e da t9 0 f o rl2 0m i n u t e s t h ep hv a l u 鹤o fr a r ee a m li o n s 、 s o d i u mc i t r a t ea i l ds o d i u mm e t a v a i l a d a t es o l u t i o nw e r e1 o 、6 5a n d12 7r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t so f m 、t e ma n dp a n i c l es i z ed i s t r i b u t i o ns h o w e dt l l a tt 1 1 ea v e r a g ed i 眦l e t e ro f w 0 4 ：e un a n o p a n i c l e sw 嬲b e l o w4 0m ，w i mg o o dc r y s t a l l i z a t i o n 锄dm o n o d i s p e r s i o n t l l ey v 0 4 ：e un a n o p 抓i c l e sc a nc o u p l ew i t hb s ab ye l e c 仃0 s t a t i ci n t e r a c t i o n ，锄dt h e m a 哂n so fn u o r e s c e l l c ei n t e n s i t yb e 帆e e i ly v 0 4 ：e u b s a 锄dy v 0 4 ：e us o l u t i o nw e r e p r o p o n i o n a lt ot 1 1 ec o n c e n t r a t i o no fb s a w h i c hw 勰i nr a n g eo fo 2t o2 op g m l 一t h el i n e a r e q u a t i o nw 淞y = 5 6 9 6 c + 2 6 7 7 ，w i t i lt l l e c o r r e l a t i o nc o e 衔c i e n to f0 9 9 8 5 i i lt l l e i i i 一 rkr；。 东北大学硕士学位论文 a b s t r a c t p h o s p h a t e - b u f | f e r e ds o l u t i o no fp h7 4 ，t h ey v 0 4 ：e un 盟o p 枷c l c sc a nl a b da “d i nb y e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o ns u c c e s s m l l y m o r e o v a v i d i ns t i l lk 印tt l l e i ra c t i v i t ) rt l l a tt h e yr e a c t e d w i md - b i o t i ns p e c i f i c a l l l y t 1 1 ee x p 甜m c n t a lr e s u l t ss h o w e dt l l a tm es ) ，1 1 t h e s i z e dy v 0 4 ：e u n a l l o p a n i c l e sc a nb el i s e da sac o m m o nf l u o r e s c e n tm a r k e r sf o rm ed e t e c t i o no fb i o l o 百c a l m o l e c m e s k e yw o r d s ：w 0 4 ：e uf l u o r e s c 饥tn 锄o p a n i c l e s ；l a b e l ；e l c c 们s t a t i ci n t e m c t i o n ；b s a ；a v i d i i l 一一 于 | c i g j 东北大学硕士学位论文 目录 目录 独创性声明i 摘要i i a b s t i a c t i i i 目录v 第一章绪论l 1 1 纳米材料l 1 1 1 纳米材料的定义和性质l 1 1 2 纳米材料的制备2 1 2 纳米材料在生物分析中的应用3 1 2 1 纳米金4 1 2 2 半导体量子点4 1 2 3 高分子纳米微球5 1 2 4 稀土螯合物纳米球5 1 2 5 纳米材料的表面修饰6 1 3 稀土荧光纳米粒子及其在生物分析中的应用9 1 3 1 稀土荧光纳米材料的制备9 1 3 2 稀土荧光纳米材料的表面修饰l o 1 3 3 稀土荧光纳米粒子在生物分析中的应用。l o 1 4 本论文标记的生物试剂1 2 1 4 1 牛血清白蛋白1 2 1 4 2 生物素亲和素系统1 2 1 5 本论文的研究意义和内容1 3 第二章w 0 4 ：e u 荧光纳米粒子的合成与表征1 5 2 1 实验仪器和试剂1 5 2 2 实验方法1 5 2 2 1 主要试剂的配制1 5 一v 一 东北大学硕士学位论文 目录 2 2 2y 、厂0 4 ：e u 纳米粒子的合成1 6 2 2 3 荧光测定1 6 2 2 4 y 、，0 4 ：e u 纳米粒子的表征1 6 2 3 结果和讨论一1 7 2 3 1 实验条件的优化一1 7 2 3 2y v 0 4 ：e u 纳米粒子的荧光光谱和发光机理2 4 2 3 3 量子产率的计算2 6 2 3 4w 0 4 ：e u 纳米粒子稳定性和分散性的考察2 6 2 3 5y 、，0 4 ：e u 纳米粒子的x 射线衍射图2 7 2 3 6w 0 4 ：e u 纳米粒子的透射电子显微镜成像2 9 2 3 7w 0 4 ：e u 纳米粒子的粒度分布2 9 2 3 8w 0 4 ：e u 纳米粒子的红外光谱3 0 2 4 本章小结3 0 第三章用w 0 4 ：e u 荧光纳米粒子标记牛血清白蛋白3 l 3 1 实验仪器和试剂3 l 3 2 实验方法。31 3 2 1 主要试剂的配制3 l 3 2 2w 0 4 ：e u 纳米粒子标记牛血清白蛋白3 l 3 2 3 荧光测定方法。3 2 3 3 结果与讨论3 2 3 3 1y v 0 4 ：e u 标记b s a 前后的荧光光谱3 2 3 3 2 实验条件的优化3 3 3 3 3b s a 浓度对w 0 4 ：e u b s a 溶液荧光强度的影响3 7 3 4 本章小结3 8 第四章用y v 0 4 ：e u 荧光纳米粒子标记亲和素3 9 4 1 实验仪器和试剂3 9 4 2 实验方法。3 9 4 2 1 主要试剂的配制3 9 4 2 2y v 0 4 ：e u 荧光纳米粒子标记亲和素4 0 一一 i o | 东北大学硕士学位论文 目录 4 2 3 被标记亲和素与生物素的特异反应4 0 4 2 4 荧光测定4 0 4 3 结果和讨论4 l 4 3 1w 0 4 ：e u 荧光纳米粒子标记亲和素4 l 4 3 2 被标记亲和素和生物素的特异反应4 2 4 4 本章小结4 7 第五章结论4 8 参考文献4 9 致 谢5 5 一v i i ， 东北大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论帚一早瑁 了匕 生命科学的快速发展使生化分析成为现代分析化学发展最重要的前沿领域之一。近 年来纳米材料与生物检测技术的结合，使生物分子的检测有了重要的发展，这一交叉学 科现在也已经成为生物分析领域最具活力的研究方向。由于纳米生物探针的引入，使以 前无法实现的检测项目逐渐成为可能。纳米生物探针也正在常规免疫分析、生物芯片、 荧光生物成像测定、癌细胞的转移与示踪、生物分子多颜色多组分同时标记检测、食品 及环境中强致病性病原菌的检测以及生物反恐等领域发挥着越来越突出的作用，这方面 的研究进展十分引人注目。 1 1 纳米材料 1 1 1 纳米材料的定义和性质 纳米是英文n a n o m e t e r 的译音，是一个物理学上的度量单位，l 纳米是l 米的十亿 分之一。当粒子达到纳米尺度以后，例如在l 1 0 0n m 这个范围之间，物质的性能就会 发生突变，出现特殊性能。这种具有既不同于原来组成的原子、分子，也不同于宏观物 质的特殊性能的材料，即为纳米材料。 当材料的结构进入纳米尺度调制范围时，会出现表面和界面效应、小尺寸效应、量 子尺寸效应和宏观量子隧道效应等纳米效应f i 】。 纳米材料的表面效应，指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径的变小而急 剧增大所引起的性质上的变化。当粒径降到1 咖时，表面原子数比例达到约9 0 以上， 原子几乎全部集中到纳米粒子的表面。由于纳米粒子表面原子数增多，表面原子配位数 不足和高的表面能使这些原子易与其它原子相结合而稳定下来，故具有很高的化学活 性。 当纳米粒子的尺寸与光波的波长、传导电子的德布罗意波长以及超导态的相干长度 或投射深度等物理尺寸相当或比它们更小时，周期性的边界条件被破坏，声、光、电、 磁、热力学特性等均会随着粒子尺寸的减小发生显著的变化。这种因尺寸的减小而导致 的变化称为小尺寸效应，也叫体积效应。 量子尺寸效应是指纳米粒子尺寸减小到一定值时，费密能级附近的电子能级由准连 续变为离散能级的现象。纳米材料也必然因量子尺寸效应使其与常规材料有显著的不 同。例如，导电的金属在超微颗粒时可以变成绝缘体，磁矩的大小和颗粒中电子是奇数 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 还是偶数有关，比热亦会反常变化，光谱线会产生向短波长方向的移动，这就是量子尺 寸效应的宏观表现。 微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。研究发现某些宏观量如微粒的磁化强 度、量子相干器件中的磁通量以及电荷等也具有穿越宏观系统的势垒而产生变化的隧道 效应。 1 1 2 纳米材料的制备 目前制备纳米材料常用的方法主要有固相法、液相法、气相法。固相法主要有低 温粉碎法、超声波粉碎法、热分解法、爆炸法。气相法主要有真空蒸发法、相化学反应 法、高温等离子体法、油面蒸发法。液相法应用较多，这一方法又可分为液相物理法和 液相化学法。这里介绍几种常用的液相化学法。 1 1 2 1 沉淀法 沉淀法是在金属离子溶液中加入沉淀剂，如氨水、氢氧化钠、尿素、草酸、碳酸氢 铵等，生成沉淀，将沉淀过滤、洗涤后溶于有机溶剂将其分散，然后蒸发干燥。沉淀法 主要有氢氧化物沉淀法、均相沉淀法、草酸盐沉淀法和络合一沉淀法。 1 9 9 5 年m a n i l ll 等【2 1 用均相沉淀法合成了l a 2 0 3 颗粒。详细讨论了起始金属离子浓 度、沉淀剂浓度、溶液的p h 和焙烧温度对颗粒形貌的影响。实验结果表明，合成的l a 2 0 3 颗粒为1 岬左右的球形。 1 1 2 2 水热法 水热法是在特制的密闭反应容器( 高压釜) 里，采用水溶液作为反应介质，通过对反 应容器加热，创造一个高温、高压反应环境，使得通常难溶或不溶的物质溶解并且重结 晶。 管航敏等【3 1 报道了用水热法制备b a o - n d 2 0 3 t i 0 2 ( b n t ) 系纳米粉体。在k o h 碱性溶 液中，以t i c l 4 ，b a c l 2 和n d ( n o ) 3 为反应物，先制备出b a o - n d 2 0 3 t i 0 2 ( b n t ) 凝胶前驱体， 再经低温水热处理，得到b n t 系纳米粉体。结果表明，用该法获得的b n t 系纳米粉体为 立方相结构，稀土元素掺杂均匀，产物粒径小，分散性好。 1 1 2 3 微乳液法 微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水组成的热力学稳定体系。从理论上 讲，用该法可以制备粒径在l l o 衄的单分散超微粒。 施利毅等【4 1 采用微乳液反应法制备了二氧化钛超细粒子，以含n h 3 h 2 0 和t i c l 4 的两 一2 一 东北大学硕士学位论文第一章绪论 种微乳液经混合、反应，得到t i 0 2 超细粒子前驱体水合t i 0 2 ，然后在不同温度下对水合 的t i 0 2 进行煅烧，结果表明，经6 5 0 煅烧后粒子为锐钛型t i 0 2 ，平均晶粒尺寸为2 4 6i m ， 经l o o o 煅烧后粒子为金红石型t i 0 2 ，平均粒径尺寸为5 3 5 啪。 1 1 2 4 醇盐水解法 醇盐水解法是金属与醇反应，生成的金属醇盐水解形成氢氧化物或水合物，再脱水 得到超微粉。此法引入杂质的可能性小，制备的粒子纯度高，粒径小，分散性好，不易 团聚。但金属醇盐成本高，而且有些金属醇盐不溶于醇，制备的氧化物种类有限。 薛涛等【5 】以a l c l 3 为原料，用金属醇盐水解法制备纳米a a 1 2 0 3 粉体。实验结果表明， 所得到的氧化铝为纳米级粉体，产品为a 相，用透射电子显微镜测得粉体粒径为l 啦3 5 n m ，平均粒度为2 5 姗，颗粒形状呈球形，粒子分散均匀。 1 1 2 5 溶胶凝胶法 溶胶凝胶法是制备稀土纳米材料的重要方法。在低温下，有机金属化合物或有机 络合物通过聚合或水解反应，形成溶胶，在一定条件下形成凝胶，进一步热处理，可得 纳米颗粒。该方法可在温和的条件下进行，得到的粉体比表面积大，分散性好。但反应 时间长，需数日才能完成。 w a l l g 等【6 】采用溶胶一凝胶法制备了纳米t i 0 2 ，将一定量异丙醇盐t i ( o c 3 h 7 ) 4 溶入无水 乙醇，然后与一定比例的醇水溶液混合，室温下剧烈搅拌2 小时，分离得到的白色沉淀 用两种方式进行焙烧，一是4 5 0 下在有氧环境中煅烧，得到了粒径为2 0 力m 的t i 0 2 纳米 颗粒，二是在水热调节下分别在8 0 、1 8 0 、2 4 0 反应1 4 天得到了粒径分别为6n m 、 l ol l r n 、2 8 姗的t i 0 2 纳米颗粒。 1 1 2 6 超声化学法 超声化学法是利用超声波的空化作用瞬间产生的高温( 5 0 0 0k ) 、高压( 2 0m p a ) 以 及极高的冷却速率( 1 0 1 0 刚s ) 等极端条件促使氧化、还原、分解和水解等反应的进行来制 备纳米粒子。s u s l i c k 等【7 1 率先采用超声化学法制备粒径均一的铁纳米粒子，他们以挥发 性有机金属铁化合物如五羰基铁【f e ( c o ) 5 】为原料，以聚乙烯基吡咯烷酮( p v p ) 或油酸为 稳定剂，合成了粒径( 8n m ) 均一的无定形f e 纳米粒子。随后这一方法被广泛地用来制备 形貌可控的铁、钻及其氧化物纳米粒子【8 】。 1 2 纳米材料在生物分析中的应用 由于纳米材料独特的性质，纳米材料的应用领域不断扩大，将纳米材料用于生物分 一3 一 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 析是近十几年的事情。目前，主要有以下4 种类型的纳米粒子用作生物分子探针：( 1 ) 金 纳米粒子；( 2 ) 半导体量子点；( 3 ) 高分子纳米微球；( 4 ) 稀土螯合物纳米球。由于纳米 标记材料的制备技术、标记方法和应用领域的不断发展以及相关检测技术的发展成熟， 纳米生物分子探针在人类重大疾病诊断、生物芯片技术、细胞和生物成像技术、强致病 性病原菌的快速检测与预警、生物领域反恐等诸多领域已显示出很好的应用前景。 1 2 1 纳米金， 直径在l 1 5 0 衄之间的纳米金粒子分散在水溶液中，生成胶体金溶液。胶体金属 于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。 胶体金作为标记物用于免疫组织化学始于19 71 年，f a u l k 等【9 】应用电镜免疫胶体金 染色法( i g s ) 观察沙门氏菌，此后他们把胶体金与多种蛋白质结合。1 9 7 4 年r o m a n 0 等【1 0 】 将胶体金标记在第二抗体( 马抗人i g g ) 上，建立了间接免疫胶体金染色法。1 9 8 7 年， h o l g a t e 等人【i l 】把金催化银还原现象运用到组织化学的研究中来，创立了免疫金银染色 法( i g s s ) 。胶体金在免疫化学中的这种应用，又被称为免疫金。之后，许多学者进一步 证实胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变。它可以作为 探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精 确定位，也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位，因而在临床诊断及药物 检测等方面的应用已受到广泛的重视。目前电镜水平的免疫金染色( i g s ) 、光镜水平的免 疫金银染色( i g s s ) 以及肉眼水平的斑点免疫金染色技术日益成为科学研究和临床诊断 的有力工具。 1 2 2 半导体量子点 量子点( q u a n t 吼d o t s ，q d s ) 是指半径小于或接近于激子玻尔半径的纳米晶体【1 2 躬】。 它们多数由i i 族或i v 族元素组成【1 4 1 ，性质稳定，能够接受激发光产生荧光，具有 类似体相晶体的规整原子排布【1 5 1 6 l 。当半导体材料的尺寸达到纳米尺度后，材料中的载 流子将被限制于一个很小的范围，能量将发生量子化。量子点具有以下光学特点：( 1 ) 具 有宽的激发波长范围及窄的发射波长范围，这样就可以使用同一种激发光同时激发多种 量子点，发射出不同波长的荧光。而荧光染料的激发光波长范围较窄，需要多种波长的 激发光来激发多种荧光染料，给实际工作带来了很多的不便；( 2 ) 量子点的发射峰窄而 对称，重叠小，而荧光染料发射峰不仅宽，而且不对称，拖尾严重，互相重叠严重，容 易互相干扰，给分析检测带来难题；( 3 ) 量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成 一4 一 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 来调谐，可以随意合成所需波长的量子点，大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布；( 4 ) 好的量子点的荧光强度能达到普通荧光染料的2 0 倍左右，稳定性是普通荧光染料的1 0 0 倍左右，几乎没有光漂白现象，可以对所标记的物体进行长时间的观察【1 7 m 】；( 5 ) 量子 点生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，对生物体危害 小，可进行生物活体标记和检测，而荧光染料一般毒性较大，生物相容性型1 9 1 。由于上 述诸多优点，对量子点的合成制备、修饰以及在各个领域的应用研究都取得了突破性进 展【2 0 。2 1 1 。 汪乐余等【2 2 1 报道了无机纳米溶胶c d s 的合成，并对其进行了功能化修饰。研究了 功能性c d s 纳米溶胶的荧光性质。用合成的功能性c d s 纳米溶胶对小牛胸腺d n a 进行 了定量测定，考察了各种影响因素，在最佳实验条件下，该方法的线性范围0 1 1 5 m g l - 1 ，检测限为o 0 1 8m g l - 1 。与传统的有机染料相比，该方法简单、快速、灵敏度高。 1 2 3 高分子纳米微球 高分子纳米微球是以聚苯乙烯、聚烷基氰基丙烯酸酯等为微粒介质材料，在微粒表 面键合或吸附荧光素( f 1 u o r e s c e i i l ，如f i t c 等) 、罗丹明( 如i m o d 锄i n e6 g ) 、菁色素( c y 染 料) 等荧光物质的纳米微；i 宣【2 3 彩】。由于大部分的荧光染料存在于微粒的表面，受不到高 分子介质的有效保护，因此虽然纳米微粒的荧光强度有所增强，但依然无法解决外部空 气氧化和光漂白荧光强度降低等问题。此外，一种用聚苯乙烯等高分子材料包裹b 二酮 铕荧光配合物的高分子荧光纳米微粒被开发出来【2 砚9 】。与普通有机荧光染料的高分子微 球不同，这种荧光纳米微球用作荧光标记物，采用时间分辨荧光方法检测，可以获得很 高的检测灵敏度，已经被应用到前列腺特异抗原( p s a ) 的免疫检测，检测下限可以达到 0 2 1n g l ，检测上限达5 昭l 。 1 2 4 稀土螯合物纳米球 稀土与某些有机小分子配位体即螯合剂形成络合物后，由于配位体本身性质、中心 离子配位体成键及溶剂等因素影响，使它们的化学性质发生变化，络合物的激发寿命 达m s 数量级，且发出很强的离子荧光，稀土的络合物常被用作控制无辐射能量的给予 体( 3 0 3 1 1 。 已经合成出的稀土配位体主要有p - 二酮类( p - d i k e t o n e s ) 、羧酸衍生物类( c a r b o x y l i c a c i dd 嘶v a t i v e s ) 、三联苯类( t e 印h e l l y ll i g a n d s ) 以及蛋白质类( p r o t e i n s ) 配体等。随着研究的 不断深入，用二氧化硅、氧化锆、二氧化钛等包裹稀土螯合物制成的纳米球已经用于生 一5 一 东北大学硕士学位论文第一章绪论 物分析检测，并显示出很好的发展空间。 2 0 0 5 年叶志强等【3 2 1 用二氧化硅包裹的b p t a t b 3 + 制备的功能化纳米球，用功能化的 纳米球标记甲胎蛋白( a f p ) 多克隆抗体，利用时间分辨免疫分析法测定了人血清中的甲 胎蛋白的含量，线性范围o 1 0 1 0 0n g m l - 1 ，检出限为o 1 0n g m l - 1 。 2 0 0 6 年谭明乾等【3 3 】将二氧化钛包裹b h h c t e u 3 + 制备的纳米球标记到链亲和素上， 一 利用生物素和亲和素非常强的特异性结合，将纳米球标记到生物素化的p s a ( 前列腺特异 抗原) 多克隆抗体上，利用时间分辨免疫分析法成功地测定了人血清中的p s a ，当p s a 浓 度范围在o 0 1 5 0n g m l 。之间时，工作曲线显示了很好的线性响应，该方法的检测限为 6 6p g m l 1 。 1 2 5 纳米材料的表面修饰 为将荧光纳米颗粒用于生物分析，对颗粒进行表面修饰是一个十分重要的环节，进 行修饰主要有以下两个目的【3 4 】：( 1 ) 表面效应是影响纳米粒子性质的一个不可忽视的因 素，对于荧光纳米颗粒来说，表面缺陷往往充当电子和空穴的无辐射复合中心，导致荧 光量子产率的降低，因此在合成中和用于生物标记的过程中必须保证纳米颗粒的表面不 受到破坏，通过表面修饰在纳米颗粒表面形成保护层，可以增强纳米颗粒的光稳定性和 化学稳定性。( 2 ) 水溶性是纳米颗粒用于生物标记必备的首要条件，除水相合成的纳米颗 粒外，其余常用的荧光纳米颗粒均只能在有机溶剂中分散，因此必须选择适当的相转移 剂将其转至水相中，同时还必须保证纳米颗粒的稳定性和荧光性质不变。 荧光纳米颗粒的表面修饰可分为以下几类： 1 2 5 1 用有机小分子修饰粒子表面 纳米粒子按表面性质不同可以分为水溶性、油溶性及两亲性纳米粒子，对于不同类 型的纳米粒子需要采用不同的表面修饰方法使其具有生物相容性。对于采用共沉淀法制 。 备的无稳定剂修饰的纳米粒子，可以先将其溶解在酸性水溶液中，然后用生物相容性的 有机小分子来修饰粒子表面，或者是在制备纳米粒子的过程中直接加入生物相容性的小 分子如天冬氨酸或谷氨酸、2 ，3 二巯基丁二酸、柠檬酸、磷酰维生素b 、y 环糊精等来 修饰纳米粒子，使其具有生物相容性。对于油溶性的纳米粒子，通常可采用下述两种方 法实现其水溶性和生物相容性： ( 1 ) 通过修饰剂与稳定剂之间的特殊相互作用实现粒子溶液的水溶性。y a n g 等【3 5 】 巧妙地利用油酸和a 环糊精的主客体相互作用，成功地制得水溶性磁性纳米粒子，如图 东北大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 所示。这一方法还可以应用到油酸稳定的其他纳米粒子体系，如a g 纳米粒子等。2 0 0 3 年s a n d e r f w u i s t e r 等【3 6 】用巯基丙酸修饰c ( 1 t e 量子点，获得了高发光水溶性的量子点。 y a v 舜三 h e x a n e 锵器梦 一一 a 怕r ：港o l e i ca c i ds 协b 妇蜘p a n j d e a c o 图1 1 用口环糊精将油酸包覆的纳米粒子由油相转移到水相示意图 f i g 1 1a 8 c h 锄a t i ci l l u s 舰t i o no f 仃蚰s 衙o fo l e i ca c i ds t a b i l i z e dn 锄o p a n i c l 鹤 丘i o mo r g 肌i ci l l t oa q u 懈p h 弱eb ys u m u m o d i f i c a t i o nl l s i i l gc d ( 2 ) 通过配体交换反应实现粒子溶液的水溶性。f 锄等【3 7 】首先用n 碘甲基_ 4 ，4 联 吡啶与6 溴己酸反应得到羧基化的联吡啶季铵盐，用来置换粒子表面的油酸、油胺，最 后用氨基化的b i o t i n 与粒子表面的季铵盐反应得到b i o t h l 标记的适用于蛋白分离提取的 丫- f e 2 0 3 纳米粒子。 1 2 5 2 用有机高分子修饰粒子表面 由于通过小分子修饰获得的具有生物相容性的纳米粒子在稳定性、抗氧化性和生物 相容性等方面还存在一些问题，目前通常采用的方法是利用具有生物相容性的高分子对 粒子表面进行修饰。生物相容性高分子有天然高分子和合成高分子两大类，天然高分子 主要包括葡聚糖( d e x 仃a n ) 【3 引、淀粉【3 9 】、多肽【删和蛋白质【4 1 】等；合成高分子主要有聚乙 二醇( p e g ) 【3 8 1 、聚乙烯醇( p v a ) 【4 2 】、聚乙二醇聚乳酸( p e g p l a ) 【4 3 1 、聚( n 异丙基丙烯酰 胺) 及其共聚物等【州。2 0 0 4 年t e r e s ap e l l e 鲥n o 等【4 5 】用聚( 马来酸酐基1 十四碳 烯) p o l y ( m a l e i c 锄h y d r i d ea l t - 1 - t e t r a d e c e ) 和二( 6 - 氨己基) 胺 b i s ( 6 - a m i n o h e x y l ) 锄i n e 包 覆f e 2 0 3 ，a u 和c d s e z n s 等纳米颗粒，实现了它们的水溶性，见如图1 2 所示。 一7 一 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 图1 2 用聚( 马来酸酐基1 - 十四碳烯) 和二( 6 氨己基) 胺修饰纳米粒子示意图 f i g 1 2a s c h 锄eo fn 锄0 p a n i c l 铭m o d i f i e d 诵mp o l y ( m a l e i ca n h 尚d ea l t - l - t e 仃a d e c e ) a i l db i s ( 6 - 锄i 1 1 0 h e x y l ) a m i i l e 1 2 5 3 用二氧化硅修饰粒子表面 s i 0 2 是用于修饰无机纳米粒子表面的理想材料之一，这是由于s i 0 2 具有下列优点： ( 1 ) 可以阻止粒子发生团聚【删；( 2 ) 具有优良的生物相容性、亲水性及非常好的稳定性 【4 7 】；( 3 ) 采用水解有机硅的方法制备尺寸均一的s i 0 2 微球技术已经相当成熟，为制备高 质量的纳米微球提供了保证，而发展成熟的硅化学又为纳米微球的表面生物修饰和硅球 在生物医学中的应用提供了重要保障【4 引。2 0 0 0 年j o h a i l l 磷h 锄叩l 等【4 9 】用二氧化硅修饰 ：y b ，e 啦0 2 s 和：y b ，1 m ) 2 0 2 s 上转换纳米颗粒作为标记物用于免疫分析检测。 1 2 5 4 用非二氧化硅类无机材料修饰粒子表面 除了可以采用有机小分子、高分子和二氧化硅实现纳米粒子的表面修饰外，还可采 用其他种类的无机材料修饰磁性纳米粒子得到具有核壳结构的复合粒子，而这种无栅 无机复合纳米结构的形成又可以赋予纳米粒子更为丰富和优异的物理性质。 无机无机复合纳米粒子的制备研究目前主要集中在f e 、c o 、n i 、m o 、p d 、p t 和 a u 等金属及其合金等体系。w i l l i 锄s 研究小组【则则通过在磁性粒子表面引入a u 修饰层 的方法得到了具有良好生物相容性和稳定性的丫一f e 2 0 3 a u 及f e 2 0 3 a u 。他们首先利 用共沉淀法制备了尺寸为9 胁的水溶性t f e 2 0 3 和f e 2 0 3 纳米粒子，然后用柠檬酸钠置 换粒子表面的o h 离子，形成柠檬酸钠层，再通过它对a u 3 + 的还原，在粒子表面原位地 一8 东北大学硕士学位论文第一章绪论 形成了a m 壳结构，得到了具有壳核结构的y f e 2 0 3 a u 和f c 2 0 3 a u 纳米粒子。在该 体系中，金壳修饰基本不改变磁核的磁学性质，其厚度取决于a u 3 + 溶液的加入量。 1 3 稀土荧光纳米粒子及其在生物分析中的应用 由于荧光分析法的灵敏度高、选