（预防兽医学专业论文）猪伪狂犬病毒冀A株gD基因的克隆、表达及检测.pdf

摘要 本研究利用三种不同的方法提取猪伪狂犬病毒冀a 株的核酸。并根据文献， 设计了一对特舅控号l 物，利用p c r 技术扩增出了p r v 冀a 株豹g d 基毽。经琼 脂糖电泳检测，纯化目的片段与p u c l 8 克隆载体连接，并转化至大肠杆菌j m l 0 9 感受态细骢，送行蓝自掰筛选，得到转亿子经p c r 鉴定鞠酶切分撰筛选出阳淫 克隆。结果表明，作者得到的阳性重组子( p u c l 2 ) 中含有g d 燕因，表明是正 确插入，弗挺羯性壳隆餍粒送大连宝生物公司测序。经核替酸铡彦，该纂因全长 1 1 9 7 b p ，含有一个开放阆读框，编码3 9 8 个氨基酸，与国内外5 株不同来源的海 秣逶行了 0 较，发现冀a 株g d 基蠢存在1 3 处点突变移一楚缺失突变，并发现 p r vg d 在8 1 6 n t 8 3 i n t 处有一处c ( a ) g g c c c 重复商变区，对应于g d 2 6 8 位一2 7 5 位a 罾p f o 重复商变区。使用d l q as t a f 软悻将冀a 株g d 基因核替酸序列与上述 毒株y a n g s a i i 、e a 、f a 、k a 、闽a ( m i n a ) 株的g d 基因序列进行比较，其同 源性在9 8 8 9 9 7 之间。将筵a 株g d 纂因推昏的氨綦酸序列与上述5 个毒 株p r vg d 基因氨基酸序列进行比较，同源牲在7 7 9 7 9 2 之间。可见不同 来源的p r v 毒株g d 基因在核赘酸水平上的阔源瞧较高，键在氨慕酸水平的同源 性则具有一定差异。并绘制了系统发商树，根据系统发育树分析，冀a 株与闽a ( m i n a ) 株表现出了明显的亲缘关系。 作者将正确的重组毙隆质粒p u c l 2 用e c o ri 、b 锄hi 双酶切，电泳回收 目的片段，将目的片段插入经e c o rl 、b a m hi 双酶切处理的p g e x 4 t 3 中， 转化大肠杼菌j m l 0 9 感受态细胞中，得到的转化子经酶切分析，筛选出符合阙 读框的重组子，构建出重组表达质粒p g g d ，并在大肠杆菌b l 2 l ( d e 3 ) 宿主菌中 成功地表达了含目的蛋白的融合蛋白，融合蛋自豹分予量约为5 3 趵，加入 i p t g ( 1 m m o l l ) 诱导6 h 后，蛋白表达达到最高水平。经w e s t 黜_ b l o t t i n g 杂交实 验，目的蛋自与兔抗p r v 冀a 株抗体反应，表明表达产物为p r v 冀a 株g d 蛋 白，且具有一定的反应原性，为制备单特异性抗体夔定了基础。 关键词：猪伪狂犬病毒( p r v ) ；冀a 株；g d 基因；降列分析；克隆；表达 c l o n i n g ，e x p r e s s i o na n dd e t e c t i o no ft h eg dg e n eo fp o r c i n ep s e u d o r a b i e sv i r u s j as t r a i n a u i l l o r ：“ux i a o h u i s u p a 叫s o r ：p r o f e 8 s o ry a n gr u n d e s p e c i a l l y ：p r e v e n t i 、r ev e t 舐n a r ym e d i c i n e a b s t r a c t t h es t u d ys h o w si h eg e n o m i cd n ao fp r vw a se x 廿a c t e dt i l m u g hl h r e ed i 脑舶tm e t h o d s r e f b r r e dt om er e p o r t e dr e f 妇i e b ，ap a i ro fp r i m e r s 、v a sd 瞄i g n e da n ds ”m e s i z e d t h eg dg e o fp r vj as l r a i nw a sa m p l i 6 e db yp c r 1 1 l ep c rp r o d u c t 8w e r ec h e c k e db ya g a r o s eg e l e l e c 廿o p h o r e s i sa n dp u r i 丘e db ya g a r o s eg e ld n a p 谢f i c 撕o n ，1 1 1 ep u r i f i e dp m d i l c t sw e r cc l o n e d i n t op u c l8v e c i o rs u c c e s s f l l u ya n dm ec l o n e dp l 姻m i d sw e r e 圩a 芏l s f 0 珊e di n t oe c 0 1 ij m l 0 9 1 色e s p e c i f i cr o c o m b i n a n tp l a s i i l i dw a si d e n i i 6 e db yp c ra n dr e s 啊c t i o ne n d o n u c l e 躺e8 n a l y s i s t h e f e s u l l si n d i c a t e dm a tt h er o c o m b i n a n tv e c t o rc o n t a i n e dm eg eo fg da tr i g h to r i 肌l a d o no fm e i n s e n t h ep o s i t i v ed o n e dw 黯s e q u e n c e db yt a k a r a 1 1 1 er e s u l 协d 锄o n s 仃a t e d i es i 2 eo f 四 g e w a s l l 9 7 b p i n l e n g t l la 相i n c l u d e da 1 1o p 吼r e a d i n g 舶m ee 1 1 c o d i n gap r o t c i no f3 9 8a m i n o a c i dr e s i d u e s 1 1 1 eh o m 0 1 0 9 i e so fn u c l e o t i d e 锄da m i n oa c i ds e q u e n c e sw e f ec o m p a r e db e n e e l i p r vj as 廿a i na n do m e rn v es t r a i n s - y a n g s a n 、e a 、f a 、k a 卸dm i n a t h er e s u l ti i l d i c a t e dm a tn o t o n l yj a8 t r a i nh 蠲t h i n e e ns p o tm u i a t i o n sa n d0 n ed e f b c tm u t a t i o nb u ta l s op r vj as t r a i nh a s 仰e c ( a ) g g c c cr e p e a iv a r i a b i l i t yi ng d8 1 6 n t - 8 3 l n lw h i c hc o 鹏s p o n d 8w i l ha 瞎- p r o 唧e a t v 撕a b i l i t yi ng d2 6 8 2 7 5 蛐i l l o a c i ds e q u e n c e 1 1 1 ed n ao f g dg 廿l ef m mj as t r a i ns h a 嘲ah 曲 i d e f l t 时b e 脚e e n9 8 8 9 9 7 、v i l ht h a to f r e p o r t e dg dg e n e s n i e 锄i n oa c i dr e s i d u c sp r e d i c t e d s h a r e sa i li d e n t i t yb e l w e 肌7 7 9 7 9 5 w i t l lm a to fo m e rs t r a i n s t h er c s u l t ss h o 、w dt l l a tm e h o m o l o g i 髂o f n u c l e o t i d ew h i c ho r i g i n 舶md i 腩r e n tp r vs t r a i n sw e r eh i g h e ra n dt h eh o m o l o 舀e s o fa m i n oa c i ds e q u e n c e sb e t w e e np r vj as 胁i na n do t l l 盯6 v es n 刊i n 8v a r i e dt oa 跚a t 甑t e i l t ，a p h y l o g e t i ct r e eb a s e do nt l l ep u b l i s h e ds e q u e n c e so f p r vf e f b r e n c es t r a i n sw a sc 伽s t n l c t e d i ti s p r u v e dt h a to b v i o u sr e l a i i v ec o n n e c 石o nl i e sb e t w e e np r 、，j as 嘶n 蚰d ，i i l l - as t r a i n f u 曲e n n o r e ，m e 矗a g m e n tc i l c o d i n gg dw a se x c i s e df r o mt 他p o s i t i v ec l o 鹏p u c l 2w i t h e c 0 ria n db 呦hie 1 1 珂m e ，锄dp u r i f i e db ya g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o n t h e nl h ef h g m e n t w a sc l o n e di n t om ep g e x 4 t - 3e x p r 鹤s i n gv e c l o rd i g e 8 t e db ye c 0 ria n db a l l l hir e s 砸c t i o n e n z y m e t h er e c o m b i n a i l te x p f e s s i n gv e c t o rc o n f o r 直t 1 e dt oar e a d i n gf h m e t h ef 沁i o np r o t e i nw a s 麟p r e 8 8 e di ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 )州t 量lp r e d j 删m o l e l 盯w e i g h to f5 3 k d a p k so ft a r g e t p m t e i nw a sa c h i e v e da t6 ha n e ra d d i n gi p t g ( 1 m m o l 几) t h et a r g e lp m t e i np r e s e l l t e di ni h e s d s - p a g ea t l dr e a c t e dw i mr a b b i ta 埘p r vs e m mi nw e s t 锄b l o t t i n g ，s u g g e s t e dm “m e p r o t e i nc o u l db eu s e da so n eo fc a n d i d 种e da n 石g e n s 1 tp r o v i d e dm eb a s i sf b rf u m ms t u d y i n go n a n t i s i n g l es p e c i a la n d b d d y k e y w o r d s ：p o r c i n ep s e u d o r a b i 郫v i m s ；j as 虹a i n ；g dg e n e ；8 e q u e n c 扯ga n a l y s i s ；c l o n e ；e x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学像论文怒本人在导孵指导下述行的研究 二作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表绒撰写过的研究成采，邕不包含为获得塑垫塞些盘茎或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：刊聪 签字隅彬年多秀劫弱 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦盔照盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关帮f 1 或机构送交论文豹复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑些壅些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后通用本授权书) 学雠文作者签名：到聪 制磁：枥刃施 签字f | 期：蒯年f 月o 强箍字日期：鲫年石月p 日 学位论文作者毕韭后去囱： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 猪伪狂犬病毒冀a 株g d 基困的克隆、表达及检测 1 引言 伪狂犬病( p s e u d o r a b i e s ，p r ) 是由疱疹病毒科( h 印e s v i r i d a e ) n 疆科中的猪i 型疱疹病毒( 习惯 称之为伪狂犬病毒) 所引起的多种家畜和野生动物以发热、奇瘁( 猪除外) 及脑脊髓炎为主要症状 的高度致死性疾病。猪是本病毒最重要的贮存宿主和传染来源。该病属于典型且极难防疫的自然 疫源性疾病之一。我国自1 9 4 7 年刘永纯。增次从猫体内分离出p r v 以来，已有2 0 多个省市报道 流行伪狂犬病并分离出m i n a 、陕a 、a k w 、d q 一8 4 0 l 、s 、鄂a 、京a 等多株p r v 5 6 7 “。 1 1 伪狂犬病病毒粒子结构 伪狂犬病毒是研究较多的一种疱疹病毒，具有疱疹病毒共有的一般形态特征。病毒粒子呈圆 形或椭圆形外观，位于细胞核内无囊膜的病毒粒子直径约1 l 帖1 5 0 ，位于胞浆内带囊膜的成熟 病毒粒子约1 5 1 8 0 ，核衣壳含病毒基因组d n a 和核衣壳蛋白，核衣壳外被一层非晶体状蛋 白样结构所包裹，病毒粒子最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞膜结构衍生而来的脂质双层结构， 囊膜上镶嵌有病毒编码的囊膜蛋白，人多是糖蛋白，这些糖蛋自在p r v 感染细胞时介导着病毒 与细胞之间的相互作用，并对病毒在细胞之间的扩散发挥着重要的作用，也是动物机体的免疫系 统识别的主要靶抗原。 1 2 伪狂犬病毒的分子生物学研究进展 1 2 1 基因组d n a p r v 的基因组是双股线性d n a ，人小约1 5 0 k b ，分子量为8 7 1 0 6 k d ( 计c 含量高达7 3 。 病毒基因组由妖独特区( 1 l i l i q u el o n 窖r e g i o n ，u l ) 和短独特区( u n i q u es h o r tr e 西o n ，u s ) ，以及u s 两侧的末端重复序列m i n a lr e p e a “t r ) 与内部重复序列( i n t e r n a l ，i r ) 所组成。目前接近9 5 的 基因组已经测序，测序工作尚有部分未能完成，这主要是7 3 的o c 含量使测序工作变得非常 困难。当然，p r v 基因组的已测序列是由不同p r v 毒株所测序列“拼凑”起来的。目前已确定的 基因组的复制起点有4 个，分别位于u l 的左端、中部以及两个重复序列区。病毒基因组有一个 大约4 0 k b 的颠倒序列存在于u l 2 7 至u l 4 4 区，基因组这种重排的生物学意义尚不清楚。 目前p r v 基因组中已有6 5 种基因被定位，其中大多数基因的功能已搞清。这些基因可编码 结构蛋白、转录调节因子、毒力蛋白、酶类与病毒d 1 q a 复制、病毒释放有关的蛋白以及作为复 制结合起点。在u l 区已被定位的基因有u l l u l 5 4 共5 6 种，包括了已被测序的糖蛋白g d 、g c 、 g h 、g k 、g l 、g m 、g n 基因、t i ( 基因、碱性核酸酶( a n ) 基因、核苷酸还原酶( r r ) 基因、d n a 多聚酶( p o l ) 基因、d b p ( 1 3 6 k dd n a 结合蛋白质) 基因、m c p ( 主要衣壳蛋白) 基因、i c p l 8 5 蛋白 质基因和早期蛋白( e p o ) 基因等；u s 区已被全部测序，其中被定位的基因有7 种：糖蛋白g d 、g e 、 g g 、g i 基因、蛋白激酶( p k ) 基因、l l k d 和2 8 k d 蛋白基因：在i r 区段中己被鉴定和测序的基 因是立即早期基因( i e l 8 0 ) 和r s p 4 0 ，并且证明不同毒株间的i e l 8 0 基因存在差异口”。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 2 病毒囊膜与糖蛋白 p r v 的囊膜是从高尔基体跨膜区的囊泡中获得的。含有病毒编码的蛋白质( 多数经糖基化修 镰) 形残糖鬣自。目蘸，在p r v 中已发现1 1 种糖爨自，分别命名为g b 9 1 1 ) 、g c ( g l i i ) 、g 联g p 5 0 ) 、 g e ( gi ) 、g g ( g x ) 、g h 、g i ( g p 6 3 ) 、g k 、g l 、g m 和g n ，它们已被定位和测序”1 2 ”。g b 、g c 、 g h 、g k 、垂、g m 、g n 由u l 区歉编码，g d 、鹾、g g 和甜由u s 区段编码，研究发现，这些编 码囊膜糖蛋白以及编码一些酶的基因，在病毒与细胞的相互作用、病毒感染的病理过程和免疫原 性中各具特殊作嗣。除了g g 在p r v 感染细胞进程中大鬃产生并分泌至培养基外，所森其它糖鬣 白都是病毒囊膜的构成成分。其它推测为非糖基化的膜蛋白分别是u l 3 、u l l l 、u l 2 0 、u l 3 4 和u l 4 3 纂因的产物。最近，发现p r v 的u s 9 蛋白也跫一种膜蛋白睁“。 ( 1 ) 必需糖蛋白 g b 位于p r v 基因组的u l 区，获约2 8 k b ，为g i l a 、g i l b 、g i l c 三种糖疆自透过二巯键连 接的复合体，它们的分子薰分别为l l 1 2 5 k d ，6 轧7 4 k d ，5 5 5 8 k d ，均来源于g b 基因编码的 同一蛋白前体，g f i b 和g l i c 由g l l a 水解丽得。g b 是在所有耱蛋白中鼓傈守的，为p r 、，的一种 主要糖蛋自和主要免疫原。b 是病毒的一个重要囊膜组分和中和抗原，对于病毒的感染必不可 少3 ”l ，所有g b 的同源性蛋白都楚各病毒的必需蛋白。g b 还与g c 形成一种糠蛋自复合物，介 导病毒与肝索样受体的结合，而单独的g b 不能与肝素样受体结台”o ”。”。g b 在免疫学上还具有 重大意义，有学者用纯仡的b 免疫小鼠和猪时，再用野毒株p r v 攻击免疫过的小鼠霸| 猪，刚大 大降低其死亡率，从而表明抗g b 的免疫学反应在保护猪免受p r v 感染中起着重要作用。另外， 研究表明g b 至少在引发中和抗体的某些抗原结构域上怒可变的，诸如蚰和g c 等免疫学上重要 糖蛋白的变异性，这也许是p r v 的一个特征，即逃避感染动物的免疫反应，这对p r v 在自然界 的生存跫有利的。 g d 为病毒的主要中和抗原，该基翻的开放阅读框( o r f ) 长为l ，2 0 6 b p ，其o r f 编码4 0 2 个氮 基醴的蛋向质，分子量大小为5 6 0 k d 。g d 具有糖蛋白固有的特征( 包括信号肤、跨膜区以及与 细胞膜受体结台部位) 。g d 能识别另一类缨胞表瓤受体一脊髓灰质炎病毒受体家族，分导病毒 与靶细胞的稳定结合，参与病毒感染的穿入过程，是病毒复制和细胞融含所非必需的 j ”。p r v 感 染驰v 醯。细胞在舂弛 e a m y c i n 存在豹条辱孛f ，其表达的糖蛋是的分子餐并未改变，两在m s i n 存在的条件下，其表达的g d 糖蛋白的分子量减少为4 5 k d ，又因g d 对e n d o h 酶不敏感，可以推 断g d 不含k 一糖基化结构，两楚以“齄基化形式存在的1 4 j ”j ，p r 、，在感染细胞时，蓑先是譬c 与细胞表面的蛋白多糖结含，其次是g d 与之牢固结合，所以g d 为病毒感染必需的结构蛋白， 并参与病毒的穿透过程，而毪是瘸毒囊膜与瑰浆膜融台必不可少豹，毽与其它瘛疹病毒豹g d 相 反，p r v g d 对于感染细胞与邻近非感染细胞的融合是非必须的。g d 是一种重要的中和抗原，用 表达g d 的细耱溶解物分别免疫小鬣和猪绒用表达g d 的重缀疫菡病毒免疫小鼠，或用撬g d 抗体 被动免疫小鼠均能保护动物对抗p r v 致死性的攻击。从上述结果表明，g d 是保护性抗体的主 要强标抗骧。 g h 糖蛋白的基因位于p r v u l 区，大小为2 ，0 5 8 b p ，编码6 8 6 个氨基酸。g l l 糖蛋白为病毒复 制所必需的结构蛋自，对于病毒侵入靶缨胞或感染细胞与邻近细胞的融含，以及在小鼠神经系统 中的增殖均是必需的旧2 3 创1 。u p p 等4 3 1 研究发现g h 与g l 以复合物的形式存在，病毒缺失g h 2 猪伪狂犬病毒冀a 株g d 基困的克隆、表达及检测 的同时也会缺乏g l 。病毒缺失g h 不影响病毒与靶细胞的第一步粘合，但引起类似病毒缺乏g b 或g d 时的穿透减弱，病毒的感染性显著降低或失去感染性。病毒穿透鼻粘膜的第一级神经元、 局部扩散以及转染支配鼻粘膜的三义神经、交感神经、副交感神经都需有g h 的参与l 埘4 ”。 g l 对应于u l l ，紧邻i r 区段，其o r f 编码1 5 6 个氨基酸分子量为2 0 k d 。g l 对病毒的穿 入和在细胞间的传递是必需的。g l 与g h 一样，均为疱疹病毒共同的保守膜糖蛋白。伴随着g h 缺失g l 也缺失o ”。u p p 等【2 6 2 1 _ h j 插入和删除碱基的方法获得两株班缺失株，p i g l 也是病毒 复制的必需成分，p r v g l 在病毒侵入靶细胞时起重要作用。 g k 是最近才被鉴定的一种糖蛋白，对应于u l 5 3 ，对其功能的研究还较少，目前仅知道g k 是病毒必需的结构成分，g k 对抑制刚刚释放的病毒粒予再次融合细胞起重要作用，而对病毒的 吸附、导入等无明确作用p 。 ( 2 ) 非必需糖蛋白 g c 基因位于p r v 基因组的u l 区。k 为1 4 3 7 b p 。g c 是病毒的一种主要糖蛋白但并不是病 毒感染所必需的，通过与细胞表面的肝素样受体相互作用，在p r v 对靶细胞的攻击中起重要作 用，能诱导细胞免疫，且为病毒的主要中和抗原之一它的主要功能是介导病毒吸附到宿主细胞 上，影响病毒在传播中的释放，与病毒感染的第一步有关。此外，g c 也影响病毒的毒性，g c 还 能与猪的c ，结合，激活补体系统，从而在防御系统中起作用；g c 还具有血凝活性，能凝集小鼠 红细胞。所以，g c 虽然不是病毒体外生k 的必需成分，但在病毒分子生物学上占有非常重要的 地位。 g e 基因位于p r v 基因组的u s 区，长约1 7 k b 。g e 与g i 是以异源二聚体的非共价键形式存 在p ”j ，其结台位点在g e 的胞外区域，这种异源二聚体是病毒的功能单位，二者却无共同的抗 原决定簇。在加入抗体后不久，g e 糖蛋白被动的聚集成簇，这个簇逐渐变大，就会移向细胞的 一侧，在细胞膜表面形成“帽子”结构，使受体细胞区酪氨酸残基发生磷酸化，从而产生一系列的 信号传导，产生生理效应口。g e 糖蛋白对病毒的繁殖起到重要作用口”，g e 是一种促进细胞融合 的糖蛋白，能促进感染细胞与临近非感染细胞的融合，介导病毒从细胞到细胞之间的扩散。同时 g e 糖蛋白还能影响p r v 在猪体内的组织趋向性，从而有助于p r v 向中枢神经系统扩散m 甄3 6 3 ”。 g i 是病毒的非结构蛋白在感染的细胞中常与g e 以功能性非共价复合物的形式存在并发挥 功能，以近乎相同的方式影响病毒的生物学特性，但他们无共同的抗原决定簇。 g g 糖蛋白基因位于p r v 基因组的u s 区，长为1 4 9 4 b p 。g g 不在病毒粒子上，而由感染病 毒的细胞分泌。g g 对于病毒的吸附、穿透以及从细胞到细胞的扩散均是非必需的眦”】。 g m 与g n 是以异源二聚体的形式存在，是最近才被发现的两种非必需微量糖蛋白，在疱疹 病毒中较保守”。g m 对应于u l l 0 ，而g n 对应于u l 4 9 5 。g m 在病毒感染初期有一定调理作用。 g n 与病毒穿入有关。 1 2 3 病毒自身所编码的酶 ( 1 ) 胸苷激酶( t k ) 胸苷激酶( 1 1 1 y m i d i n ek m e ，t k ) 基因是疱疹病毒中的一个主要毒力基因，凡是p r v 的野毒 株都表达t k 。t k 是p r 、，体外复制的非必需蛋白，然而，t k 在感染动物的病理生物学上起重要 河北农业大学硕士学位( 毕业) 仑文 作用。n ( 是决定p r v 毒力的最重要的因子，其它因子对p r v 的影响都不象t k 那样照著。这是 由于p r v 掰产生的病毒特异性t k 对p r v 在神经组织细庭中的增殖、复巷4 班及保持欧期潜伏感 染和潜伏感染状态病毒的复活具有关键性的作用。t k 的缺失引起p r v 毒力丧失或大大降低，在 神经组织中盼复翻能力大大减弱。瑁t k w 瘪疹瘸毒免疫小鼠和躲鼠可班抵抗l 一l o o o 倍致死剂 量的亲本病毒( t k + ) 的攻击。因此t k 疱疹病毒的突变株可以成为新一代病舔基因 ：程疫苗。 ( 2 ) 蛋鑫l 激酶 p 粉和蛋精丝氨酸一苏氨酸激酶s ，丁激酶) p k 基因的开艘阅读框( o r f ) 长为1 1 7 0 b p ，编码3 9 0 个氨基酸，分子量大小为5 3 k d 和4 8 l ( d ”“。 p k 基因豹缺失疫苗株能明显影响p r v 的毒力，并认为p k 可能是透过增强瘸毒的复制耱力来提 高毒力p k 蛋白不是中和抗体和细胞毒性i 细胞的靶蛋南，但对诱导机体产生对p r v 的完全保护 是必需的，单独缺失p k 蛋自郾导致机体不能产生对p l i ：v 的完全保护这两种激酶单个失活。p r v 毒力改变较小，但编码该两种蛋岛激酶的基因均失活的双突变株，则导致p r v 毒力大大降低。 动物实验结果表明，这些激酶是影响病搬毒力的决定性蛋白p “。 ( 3 ) 脱氧屎苷三磷酸激酶( d u t p a s e ) 。 脱氧尿营三磷酸激酶( d u t p a s e ) 由p r w l 5 0 基因编码；它参与核萤酸的合成，将d u t p 脱磷酸成为d u m p ，然后d u m p 经甲基化，磷酸化生成d r r r p 两参与p r v d n a 的合成。该编码 基因插入失活后，对仔猪接种实验结果表明p r v 的毒力大大降低。 ( 4 ) 核替酸还原酶 核苷酸还原酶( m i o n u c l e 0 6 d cr e d u c t a 8 e ，r r ) 由两个亚单位构成，分别由u l 3 9 和u “o 基 因编码。宦铯将核糖核苷二磷酸还原成脱氧核糖核苷二磷酸，它是脱氧核糖核蜚的从头台成途径 的个必需酶。核苷酸还琢酶( r r ) 对病毒在分裂细胞上的生长是非必需的，但对在静i t 细胞( 如神 经元和外周血单核细胞) 上产生感染性病毒粒子则是必需的。缺失r r 、t k 的病毒突变株不能引 起猪严重的临床瘫状，r r 突变株在鼻、咽组织的繁殖比t k 突变株会受到更严重的阻碍。这表 明：对有效豹病毒d n a 合成，瘸毒的r r 活性比t k 活性更重要。 ( 5 ) 碱性核酸酶f a l l c a l i n en u c l e 舔e ，a n ) a n 由p r w l l 2 基骝编码，它是一个磷酸他的早期蛋白，病毒增殖的非必需蛋囊，但却是 病毒有效增殖所必需的d 1 j ”。由4 9 2 个氨基酸构成，它虽是a n 缺失会严重地影响病毒在培养细 聪上静生长，并鼹导致瘸毒对接种小鼠的毒力大大降低i 5 q 。 1 2 4p r v 的溶缨赡性复制 ( 1 ) 吸附和穿入 首先是游离的病毒子吸附到靶细胞上，然后是病毒囊膜和细胞质膜的融合。在这两个过程中 最关键豹是瘸毒囊膜耱蛋自和俸为病毒受体的细胞表露残分豹相互作用。已经报道的与p r v 吸 附有关的是g c 和g d 两种糖蛋自和两个细胞受体家族( 硫酸乙酰肝素糖蛋白和脊髓灰质炎受体相 关豢自) 9 目。p r v 和靶细魏瓣最初接触楚通过病毒g c 和缨臆表磊受体蛋是的相噩t # 用。这种最襁 不稳定的作用转变为g d 与其细胞受体的相互作用而介导的稳定结合。实验表明还存在着其它未 知的p r v 受体蛋自。病毒粒子必矮在瘸毒囊膜和缨脆矮膜紧密接触融合羼才能穿入。融合过程 至少需要4 种糖蛋白：g b 、g h 、g l 和g d 才能发生。g b 、g h 和g l 这些病毒蛋白的基因在整个 4 猪伪狂犬病毒冀a 株g d 基凼的克隆、表达及检测 疱疹病毒科中都是保守的。 ( 2 ) 核内过程 进入核内的线性d 1 q a 的环化和转录均在核内进行转录与翻译是按级联方式进行的。首先 编码调节蛋白的立即早期基因开始表达。与人多数病毒不同，p r v 只有一个立即早期表达的基因 ( 编码i e l 8 0 蛋白) ，与h s v 1 的主要立即早期基因i c p 4 具有同源性。i e l 8 0 是早期基因有效的反 式作用因子。早期基因在d n a 复制之前就被表达，编码包括d n a 复制和其它酶活性所必需的蛋 白质，其中最重要的有胸苷激酶、d u t p e 和核糖核菅酸还原酶。其中胸苷激酶对病毒在组织培 养上的生长是非必需但对病毒的神经毒力是必需的。疱疹病毒的d n a 复制是通过滚环方式进行 的，形成头尾相接的连环体d n a 分子，这些d n a 分子在装配进衣壳的同时或之前被裂解成特定 长度的基因组。大部分的核内病毒d n a 存在于高分子量的连环体结构之中。晚期基因编码几种 农壳和囊膜成分如g c 。然而必须强调指出，疱疹病毒转录和翻译方式分成这三个动力学阶段并 不是绝对的【4 “。如许多早一晚期基因表达在病毒d n a 复制之前就己开始了，但只有在d n a 复 制开始后才达到其最高表达水平。 ( 3 ) 病毒的出芽 合成的衣壳以出芽方式穿过核内膜而离开细胞核。这种最初的病毒囊膜缺少成熟的糖蛋白。 病毒通过这最初的囊膜与外核膜的融合而离开核周隙，将裸农壳释放到胞浆。第二层囊膜是在高 尔基体的跨膜区形成的，出现带有病毒糖蛋白组成的纤突。p r 儿3 5 基因产物对第二层囊膜的 形成是必需的。出芽的最终结果是在囊泡中形成完整的病毒粒子。这些包裹了病毒粒子的囊泡随 后移至胞浆膜进而与细胞膜融合，然后将病毒粒子释放到细胞外。 1 2 5p r v 的疫苗研究进展 疫苗免疫接种是预防和控制乃至消灭伪狂犬病的根本措施。尽管接种疫苗不是总能确保猪不 发生感染。但它在减少感染的机会、阻止临床症状的发生、减轻感染后的症状、减小经济损失等 方面起着重要的作用。更为重要的是免疫接种猪即使发生感染，它散毒的量也大大减少，从而减 少病毒的传播，因此它在根除伪狂犬病的计划中起着重要的作用。 ( 1 ) 弱毒疫苗 弱毒疫苗株都是通过非猪源细胞的反复传代，或鸡胚接种传代，或在某些致突变剂的存在下， 在高于通常的培养温度下在细胞培养物上反复继代获得。目前使用较多的是b a m l a 株和b l l l ( 株， 除了以上应用较为广泛的两个弱毒疫苗株外，还有m k - 2 5 ，m k - 3 5 ，n i a 4 ，a l f o r t 2 6 等弱毒株。 ( 2 ) 灭活疫苗 上述的弱毒生产的疫苗在一些国家己不使用，因为它存在毒力返强的危险性，同时接种这些 疫苗的猪存在散毒问题。在新一代基因缺失疫苗出现以前，将强毒株在b h k 2 l 、m r s 等细胞培 养，制成灭活疫苗克服了弱毒疫苗的不足。 ( 3 ) 基因工程缺失疫苗 p r v 基因工程缺失疫苗是利用基因工程技术在p r v 基因组中插入或缺失一段序列致使p r v 的某些基因不能表达，从而致弱p r v ，同时又保持其较强的免疫原性，而其中缺失的主要是其毒 力基l 司胸苷激酶( t k ) ，蛋白激酶p k ) ，核苷还原酶( r r ) 和脱氧尿苷三磷酸激酶( d u t p e ) 以及一些 5 河j e 农业大学硕士学位( 毕业) 论文 具有免疫原性的糖蛋白g g 、g e 、g c 和g d 等。目前据此己构建了多种单基因、双基因及多基因 缺失疫苗。 t k 基因缺失疫苗是最早构建的基因缺失疫苗，在国内，华中农业大学陈焕春等构建了p r ve a 株t k 基因缺失株，四川农业大学郭万柱等构建了p r v 闽a 株t k 基因缺失株c i o e l 等。t k 基因缺失疫苗能较好地免疫猪只，但是由于t k 基因属于酶蛋白基因，在体内不能产生其相应的 抗体，鉴于此许多学者在t k 基因缺失的基础上又缺失了相应的糖蛋白基因而构建了含t k 基 因缺失的双缺失和多缺失疫苗株。1 9 8 7 年，i ( i t 等构建了p r v t k 7 9 c 双基因缺失疫苗株”。1 9 9 4 年，m e t t e n l e i t e r 等构建了含g g 、g d 、豳、g i 缺失的4 基因缺失疫苗株”1 。在国内华中农业大 学陈焕春等在p r v e a t k _ 株基础上构建了p r v e 棚( g g - ，1 k _ g e - 疫苗株，四川农业大学郭万柱 等构建了p r v 闽a t k - g c 。，tk - 蚀一，t k _ ，g g 。株等。这其中应用较多的有n ( _ ，g c 一、t k _ g d 。、t k _ 幢e 、 t k - g g 等双缺失疫苗株和t k _ g e g g 三缺失疫苗株。国外应用较多的基因缺失疫苗还有 n i a - 3 7 8 3 和b e g o n i a 株等。 除以上以t k 基因缺失为主的疫苗外，现在还有以r r 、p k 、d l r r p a s e 等缺失为主的疫苗和 突变株出现。r r 、p k 、d u t p a s e 等与t k 一样都是p r v 毒力的决定因素。研究结果表明看出 缺失t k 基因的疫苗的安全性及免疫效果优于某些国外同类产品，尤其是1 k g g 双基因缺失株 还为通过血清学方法鉴别诊断疫苗免疫猪和野毒感染猪提供了可靠的手段，因此，在我国目前应 用华中农业大学构建的t k 7 9 g 。疫苗株免疫接种猪以预防控制伪狂犬病不失为一种理想的选择。 但是，基因缺失疫苗还存在着可与不同的基因缺失疫占或野毒间发生基因互补而重组产生强 毒株的危险性【4 9 】，此已得到研究证实。但总的来说，基因缺失疫苗较灭活苗、弱毒苗在安全性、 免疫原性等方面都有很大的提高，是当前防治伪狂犬病晟为安全、实用的疫苗，只是为了得到更 安全的基因工程疫苗，还有待于对p r v 的分子生物学的更深一步的研究。 ( 4 ) 重组疫苗 以腺病毒为载体的重组p r v 疫苗腺病毒作载体具有成本低、宿主细胞种类广4 泛、能诱导粘 膜免疫等优点。e 1 0 “等1 9 9 0 年将p r vg d 基因克隆到5 型腺病毒中构建重组腺病毒，免疫小鼠 和兔后能够诱导产生抗g d 抗体，并能使动物抵抗强毒的攻击。r e d d y 等1 9 9 9 年将p 1 wg d 基因 克隆到猪腺病毒3 型的e 3 区域构建了重组腺病毒。另外，h a n l n l o n d 等构建了表达p r vg d 基因 的重组猪腺病毒。 以痘苗病毒为载体的重组p r v 疫苗痘病毒作载体具有插入外源d n a 容量大、操作方法简便、 病毒较稳定等特点。m a r c h i 0 1 i 等1 9 8 7 年构建了表达p r 、，g d 的重组痘苗病毒，免疫小白鼠有 定的保护作用。剐“e r e 等1 9 9 2 年构建了表达g b ，g c ，g d ，g b g c ，g b 拒d ，g b 螂g d 几株重组痘苗病 毒。b r o c k m e i r 等1 9 9 3 年利用高度减毒的痘苗病毒n y 、( a c 株作载体构建了表达g b 、g c 的重组 痘苗病毒，免疫后可以保护猪抵抗强毒株的攻击。娄高明等【3 1 利用痘苗病毒天坛7 6 1 株构建了表 达g d 的3 株重组痘苗病毒v _ 5 0 a 、v 5 0 b 、v - 5 0 c ，用e l l i s a 能检测到特异性抗原表达。 以猪痘病毒为载体的重组p r v 疫苗猪痘病毒基因组容量大，可插入较大的外源基因。猪是 唯一的宿主，具有宿主特异性，接种后不散毒，安全。、铀d e ri c e k 等1 9 9 4 年将g d 、g i 置于痘苗 病毒p 7 5 启动子控制下插入猪痘病毒胸苷激酶( t k ) 基因中构建了重组猪痘病毒。i ( i t 等1 9 9 2 年利 用缺失t k 基因的牛传染性鼻气管炎病毒( b h v _ 1 ) 作载体表达p r v 糖蛋白g c 基因，表达产物可 用于g c e l l i s a 鉴别诊断试剂盒作包被抗原。o 惦u k a 等f 4 7 】利用缺失t k 基因的b h v - l 作载体表 6 猪伪狂犬病毒冀a 株g d 基围的亮隆、表达及检测 达g b 、g c 、g d 、g e 单个或多个联合基因构建了b h v - l 熏组疫苗。 ( 5 ) 伪狂犬瘸病毒距单位疫苗 亚单位疫苗是病毒的结构蛋白，不古有核酸物质，因此比较安全。在伪狂犬病辅毒中目前已 发现九种糖蛋白其中g b 、g c 、g d 均能使机体产生中和抗体，这些抗体在体卦无论篷有补体存在 还是光补体存在下均肖中和p r v 的能力， ! ；e 射抗g b 、g c 、g d 的单克隆抗体的猪能抵抗伪狂犬 病强毒的攻击。因此g b 、g c 、g d 是研制伪狂犬病病毒亚单位疫荫的首选耱蛋白。h 的s h il s h i i 等将亲和层柝纯化的g d 免疫小鼠，可保护小鼠幸免致死量的伪狂火病毒的攻击h ”。r o g e r 等用 非离子去污剂n p - 4 0 处理病毒粒子和感染细胞得到蛋白，然精将此鬣自配臣不完全弗氏佐荆制得 亚单位疫苗，将该疫苗免疫猪，猪能免受致死量伪狂犬病病毒的攻击。g c h r p p u i s 将灭活的病毒 悬液超滤、p e g 沉淀、超速离心，再经另一化学试荆处理后超速离心制得纯化的糖蛋白，配以适 当的经荆后免疫猪，猪均能抵抗致死量的p r v 的攻击。p e v s i ( i 等将p r vr i c e 株的g d 基因插 入到人的巨细胞病毒立即早期启动子下游构成一个表达质粒p d i e 5 0 p a ，将该质粒转染c h o d l l 仔 细胞，在氨甲喋吟的选择压力上得到的细胞( c h c g d ) 通过免疫沉淀检测结果表明，g d 获得表达 b 7 1 。 ( 6 ) 伪狂犬病病毒的基因疫攘 对传染性疾病的防治常用弱毒或灭活疫苗，然而以上痰苗普遍存在以一f 问题：( 1 ) 弱毒疫苗毒 力可能返强，导致疾疼流行：2 ) 来充分致弱的疫苗株及致弱过度豹疫苗栋不仅不能诱生足够的免 疫保护反应，反而可能引起疾病及免疫抑制现象：( 3 ) 灭活瘦随由于抗原成分含量不高及灭活过程 中主要抗原决定簇的丢失，少量接弹往往不糍诱生足够的免疫反应，因而常常需要多次重复接种； ( 4 ) 灭滤疫苗由于不能提供内源性蛋自抗原于免疫系统，因而不能诱生细胞毒t 细胞反应( c t l ) ， 两c r l 在保护性免疫反应巾霹能是至关重要盹。巍此，伪狂犬痛瘸毒豹慕因疫蓖的意义就更大 了。呵以通谶诱导表达目的蛋白来达到刺激机体产生特异性抗体的目的，用来预防猪伪狂犬病。 7 河北农业大学硕士学位( 毕监) 论文 2 1 材料 2 1 1 毒株与细胞 2 材料与方法 猪携猛犬病毒( p r v ) 冀a 抹由本实验室分离并保存；猪瞥抟代细藏系( p b l 5 ) 麴自中国 兽药靛察所。 2 1 2 细胞培养所需主要试剂 青霉索( 1 6 0 万单位) 链簿索( 1 0 0 万单位) m e m 特级新生牛血清 获酶( t f 撵$ i n ) 2 1 3d 提取所需主要试剂 三羟甲萋氨墓甲烷( s ) 盐酸 e d t a t r i t o n x 1 0 0 蛋白酶 氯仿 异戊醇 饱和酚 华j 制药集团 华j b 制药集团 g i b c o b r l 杭州四季青生物工程材料有限公司 b d hc 瓢锄i c a l s s i 蹦a 公司 天津市华东试剂厂 s i g m a 公司 a m f e s c o 大连宝生物有壤公司 上海生工 上海生工 北京鼎国生物技术发展中心 2 。4 聚合酶链式爱应( p c r ) 所需主要试翔 三氯甲烷 异戊醇 琼l 糖 t s 平衡酚 t a k a r at a q t m 、d n am