（水生生物学专业论文）微生物降解餐饮废弃油脂的研究.pdf

s tud y o n thef oodw as t eoilde g r ada tion d vm ic r ode z h a n gw ei s pe cialty ：n yd r o bi0l0g y c ol1ege ：c o1 1egeo flifescien ce s u p e r v is o r ：p r o f e s s o rm ag u a n g z h i sub mittedd a te ： m a y28 ，2010 l t l ll l ii i it i 1 iti i iiiti 17 6 8 4 0 5 摘要 微生物处理餐饮废弃油脂的研究 专业：水生生物学 姓名：张苇 导师：马广智教授 本研究从餐厅下水道采集水样和垃圾场土壤中采集土样， 建立有效的初筛和复筛体系，经过大量的菌种筛选，分离得到 l8 株降解油脂能力较高的菌株，等量混合制成混合菌液，其油 脂降解效果明显优于单一菌株。 利用单因素实验，研究了在不同的p h 值、表面活性剂、 温度、摇床转速及初始油脂浓度条件下，已筛选出的菌株对油 脂的降解率。实验结果表明，最佳培养条件是p h 值8 0 、 t w e e n 80 的浓度 8 0 0 m g l 、温度为30 35 、摇床转速为 l8 0 20 0 r m i n 、初始含油量 20 0 0 m g l 以上，油脂浓度 对微生物的活性产生抑制作用，生化反应为基质控制步骤，反应速率随水中油 脂浓度的增高而降低。当油含量e o i l 在o 20 0 0 m g l 范围内，油脂降解过程 是一级反应。但降解速率常数随初始油含量的增大而逐渐减小。 徐保成等( 2 0 0 6 ) 从油脂加工厂污水道和餐饮业下水道污水中驯化分离筛选 出三株实验菌株，经鉴定为分别门多萨假单胞菌( x 1 ) 、假产碱假单胞菌( c 2 ) 和 洋葱伯克霍尔德菌( l x ) 。通过对三株油脂降解菌的比较，挑选出一株有较强油脂 降解能力的洋葱伯克霍尔德氏菌( b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ) ，对其降解工艺条件进行 优化研究。结果表明，在优化的油脂降解条件下( p h 值7 0 ，3 0 。c ，溶解氧3 0 m g l ) ， 处理初始油脂浓度为1 0 0 0 m g l 废水，2 4 h 后其油脂降解率达到9 0 以上，c o d 去 除达到9 2 。研究发现，洋葱伯克霍尔德菌能在降解利用油脂的同时还分泌出 一定量的胞外脂肪酶，同时通过所产生的脂肪酶等降解酶系作用于油脂，将其分 解氧化为低级脂肪酸、甘油、醇类等低分子有机物，最后降解为h 2 0 ，c 0 2 等代谢 产物。 秦华明等( 2 0 0 7 ) 也从长期受油污染的土壤中分离筛选得到能高效降解油脂 b u r k h o l d e r i ac e p a c i ax 4 菌株。该菌株降解油脂的最适温度和p h 分别为3 0 和 7 0 ，菌株降解油脂时适宜的氮源为硫酸铵，适宜碳氮比为4 ：l 。共基质碳源的添 加有利于生物量的迅速增加和油脂降解率的提高，添加适量的葡萄糖能使油脂 降解率提高8 1 0 。5 0m g lc a 2 + 对菌株生长和油脂降解更有利。在橄榄油浓 度高达2 0 9 l 条件下最大油脂降解率仍可达8 3 。在油脂浓度25 0 0 m g l 时， 该菌对油脂的降解符合抑制动力学m o n o d 方程。 张万祥等( 2 0 0 7 ) 从含油脂废水中取样，通过分离、培养，筛选出以油脂为 唯一碳源和能源并能分解油脂的菌株，对其基因组1 6 sd n a 测序，在核酸数据 8 第l 章绪论 库中进行b l a s t 比对，并进行生化反应，鉴定为栗褐芽胞杆菌，为下一步实 验证实其分解油脂的作用和机制奠定了基础。 1 2 4 2 具有降解废油脂能力的真菌 毛霉中有些种类在转化外源性脂肪酸时能在细胞中积累y - 亚麻酸( 汪云岗 等，1 9 9 9 ) 。利用毛霉既能去除废水中的油脂，又能从废水处理的菌体中提取具 生物学活性的类脂，这是综合解决油脂废水污染的一种好技术。李垄宝等( 2 0 0 2 ) 用四种霉菌m c i r c i n e l l o i d e s ，m r a c e m o s u s , r h o r y z a e ，r h m i c r o s p o r u s 以油脂废水 为基质培养，实验结果表明所用毛霉的4 个菌种都能不同程度地降解油脂。其 中m r a c e m o s u s 经5 d 培养，油脂的去除率最高，达9 2 ，菌体内y 亚麻酸含 量为1 3 5 m g g ，以不同浓度油脂废水研究毛霉m r a c e m o s u s 对油脂的降解和 菌体生长情况表明，在5 9 l 油脂浓度下，经3 d 培养，该茵体生物量达最大值 3 6 9 l ，此时油脂去除率达9 2 。在2 0 9 l 油脂浓度下，经7 d 培养，达最 大生物量1 6 9 l ，对油脂的去除率为9 0 。当到达最大生物量时，菌体类脂和 y 一亚麻酸含量在5 9 l 、2 0 9 l 油脂废水中分别为o 8 9 l ( 1 7 7 m g l ) 、8 8 9 l ( 1 6 8 m g g ) 。 吴兰等( 2 0 0 3 ) 研究发现解脂耶氏酵母( y a r r o w i at i p o t y t i c a ) 对色拉油废水 具有降解能力，应用正交实验筛选最佳实验条件，再按正交实验结果进行单因 素实验研究各因素分别对降解作用的影响，研究结果表明该菌在p h 6 7 、温度 为2 5 3 0 、摇床转速2 0 0r m i n 、废水中油脂起始浓度20 0 0m g m 的条件下， 对废水中的色拉油具有较高的降解率，最高可达9 5 5 9 。 胡玉洁等( 2 0 0 4 ) 从城市污水处理厂的活性污泥中分离筛选的优良油脂分 解菌假丝酵母，命名为w z f f g 2 8 4 ，对于高含油废水具有很强的适应能 力。在以高浓度食用色拉油作为唯一碳源、添加适当无机盐的废水处理体系中， 该菌株的细胞代谢速度快生长繁殖旺盛；除菌体细胞本身显示出明显的乳化 能力之外，还可通过产生大量的生物表面活性物质提高乳化力，将大量的高浓 度油脂迅速乳化，形成均质的完全乳化状态，显示了高强乳化作用效果，促进 了油脂的快速分解。同时该菌株生产、分泌出高活性脂肪酶，可以将油脂快速 分解、转化。 微生物是一类现实和潜在用途都很大的生物资源，人类对微生物的利用经历 过天然混合培养到纯种培养两个阶段，分离纯培养技术的发明和应用是微生物学 9 华南师范大学硕士学位论文 发展的一个巨大进步。但是，在长期的实验和生产实践中，人们也不断地发现很多 生物过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行，必须依靠两种或两种以上的 微生物共同培养完成。( 冯树等，1 9 9 0 ) 随着纯培养技术的完善和对微生物间互生 和共生现象的研究，人为的，自觉的微生物混合培养( m i x e dc u l t u r e ) 或混合发酵 ( m i x e df e r m e n t a t i o n ) 已渐为人们所重视。对混合菌资源的研究，不仅具有深远的 理论意义，更具有重大的应用价值。 混合微生物培养法是处理废水的最有效、最具前途的方法，因为废水大都含 有多种复杂成分，利用混合菌培养不仅可以同时消除几种污染物，而且对某些污 染化合物来说，单一菌种不能降解而需混合菌的协同作用。这方面的研究已取得 一些成果。 李伟光等( 2 0 0 3 ) 从哈尔滨炼油厂含油废水处理站曝气池的活性污泥中筛 选出3 9 株除油工程菌，通过研究p h 、温度、溶解氧( d o ) 、培养时间、油浓度以 及营养盐等环境因素对单株菌、双株菌、多株菌和全混合菌除油效果的影响，确 定出最佳运行条件。试验结果表明，在营养充分，p h 为7 o ，温度为3 0 。c ，油浓度低 于1 0 0m e gl 的条件下，各组菌除油效率均达到各自的最高值，但全混合菌除油的 效果明显优于其它各组菌，其微生物的共代谢作用对含油废水的降解更为充分和 彻底。 混合菌的耐受力最强，各菌株的共代谢作用提高了混合菌对环境的适应力。 通过调节混合茵比例、p h 、温度及溶氧量等因素，可使混合菌达较适的生态状态， 发挥较高的生产效能。虽然混合菌在很多领域中的作用己得到充分肯定，部分成 果已成功应用于实效的理论指导，而且对于已经应用的混合菌体系也不能有效地 协调菌问的关系，使其达最佳生态状态，发挥最大效应。这严重地阻碍了混合菌培 养的发展和应用。在现有的基础上对混合菌菌间关系和协同作用机制从生理、 代谢和遗传角度进行深入研究，对混合菌资源的理论和应用都将有巨大突破。 随着混合菌资源在各方面应用研究的深入，人们不再满足于传统的反应模式， 已开始引入一些新兴的生物工程技术，使该领域的研究更有活力。采用固定化细 胞技术固定混合菌可使反应系统多次使用，降低成本，增加效率，在实际应用中很 有意义。利用细胞融合技术和基因一【程技术由具有互生或共，上关系的微生物研 制工程菌，使工程菌具有混合菌培养的功能并拥有纯培养菌营养要求单一、生理 代谢稳定易于调控等优j ? i ，是极有前途的研究方向。 目前，生物法在处理油脂废水中只是作为：二级或三级处理工艺。但从长远、 1 0 第1 章绪论 根本意义来看，应采用生物法进行彻底治理。可以说生物法是解决环境污染问 题的一种最有效、最安全和最合理的方法。因为只有微生物才是地球生态系统 最重要的分解者，也是开发潜力最大、人类最宝贵的资源库。 1 3 研究方案和内容 本课题提出餐厨垃圾废弃油脂处理产业化新模式，即把废弃油脂用物理方 法部分去除后的餐厨垃圾加工成干粉运到农村，利用油脂降解菌分解干粉中剩 余的废弃油脂，制成用于蚯蚓养殖的饲料，再集中收购蚯蚓，工厂化生产蚓激 酶和高蛋白饲料等形成产业链，资源得到循环利用。 本试验分析餐厨垃圾粗脂肪含量，筛选高效油脂降解菌，优化油脂降解条 件，运用油脂降解菌降解餐饮垃圾干粉中废弃油脂，使餐饮垃圾干粉成为蚯蚓 养殖培养基，并且使餐厨垃圾得到无害化和资源化的处理。 技术路线 理化条 件优化 第二章油脂降解菌的筛选 2 1 材料和方法 2 1 1 实验材料 2 1 1 1 主要仪器： 第二章油脂降解菌的筛选 名 称 型 号生产厂家 生化培养箱上海智城分析仪器制造有限公司 高压蒸汽灭菌锅t h a 3 5 6 0 ca u t o c l a v e 超净工作台s w 二c j 1c u苏州安泰空气技术有限公司 台式恒温摇床t h 2 d 台式低速离心机l 5 5 0 长沙湘仪离心机仪器有限公司 分析天平a c c u l a ba l c 赛多利斯科学仪器有限公司 通风柜m t f g a 深圳美加丽实验装备有限公司 电热鼓风干燥箱 1 0 1 a 2 上海荣丰科学仪器有限公司 光学显微镜 z 1 0 0 e c l i p s e 电热恒温水浴锅 s h s 4 黄石市恒丰医疗器械有限公司 定时加热磁力搅拌器 j b 一2 金坛市荣华仪器制造有限公司 电炉 e s 0 3 2 分光光度计 4 0 0 0 u 移液枪 e p p e n d o r f 2 1 1 2 主要药品试剂： 药品名称生产厂家 蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂 葡萄糖上海伯奥，1 i 物科技有限公司 蔗糖j 州化学试剂厂 1 3 华南师范大学硕士学位论文 牛肉浸膏北京双旋微生物培养基制品厂 酵母粉北京鼎国生物技术有限责任公司 琼脂广州威佳科技有限公司 花生油益海( 广州) 粮油有限公司 芝麻油 上海太太乐食品有限公司 猪油 市场购买，炼制 硫酸广州化学试剂厂 石油醚广州市云荟贸易有限公司 t w e e n 8 0 北京鼎国生物技术有限责任公司 硫酸铵广州化学试剂厂 氯化钠天津广成化学试剂有限公司 磷酸氢二钾广州化学试剂厂 碳酸钙广州化学试剂厂 柱层层析硅胶青岛海洋化工厂 氧化铝( 层析)上海五四化学试剂有限公司 甘油广州威佳科技有限公司 2 1 1 3 实验样品来源： 取华南师范大学南门垃圾场土样和学生第一食堂下水道水样，4 保存。 2 1 1 4 主要培养基： 细菌基础培养基( g l ) ：牛肉膏一蛋白胨培养基。牛肉膏3 0 ，蛋白胨1 0 0 ， n a c i5 0 ，p h 7 2 7 4 。 霉菌基础培养基( g l ) ：马铃薯一蔗糖培养基。马铃薯2 0 0 0 ，蔗糖2 0 0 ， p h 6 0 - 7 0 。 酵母菌基础培养基( g l ) ：酵母粉蛋白胨葡萄糖( y p d ) 培养基。酵母粉5 o ， 蛋白胨1 0 0 ，葡萄糖2 0 0 ，琼脂2 0 0 ，p h 4 0 5 0 。 富集驯化培养基( g l ) ：酵母膏1 0 ，( n i - 1 4 ) 2 s 0 45 0 ，k 2 f i p 0 42 0 ，n a i l 2 p 0 4 2 o ，花生油2 0 0 ，p h 7 0 一 驯化培养基( g l ) ：( n i - h ) 2 s 0 45 0 ，k e h p 0 42 0 ，n a h 2 p 0 42 0 ，n a c i2 0 ，花 生油2 0 0 ，p h 7 0 。 1 4 第二章油脂降解菌的筛选 初筛培养基( g l ) ：蛋白胨1 0 0 ，n a c i5 0 ，c a c i 7 h 2 00 1 ，琼脂9 0 ，p h 7 4 ， 1 2 1 灭菌3 0 m i n ，冷却至4 0 5 0 ，加入1 2 1 单独灭菌2 0 m i n 的t w e e n 8 0 至 终浓度为l ，制成平板。 复筛培养基( g l ) ：花生油0 5 ，( n h 4 ) 2 s 0 45 0 ，k 2 h p 0 42 0 ，n a i l 2 p 0 42 0 ， n a c i2 0 ，p h 7 o 。 细菌保藏培养基：基础培养基+ 2 0 0 9 l 琼脂，分装入试管灭菌，制成斜面。 霉菌保藏培养基：马铃薯蔗糖培养基+ 2 0 0 9 l 琼脂( p d a ) ，分装入试管灭 菌，制成斜面。 酵母保藏培养基：酵母粉蛋白胨葡萄糖( y p d ) 培养基+ 2 0 0 9 l 琼脂，分装 入试管灭菌，制成斜面。 本研究中，培养基除特别注明外，均采用1 2 1 蒸汽灭菌3 0 m i n 。 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 菌种分离筛选方法 驯化：用5 0 0 m l 无菌广口瓶采样，将样品置于4 冰箱中保存备用，富集 培养前取一定量的样品，注入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中震荡l h ，打碎菌胶团， 释放游离菌。将垃圾场土样制成菌液，分别取菌液和下水道水样各5 m l 加入到 液体驯化培养基中，3 2 、1 8 0 r m i n 恒温振荡培养。每天观察。每7 d 转接1 0 m l 培养物至3 0m l 新的培养基中。此驯化过程持续2 个月。 初筛：取驯化培养菌液l m l 点种到初筛培养基平板上，3 2 恒温培养4 8 h ， 测量菌落周围水解圈的直径，以此判断待测菌株对油脂的分解能力。 复筛：采用摇瓶降解实验进行复筛。将初筛入选的菌株接种到复筛摇瓶培 养基中( 花生油为唯一碳源) ，置于摇床中，1 8 0r m i n ，3 2 。c 培养4 8h 后测定含 油量的变化，以待测菌株对油脂的分解率作为入选菌株的判断依据。 2 1 2 2 菌种分离纯化 菌种分离：将复筛入选的菌株分别接入细菌、酵母和霉菌液体基础培养基 振荡培养。整个液体培养置于3 2 。c ，1 8 0 r m i n 的恒温摇床上进行。2 3 d 后接种 至对应的固体培养基中进行涂布平板分离与平板划线法分离。将纯化后的菌落 接种至斜面保藏培养基上保存。 华南师范人学硕士学位论文 细胞及菌落形态观察：将活化后的菌株接种于固体及液体培养基，3 0 培 养7 2 h ，观察液体培养基中有无沉淀、菌岛、菌环、菌醭以及固体平板上菌落 的形态特征：大小、形状、表面( 光滑、粗糙等) 、隆起( 凸、凹、平) 、边缘( 锯齿 状、波浪状、纤维状) 、硬度、透明度等。大小的测定：取培养2 4 h 的斜面培养物， 涂片，染色，在显微镜下用校正好的目镜测微尺测出菌体的长和宽，并求其平 均值。 2 1 2 3 菌种保存方法 ( 1 ) 低温保藏：取相同规格的试管，每支试管中均盛入1 0 m l 相应的基础培 养基，塞紧棉塞后，1 2 1 高温灭菌2 0 m i n 后制斜面培养基，待培养基冷却后， 无菌操作台内，接种环挑起适量的菌株接入斜面培养基上，每种菌接3 支管， 3 2 恒温培养3 6 h ，选取发育较好的试管菌种放入4 。c 左右的冰箱中保存，每月 传代一次。 ( 2 ) 超低温保藏：菌株接入液体培养基中，3 2 。c 培养3 6 h ，离心后加入无菌 新鲜培养基和甘油，甘油浓度为1 0 2 0 ，7 0 8 0 条件下超低温冷冻保藏。 2 124 种子培养 将一环菌苔( 3 2 。c 培养2 4 3 6 h 的斜面种子) 接种于装有5 0 m l 种子培养基的 三角瓶，3 2 、1 8 0 r m i n 条件下培养3 6 h ( 己注明的除外) 。 2 1 2 5 摇瓶培养 2 5 0 m l 三角瓶中装培养基5 0 m l ，以6 接种量( b o u c h e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 接入 种子液，3 2 、1 8 0 r m i n 条件下培养。 2 1 2 6 花生油标准曲线 1 石油醚的纯化：于色层分析柱( 5 0 x6 0 0 m m ) 中塞一团干脱脂棉花于活 塞上部，加入8 0 1 0 0 目硅胶至高度4 5 c m ，再加入5 c m 厚、经1 6 0 。c 活化4 h 的层 析用中性氧化铝。使石油醚通过制备的吸附柱，集取柱滤液。 2 花生油最大吸收峰值的测定：准确称取2 9 花生油溶于石油醚中，定容 5 0 m l ，分取适量注入石英比色皿中，测定在2 1 0 2 5 0 n m 范围内的吸光度。发现在 波长2 1 2 n m 处有最大吸收值。 1 6 第二章油脂降解菌的筛选 3 花生油标准曲线：取7 9 个5 0 m l 的容量瓶，以花生油为溶质，以石油醚为溶 剂。准确地配制浓度依次为o 0 、4 0 、8 0 、1 2 0 、1 6 0 、2 0 0 、2 4 0 、 2 8 0 、3 2 0 、3 6 0 m g l 的系列样品。用紫外分光光度计，在在2 1 2 n m 入射波长 处，用l c m 石英比色皿，以石油醚为空白，依次测定上述系列样品的吸光度。重复七 次，取其平均值。以油浓度为横坐标，以0 d 2 1 2 为纵坐标，作出标准曲线。在后面 的实验中，利用标准曲线可以通过测定o d 2 1 2 光吸收值来计算样品中含油量。 2 1 2 7 油脂含量的测定 采用紫外分光光度法( 沈叔平，汪小梅，1 9 9 4 ) 。具体步骤如下： 1 萃取：取不同时间段的液体培养样品，加5 0 硫酸铵溶液去除蛋白质后 用40 0 0r m i n 速度离心1 0 m i n ，上清液移入分液漏斗中，加1 + 1 硫酸5 m l 酸化。 用1 0 m l 石油醚清洗三角烧瓶后，移入分液漏斗，并充分振荡3 m i n ，静置使之 分层，将水层移入采样瓶中，将石油醚移入5 0 m l 离心管里，再将水层移回分液 漏斗内，用1 0 m l 石油醚重复萃取一次，静置分层后将石油醚层移入离心管，与 第一次萃取液混合，将离心管定容至5 0 m l 。 2 测定：在波长2 1 2 n m 条件下中测定吸光度，利用标准曲线计算出油脂浓 度。 2 2 结果与讨论 2 2 1 菌种筛选结果 2 211 初筛结果 富集及驯化培养的主要目的是使目标菌株能够适应其生长环境并旺盛生 长，其它的微生物呈现弱生长或不生长，本实验将采集的样品置于含油培养基 中，使不适于含油培养基的菌株被淘汰掉，而能适应的菌株被保留下来。通过 富集培养和驯化培养，使适合含油培养基的微生物大量扩增。本研究是从学校 餐厅下水道口南门垃圾场采集6 个样品，经富集、好氧驯化培养后的培养液稀 释分离得到的菌株6 3 株，首先在初筛培养基平板上进行油脂分解试验，根据产 生晕圈的大小作为初筛的依据，部分菌株的初筛结果见表2 1 。根据初筛的结果， 排除生长不很旺盛的，共筛出有较强分解能力的菌株18 株。 1 7 华南师范大学硕士学位论文 表2 1 油脂分解菌的初筛结果 t a b l e 2 1t h ef i r s tr e s u l to f s c r e e n i n gg r e a s e d e c o m p o s i n gs t r a i n s 水解圈直径( m m ) 编号重复l重复2重复3 平均值( m m ) m 11 7 o 1 7 2 1 6 91 7 0 m 51 7 91 7 51 8 41 7 9 m 71 6 71 7 31 7 21 7 1 m 81 5 91 6 11 6 31 6 1 m 1 21 6 91 6 31 7 11 6 8 m 1 41 7 11 5 51 6 31 6 3 m 2 61 9 21 8 71 9 41 9 1 m 2 81 6 8 1 7 51 7 4 1 7 2 m 3 l1 7 0 1 6 51 7 11 6 9 m 3 41 5 71 6 21 6 01 5 9 m 3 51 6 31 7 11 6 91 6 7 m 4 21 7 11 7 41 7 21 7 2 m 4 71 7 21 7 01 7 41 7 2 m 4 91 6 51 7 21 6 81 6 8 m 5 11 7 31 7 51 8 01 7 6 m 一5 417 0 1 7 21 6 5 1 6 9 m 5 91 6 9 1 6 51 7 4 1 6 9 m 6 21 7 31 7 41 6 91 7 2 2 212 复筛结果 根据配制不同浓度的花生油石油醚溶液，得到相应的吸光度，以花生油浓 度为横坐标，以吸光度为纵坐标，作花生油标准曲线。为准确反映样品浓度与 吸光度之间的关系，我们朋“最小二乘法对实验数据进行回归，这样可以得出一 条对各数据点的误差最小、最精确的工作曲线，从而使测定结果更接近真实值。 计算出回归方程的；：j 数b = 0 0 0 4 8 和常数项a = 0 0 0 0 9 建立了回归方程： y = a + b x = 0 0 0 4 8 x 0 0 0 0 9 ，作出了工作曲线见图2 1 第二章油脂降解菌的筛选 o 1 2 0 1 三0 0 8 n ；0 0 6 型 米0 0 4 螫 0 0 2 o o81 21 62 0 油浓度( 鸭l ) 图2 1 花生油标准曲线 f i g 2 - 1s t a n d a r dc u r v eo fp e a n u to i l 本研究主要通过测量菌液中剩余油脂的含量来衡量该菌降解油脂的效果。 将培养液离心后用石油醚将其中的油脂萃取出来，稀释到一定浓度后在2 1 2n n l 波长下采用紫外分光光度法测量样品的吸光值。然后由标准曲线求得油脂含量。 通过初筛共得到1 8 株产脂肪酶能力高的油脂降解菌，将这1 8 株菌等量制 成混合菌液编号m 以及18 种单菌分别接种于复筛培养液于3 2 ，18 0r m i n 的 摇床上培养7 2 h ，采用萃取法将剩余油脂从培养液中萃取出来后在波长2 1 2a m 处测量其吸光度，利用标准曲线计算出油脂浓度。根据发酵前后培养基中油含 量的变化，得到降解油脂效率高的菌株。油脂降解率的计算公式：降解率彳初始 油含量残余油含量) 初始油含量乖1 0 0 。复筛结果见表2 2 。 表2 - 2 油脂分解菌的复筛结果 t a b l e 2 2t h ef i r s tr e p e a t e do fs c r e e n i n g 黟e 雏e d e c o m p o s i n gs t r a i n s 分解率( ) 编号重复l重复2重复3平均值( ) m7 8 37 6 58 0 17 8 3 m 13 2 4 3 4 1 3 5 63 4 0 m 53 8 93 7 63 9 53 8 7 m 73 6 93 4 73 4 23 5 3 m 83 5 63 1 42 9 53 2 2 m 1 23 5 03 2 83 6 63 4 8 m 1 43 4 53 2 13 0 73 2 4 1 9 华南师范大学硕士学位论文 m 2 64 0 34 2 o3 9 5 4 0 8 m 2 83 4 73 5 63 3 6 3 4 8 m 3 13 7 63 4 2 3 1 83 4 5 m 3 41 9 5 2 0 82 2 42 0 9 m 3 53 2 83 3 63 5 23 3 9 m 4 23 6 93 5 53 4 53 5 6 m 4 73 3 83 5 63 7 43 5 6 m 4 93 1 63 2 83 6 93 3 8 m 5 l3 5 63 8 4 3 7 53 7 2 m 5 43 0 73 2 8 3 7 63 3 7 m 5 93 2 4 3 6 93 1 73 3 6 m 6 23 3 5 3 6 13 5 63 4 1 2 2 2 菌种分离纯化结果 对复筛得到的菌株进行形态特征鉴定进行分离纯化，获得了三大类高效油 脂降解菌：6 株细菌、5 株霉菌和7 株酵母菌，它们均能在以花生油为唯一碳源 的培养基中较好生长。给这1 8 株菌分别编号，通过菌种细胞及菌落形态观察和 显微镜并显微镜下用校正好的目镜测微尺测出菌体大小，见表2 3 ，2 4 ，2 5 表2 3 筛选出的细菌在基础培养基上的特征 t a b l e 2 3c h a r a e t e r i s t i e so f s c r e e n e db a e t e r i ao nb t e r i a lp l a t ec u l t u r e m e d i u m 编号菌落特征细胞形态细胞大小 x l圆形、白色、湿润、中间微凸 细短杆状 0 3 1 1 u m x 2圆形、乳白色、较干燥、凸起 杆状 o 7 1 5 u m x 3圆形、深红色、湿润 细短杆状 o 2 1 1 u m x 4表面湿润，光滑，厚，边缘整齐 杆状，单个或成对排列 0 7 2 5 u m x 5 圆形、亮黄色、较湿润、中间凹杆状 0 6 1 2 u m 陷，边缘锯齿状 x 6表面湿润、薄、中间略突起 杆状 o 2 1 o u m 第二章油脂降解菌的筛选 表2 4 筛选出的霉菌在p d a 培养基上的特征 t a b l e 2 - 4c h a r a c t e r i s t i e so fs e r e e n e dh i n g u s o n p d a p l a t ec u l t u r e m e d i u m 编号菌落特征菌丝形态孢子 m l 圆形、初始灰白色，后变青色短丝、致密绿色孢子 m 2圆形、中间黄褐色菌丝细长、致密 黑色孢子 m 3 圆形、黄色短丝、致密黄绿色孢子 m 4圆形、白色，后变淡黄色短丝、致密 黄色至褐色 m 5 圆形、白色菌丝较长，致密黑色孢子 表2 5 筛选出的酵母菌在y p d 培养基上的特征 t a b l e 2 - 5c h a r a e t e r i s t i e so fs e r e e n e dy e a s t o ny p d p l a t ec u l t u r e m e d i u m 菌株编号菌落特征细胞形态 细胞大小 j l圆形、皱缩、较干卵形或球形 4 5 1 0 5 u m j 2圆形、中间凹陷 圆形、椭圆形 3 5 1 0 0 u m j 3圆形、椭圆形、湿润 圆形、椭圆形 4 0 9 5 u m j 4圆形、湿润、稍突起 卵形到长形 3 0 5 5 u m j 5圆形、不透明 圆形、卵形到长形 2 5 5 0 u m j 6圆形、表面菌丝状 圆形3 o 1 1 0 u m j 7圆形、平坦，乳白色 圆形2 5 1 3 0 u m 部分菌株在平板培养基上的菌落图片见图2 2 ，2 3 ，2 4 ，2 5 ，2 - 6 ，2 - 7 。 2 l 华南师范人学硕十学位论文 图2 - 2 基础培养基上x 1 的菌落 f i g 2 - 2c o l o n yo fx 1o nb a e t e r i a lp l a t e 图2 4 基础培养基上x 5 的菌落 f i g 2 _ 4c o l o n yo fx 5o nb a e t e r i a lp l a t e 图2 - 6p d a 平板上m 4 的菌落 f i g 2 6c o l o n yo fm 4o np d ap l a t e 图2 - 3 基础培养基上x 2 的菌落 f i g 2 - 3c o l o n yo fx 2o nb a e t e r i a lp l a t e 图2 - 5 基础培养基平板上x 6 的菌落 f i g 2 - 5c o l o n yo fx 6o nb a e t e r i a lp l a t e 图2 - 7y p d 平板上j 4 的菌落 f i g 2 - 7c o l o n yo fj 4o ny p dp l a t e 第二章油脂降解菌的筛选 2 3 本章小结 从华南师范大学南门垃圾场土样和学生第一食堂下水道水样中分离得到的 6 3 株菌中选出降解效率高的1 8 株油脂降解菌，6 株细菌、5 株霉菌和7 株酵母菌， 它们均能在以花生油为唯一碳源的培养基中较好生长，组成混合菌群，通过对其 花生油降解效率的测定发现，该菌群降解能力明显高于单菌株，在油浓度为4 0 0 m g l 时，较好的降解能力，对油的去除率保持在6 0 以上。说明混合菌在降解油脂 时有一定的协同作用。本研究降解实验都是应用混合菌。 华南师范大学硕士学位论文 第三章微生物降解油脂条件优化 3 1 材料和方法 3 1 1 实验材料 3 1 1 1 主要仪器： 名称 型号生产厂家 高压蒸汽灭菌锅 t h a 3 5 6 0 ca u t o c l a v e 台式恒温摇床 t h 2 一d 台式低速离心机 l - 5 5 0 长沙湘仪离心机仪器有限公司 分析天平 a c c u l a ba l c 赛多利斯科学仪器有限公 通风柜m t f g a深圳美加丽实验装备有限公司 定时加热磁力搅拌器 j b 2 金坛市荣华仪器制造有限公司 分光光度计 4 0 0 0 u 移液枪 e p p e n d o f f 3 1 1 2 主要药品试剂： 药品名称生产厂家 蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂 葡萄糖上海伯奥生物科技有限公司 蔗糖广州化学试剂厂 牛肉浸膏 北京双旋微生物培养基制品厂 酵母粉北京鼎国生物技术有限责任公司 琼脂广州威佳科技有限公司 花生油益海( 广州) 粮油有限公司 硫酸广州化学试剂厂 石油醚广州市云荟贸易有限公司 乙醚广州市云荟贸易有限公司 t w e e n 一8 0北京鼎国生物技术有限责任公司 硫酸铵 广州化学试剂厂 氯化钠天津广成化学试剂有限公司 磷酸氢二钾广州化学试剂厂 碳酸钙广州化学试剂厂 第二二章微生物降解油脂的条件优化 3 1 2 实验方法 将混合菌在培养液中培养2 4h 后，转接入装有1 0 0 m l 基础发酵培养基的 2 5 0 m l = 角瓶( 平行3 个) 中，按6 的量接种( b o u c h e zte ta 1 ，2 0 0 2 ) ，初始含油 量为4 0 0m g l ，培养温度3 2 ，摇床转速1 8 0r m i n ，培养7 2h ，分别进行以下几 组处理测定降解率的变化： 1 初始p h 值7 0 ，将培养基中花生油含量分别设置为4 0 0 、8 0 0 、12 0 0 、l6 0 0 和20 0 0 m g l ，其它培养条件不变观测降解率的变化，测试不同初始油脂含量条 件下油脂降解率与时间的对应关系； 2 将初始p h 值分别设为5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ，测试各自在培养7 2h 后降解 率的变化，测试不同初始p h 值条件下油脂降解率与时间的对应关系； 3 将培养温度设置为2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5 ，4 0 ，4 5 初始p h 值7 0 ， 其它培养条件不变考察温度对降解率的影响，测试不同温度条件下油脂降解率与 时间的对应关系； 4 初始p h 值7 o ，将培养基中分别加入0 ，2 0 0 ，4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，12 0 0m g l 表面活性剂( t w e e n 。8 0 ) 其它培养条件不变考察温度对降解率的影响，测试不同 含量表面活性剂条件下油脂降解率与时间的对应关系； 5 初始p h 值7 o ，分别设置连续振荡( 1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0r m i n ) 、间歇振荡( 每 振荡6h 后再静置6m 、静止5 组，考察供氧状况对降解率的影响，测试不同供氧 条件下油脂降解率与时间的对应关系； 3 2 实验结果与讨论 3 2 1 油脂初始浓度对混合菌降解油脂能力的影响 油脂初始浓度对混合菌降解油脂能力的影响随着含油量的增加，降解率呈现 逐渐减小的趋势( 见图3 1 ) ，当初始含油量只有4 0 0m g l 时，降解率可达n 8 1 5 ，但是当初始含油量达到20 0 0m g l 时，降解率则只有2 7 4 2 5 华南师范大学硕士学位论文 毋 裕 堪 鞋 4 0 08 0 01 2 0 01 6 0 02 0 0 0 油脂初含量( r a g 1 ) 图3 1 初始含油量对油脂降解率的影响 f i g 3 - 1e f f e c to f i n t i a lo i lc o n c e n t r a t i o no i ld e g r a d a t i o n 培养液中的油脂在液体表面形成一层油脂层严重影响氧的传递。在废水生物 处理过程中，油脂浓度对除油效果影响较大，除油率随着油浓度的增加而降低。 分析原因可能是高浓度的油脂对微生物的活性产生抑制作用( 张英等，2 0 0 2 ) 。 3 2 2 p h 值对混合菌降解油脂能力的影响 降解培养基的初始p h 值分别为5 、6 、7 、8 、9 ，3 2 c 恒温摇床振荡培养，7 2 h 取样测定油脂降解率，结果见图3 2 9 0 8 0 7 0 6 0 冰 鼯5 0 萋4 0 3 0 2 0 1 0 o 5 67 8 9 7 ) h 图3 - 2 培养基初始p h 值对油脂降解的影响 f i g 3 - 2e f f e c to fi n i t i a lp ho no i ld e g r a d a t i o n 油脂降解菌对p h 值具有较广泛的适应范围( 图1 ) ，从p h5 - 9 均具有良好的适 应性。其中在p h7 - 9 范围内降解率可达到6 0 以上，在p h 值为8 时降解率最高， 达到7 9 6 。 踟加的如加m 0 第二章微生物降解油脂的条件优化 培养基的p h 值对微生物是非常重要的一种环境因素，其对微生物的生命活 动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物 质的吸收；影响代谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有 害物质的毒性等等。每种微生物在一定的培养基中均有其生长和作用的p h 值范 围，只有在最适p h 值范围内微生物才能最有效地发挥其作用，超出一定范围， 微生物生长就不正常甚至死亡。因此，研究特定微生物在特定培养基中的生长及 作用是很有必要的。 对酸碱敏感是酶的特点之一。p h 对酶作用的影响主要有这几方面：过酸或 过碱使酶本身失活；p h 的改变影响酶分子活性部位上的有关基团的解离；p h 的改变影响底物分子的状态。因此每一种酶只能在一定的p h 范围内才表现出 活性。偏碱性的环境有助于酶的活性。 3 2 3 温度对菌株降解油脂能力的影响 油脂( 甘油脂) 的分解首先是经脂肪酶的作用水解成甘油和脂肪酸。跟一般 的化学反应不同，酶作为生物催化剂，它的反应条件比较温和，必须在一定的 温度范围内才能发挥作用。油脂降解菌对温度的适应范围较广泛，在2 0 4 5 时， 降解率可达到5 1 7 一7 8 8 ，尤其是在3 0 4 0 时降解率变化不大，其中在 3 5 达到最高( 见图3 。3 ) 。 冰 褥 琏 遴 2 uz 53 03 54 u4 b 温度 图3 3 培养温度对油脂降解的影响 f i g 3 3e f f e c to ft e m p e r a t u r eo no i ld e g r a d a t i o n 从图3 3 可以看j 乜，培养液的催化作用的最适反应温度均为3 5 左彳i 。温 度对酶促作用有两种不同的影响，在一定范嘲内，酶促反应速度随着温度的升 高而加快；另一方面，酶是蛋白质，遇热易变性失活。因此在反应中测得的酶活 是这谬j 种相反作用的综合结果：在低浓度范围内，前一种作用占主导地位，也就 加们寻m o 华南师范人学硕士学位论文 是随着温度的升高，反应速度加快，表现出来就是酶活的升高。这一点我们从 图3 3 中可以看出，在较低的温度时，随着温度的升高，降解率逐渐升高；当温 度升高到一定限度时，后一种作用产生的影响更大，从图3 3 表现出来的就是 降解率降低。 温度的影响有三个方面。温度适中，微生物生长繁殖加快，除油率高，升高 或降低温度，部分除油菌进入内源呼吸期，开始代谢自身细胞内的营养物质，并 逐渐死亡，此时菌体的生长、繁殖速率减慢，导致除油率下降( 赖万东等，2 0 0 0 ) 。 另一方面，温度对脂肪酶的活性也有影响，一定的脂肪酶有一定的最适作用温度， 超出最适温度范围，酶的活性都有一定程度的下降。据国内有关文献报道， 目 前筛选的油脂降解菌多为嗜温微生物，其酶最适作用温度为3 0 - 4 0 c 。最后，温 度也可以影响物质的运输状况，控制物质运输的主要参数如粘度、扩散速率、甘 油三脂和游离脂肪酸的水溶性都随着温度的升高而影响显著，虽然随着温度的升 高，溶解在水中的氧减少，但研究表明：物质传递系数的显著增加能够导致氧的 有效运输( p e t e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同时在较高的温度下进行脂降解的另一个优点是可 以净化操作，当温度高于6 0 时，能够避免人类病原体的积累及感染其他杂菌， 所以人们都在尽量筛选嗜热微生物来降解油脂( p e t e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。胞外脂肪酶 多为碱性酶在油脂废水的降解过程中，要充分考虑各种因素，选择合适的处理温 度，一般水温保持在3 0 - 4 0 。 3 2 4 表面活性剂( t w e e n 8 0 ) 浓度对混合菌降解油脂能力的影响 表面活性剂具有亲水和亲油基团，可防止油水之间的相互排斥，并具有使其 相互作用的功能。因此，可以增加疏水性物质在水相中的溶解度，进而提高油脂 在水中的乳化度从而增大与菌体的接触面积，增加其生物可利用性，提高油脂降 解速率。以t w e e n 8 0 为代表，研究非离子型表面活性剂对油脂生物降解的影响。 t w e e n 8 0 是由失水山梨醇油酸单质与环氧乙烷加合而成的非离子型表面活性剂， 具有很好的增溶和乳化作用，从图3 4 可以看出，其对油脂降解的促进作用明显， 而其毒性比较小，是较为理想的降解促进剂。不同浓度的t w e e n 8 0 对菌种性能的 影响是不同的，其结果如图3 _ 4 第二章微生物降解油脂的条件优化 毋 梃 琏 鞋 02 0 04 0 0 6 0 08 0 01 0 0 01 2 0 0 t w e e n 一8 0 浓度( m g l ) 图3 4 不同浓度t w e e n 一8 0 对油脂降解率的影响 f i g 3 - 4e f f e c to f c o n c e n t r a t i o no f t w e e n 一8 0o no i ld e g r a d a t i o n 从图3 - 4 可以看出，在一定浓度范围内t w e e n 8 0 对油脂降解具促进作用，当 t w e e n - 8 0 的浓度 8 0 0m g l 时，油脂的降解率随t w e e n 8 0 浓度的提高而增加，在 浓度为8 0 0m g l 油脂降解率达到8 4 5 。当t w e e n 一8 0 浓度过高时，降解率与 t w e e n 8 0 浓度呈负相关关系。很显然，表面活性剂的存在不但解除了由于油脂的 存在而导致的缺氧而对微生物活性的抑制，同时还增大了微生物和酶与油脂的接 触范围。由于微生物降解油脂主要由脂肪酶作用，而脂肪酶的一个最显著的特点 是它不同于其它多数水解酶的催化特性：即该酶催化的水解反应是一种非均相体 系，在油水界面上其催化活力最大，水溶性的酶在底物( 水不溶性) 和水的界面上 催化底物反应，对水溶性底物不起催化作用。t w e e n 8 0 的存在使酶与底物接触机 会增大，其结果是降解率提高。 脂肪酶向胞外分泌时，细胞壁会阻滞酶向体外分泌，通过在培养基中加入表 面活性剂，可增大细胞壁的通透性，提高产酶量：但