（化学工程与技术专业论文）基于树状聚合物纳米载体的分子设计、合成与表征.pdf

at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：l i ux i n s u p e r v i s o r ：p r o f x uh a i a d v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f w a n gs h e n g ji e l i i ii iiii i i | i i ii iii ii ii ii y 18 7 5 9 0 2 rb a s e do n c o l l e g eo fc h e m i s t r y & c h e m i c a le n g i n e e r i n g c h i n au n i v e r s i t yo f p e t r o l e u m ( e a s t c h i n a ) i 研究工作所取得的 1 1 以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名： 塞区 日期： 乃f 年 厂月日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印 刷版和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机 构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、 借阅和复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、 缩印或其他复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名：盖l 蕉 指导教师签名：箬半肛 日期：2 。1 年月f t 日期：少f 年彳月名 e 1 摘要 树形分子具有分子量分布单一、分子结构明确的 ，这在聚合物承载客体小分子方面具有重要的应 化的树形分子以其低毒性，良好的生物相容性以 及增强的e p r 效应受到了广泛的关注。另外，超支化聚合物以其与树形分子类 似的结构与性质以及相对方便快捷的合成途径得到了越来越多的重视，采用多官 能度小分子为核，并通过在聚合过程中分步加入单体的方法，在一定程度上可以 控制分子结构，提高支化度，同时降低分子量分布。 通过发散法合成了p a m a m 树形分子，并主要选用g 4 0 树形分子进行了 p e g 改性，树形分子通过具有p h 敏感性的亚胺键与p e g 修饰的疏水单元连接， 制备了以p a m a m 树形分子为基的具有p h 敏感性质的纳米载体体系。通过红外 光谱、核磁共振、凝胶渗透色谱光散射等方法进行了分子结构和分子量表征， 并利用z e t a 电势动态光散射等对其在水溶液中的性质进行了考察，证明其具有 在中性条件下稳定，而在酸性条件下易于水解的p h 敏感特性。分别以疏水性的 对硝基苯胺和亲水性的玫瑰红( i 疆) 为模型客体分子，利用紫外光谱研究了所 合成聚合物对客体分子的包覆和释放性能，结果表明聚合物体系对疏水性的小分 子具有显著的增溶作用，但释放较快，而对于r b 分子，由于其与p a m a m 内部 叔胺基团间存在静电作用，因此表现出一定的缓释作用，而且随溶液p h 改变呈 现出不同的释放速率。p a m a m 表面的疏水基对稳定r b 具有一定作用，即使在 加入n a c i 隔离主客体分子间的电荷作用的情况下也能体现。 脂肪族超支化聚酯具有良好的生物相容性和可降解性，具有作为纳米载体的 潜质。设计了以超支化聚酯为基表面修饰聚乙二醇的两亲性纳米载体体系。通过 准一步法，分别以3 羟甲基丙烷和季戊四醇为核，以2 ，2 二羟甲基丙酸为反应 单体熔融缩合得到了超支化聚酯。并对其羟值，支化度，热性能等进行了表征。 选用以季戊四醇为核的四代聚酯进行了表面p e g 修饰，合成了两亲性的纳米载 体体系。研究发现其可以显著提高疏水性小分子在水溶液中的溶解性，而其释放 行为具有典型的扩散控制的特点。 关键词：纳米载体，p a m a m ，超支化聚酯，p e g 修饰，包覆及释放 a b s t r a c t d e n d r i m e r sh a v ea t t r a c t e d g r e a ta t t e n t i o nf o rt h e i rm o n o d i s p e r s e dm o l e c u l a r w e i g h t sa n dw e l l d e f i n e ds t r u c t u r e i na d d i t i o n ，t h e yc a nb eu s e da sn a n o c a r r i e r s b e c a u s et h e r ea r ei n n e rp o c k e t si nt h em o l e c u l e s p e g l y t e dd e n d r i m e r sa r e d e v e l o p i n g r a p i d l yr e c e n t l yo w i n gt ot h e i re x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t ya n di n c r e a s e de p re f f e c t w h i c hi sr e l a t e dw i t ht h ea b i l i t yf o rp a s s i v et a r g e t i n gi nc a n c e rt r e a t m e n t i n t r o d u c t i o n o fa h y d r o p h o b i cs h e l lo nt h es u r f a c eo fd e n d r i m e rc a ni m p r o v et h ec o m p l e xs t a b i l i t y b e s i d e s ，c o m p a r i n g w i t h d e n d r i m e r s ，h y p e r b r a n c h e dp o l y m e r sh a v es i m i l a r c h a r a c t e r i s t i c so fs t r u c t u r e sa n dp r o p e r t i e se x c e p tf o rl o w e rd e g r e eo fb r a n c h i n ga n d h i g h e rp o l y d i s p e r s i t yo fm o l e c u l a rw e i g h t m o r ei n t e r e s t i n g l y ，t h e ya r es y n t h e s i z e d v i aas i m p l ea n dc o n v e n i e n t a p p r o a c h h y p e r b r a n c h e dp o l y m e r so b t a i n e dv i a i m p r o v e da p p r o a c h e si n c l u d i n ge m p l o y i n gm u l t i r e a c t i o n a lm o l e c u l ea sc o r ea n d m u l t i s t e pp o l y m e r i z a t i o na r ea l s oa t t r a c t i v ea n dh a v em a n yp o t e n t i a la p p l i c a t i o n s ， s u c ha sh o s t - g e s tc h e m i s t r y a p h 。s e n s i t i v en a n o 。c a r r i e rs y s t e mb a s e do np a m a md e n d r i m e rw a sd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d t h em o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dw e i g h to ft h en o v e ln a n o c a r t i e rw a s c h a r a c t e r i z e du s i n gi r ，n m ra n dg p c l s i t sp r o p e r t i e si ns o l u t i o nw e r es t u d i e d u s i n gd l sa n dz e t ap o t e n t i a l i tw a sp r o v e dt h a tt h en a n o c a r t i e rh a dr e l a t i v e l y s t a b i l i t ya n dc o u l dh y d r o l y s i sr a p i d l yi na c i d i cs o l u t i o n w eu s e dp - n aa sa h y d r o p h o b i cm o l e c u l ea n dr o s eb e n g a la sah y d r o p h i l i cm o l e c u l et or e s e r c ht h t h e i r e n c a p s u l a t i n ga n dr e l e a s i n gp r o p e r t i e s t h er e s u l ts h o w st h a tp - n aw a sr e a d i l y r e l e a s e df r o mt h ep o l y m e r ；w h i l et h er e l e a s eb e h a v i o ro fr bi s d e p e n do np h t h e h y d r o b o b i cg r o u po nt h es u r f a c eo fd e n d r i m e rc a na c ta sb a r r i e r st ok e e pr bi n s i d e t h i sf u n c t i o nc a na l s ob ep r e s e n t e de v e nw h e nt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a t i o nb e t w e e nt h e p r o t o n a t e dp a m a mc o r ea n dn e g a t i v er bm o l e c u l e sw a sd i m i n i s h e db ya d d i n gn a c l w h e nt h ep hw a sd e c r e a s e d ，t h eh y d r o p h o b i cg r o u p so nt h es u r f a c e so fd e n d r i m e r w e r ec l e a v a g e d ，w h i c hc a u s e dd i f f e r e n tr e l e a s eb e h a v i o ro fr b a m p h i p h i l i ch y p e r b r a n c h e dp o l y e s t e r sh a v ei n t r i g u i n g b i o c o m p a t i b i l i t y a n d b i o d e g r a d a b i l i t y a na m p h i p h i l i cn a n o - c a r r i e rs y s t e mb a s e do nh y p e r b r a n c h e d p o l y e s t e rw a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d w ep r e p a r e dh y p e r b r a n c h e dp o l y e s t e ru s i n g p s e u d o o n ep o tm e t h o d t h es t r u c t u r e ，h y d r o x y lv a l u ea n dt h e r m o p r o p e r t i e so f h y p e r b r a n c h e dp o l y e s t e ra r es t u d i e d t h ea m p h i p h i l i cn a n o c a r r i e ri ss y n t h e s i z e dv i a p e g l y t i o no nt h es u r f a c eo fh y p e r b r a n c h e dp o l y e s t e r t h ec a r r i e rc a ni m p r o v et h e s o l u b i l i t yo fh i g h l yh y d r o p h o b i cg u e s tm o l e c u l e si nw a t e ra n di t sr e l e a s ep r o f i l e p r e s e n t sd i f f u s i o n c o n t r o l l e db e h a v i o r k e y w o r d s ：n a n o 。c a r r i e r ，p a m a m ，h y p e r b r a n c h e d p o l y e s t e r , p e g l y t i o n ， e n c a p s u l a t i o na n dr e l e a s e l i l 目录 1 1 1 1 1 2 超支化分子2 1 2 重要的树枝状聚合物3 1 2 1 聚酰胺胺类树形分子p a m a m ( p o l ya m i d oa m i n e ) 3 1 2 2 以氨基酸为单体的树形分子：7 1 2 3 生物可降解树形分子一9 1 2 4 憎水性树形分子：1 1 1 3 树形分子在药物靶向作用中的应用一1 2 1 4 超支化分子的合成及其在药物载体中的应用1 3 1 5 本文选题意义1 4 第二章基于p a m a m 的p i l l 敏感纳米载体的合成、表征及对疏 水小分子的包覆与释放研究1 5 2 1 引言15 2 2 实验部分。l6 2 2 1 实验原料与试剂1 6 2 2 2 合成路线：1 7 2 2 3 合成部分一2 0 2 2 4 表征部分2 2 2 3 实验结果及讨论一2 2 2 3 1p a m a m 合成部分2 2 2 3 2g o 0 到g 4 0 分子的胺基值滴定2 6 2 3 3 疏水基团修饰的聚乙二醇链的合成及其与p a m a m 树形分子的连接2 7 2 3 4 载体在酸性条件下的水解3 3 2 3 5 以对硝基苯胺( p n a ) 为客体分子的包覆和释放一3 4 2 4 本章小结3 6 第三章p a m a m 基载体与r b 分子的作用行为研究3 8 3 1 引言3 8 3 2 实验部分3 8 3 2 1 原料3 8 3 2 2p a m a m g l y - o h 的合成3 9 3 2 3p a m a m p e g 的合成3 9 3 2 4p a m a m a b p e g 的合成4 0 3 2 5 溶液中z e t a 电势和粒子尺寸的测定4 1 3 2 7r b 浓度曲线的绘制4 1 3 2 8k l o t zp l o t 的绘制一4 1 3 2 9 树形分子对r b 结合量的测定4 2 3 2 1 0 释放曲线的测定4 2 3 3 结果及讨论4 2 3 3 1 合成及表征4 2 3 3 2z e t a 电势4 8 3 3 3 分子量及水溶液中粒子尺寸4 9 3 3 4 树形分子对r b 的结合能力5 2 3 3 5 通过克罗兹方程( k l o t zp l o t ) 来研究树形分子对r b 的结合性质5 3 3 3 6r b 分子的释放行为5 8 3 4 本章小结6 2 第四章超支化聚酯基纳米载体的合成与表征6 3 4 1 引言6 3 4 2 实验原料及仪器6 4 4 2 1 实验原料一6 4 4 2 2 合成步骤一6 4 4 2 3 羟值测定6 6 4 2 4 超支化聚酯表面修饰p e g 一6 7 4 2 5 红外吸收光谱测定。6 8 4 2 6 cn m r 核磁测定6 8 4 2 7 热性能分析6 8 4 3 结果与讨论一6 9 4 3 1 熔融聚合制备聚酯的实验条件设定6 9 4 3 2 聚酯的表征及性质研究7 0 4 3 3 热性能分析7 4 4 3 4 羟值的测定7 7 4 4 5 超支化聚酯的表面p e g 修饰7 7 4 4 本章小结一81 第五章结论。8 2 参考文献8 3 攻读硕士期间取得的学术成果9 1 致谢。一。 9 2 中国石油人学( 华东) 硕上学位论文 第一章文献综述 在过去的十年中，纳米药物载体作为一种新型药物的研究引起了人们的广泛 关注，这些载体被广泛的应用到运送药物，基因和显像剂，这些载体可以控制药 物在体内的分布，杀死肿瘤细胞且不对健康的组织产生影响。这些纳米级别的用 于药物运送的材料包括：脂质体，聚合物药物化合物，聚合物d n a 的络合物和 聚合物胶束。区别于传统线形聚合物的树形大分子和超支化分子以特殊的结构和 特点成为了药物缓释体系新的研究热点。 1 1 树状聚合物 树状聚合物主要分为树形分子( d e n d r i m e r ) 和超支化聚合物( h y p e r b r a n c h e d p o l y m e r ) 两大类。相对于传统的线型高分子，树状聚合物有着很多独特的性质。 例如：树状聚合物分子的链缠结很少，在熔融条件下，表现出很低的黏度；其表 面存在有大量的活性基团，易于功能化改性；以及树状聚合物内部存在空腔结构， 表面又具有很多反应性基团，这奠定了其作为药物输送体系的基础。因此，树状 聚合物引起了人们的广泛关注，成为目前聚合物领域的研究热点之一。 l i n e a r h yp e r b r a n e h e d d e n d i i m e r 图1 - 1 线形、超支化及树形大分子的结构示意图 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo fl i n e a r , h y p e r b r a n c h e da n dd e n d r i t i cp o l y m e r s 1 1 1 树形分子 树形结构在自然界中是一种十分常见的拓扑结构，在非生物界例如雪花的结 晶等。而在生物界中这种结构更为常见：树的根系和枝叶，神经元，动植物的体 液传输系统等等。尽管为什么自然界中会存在这么多的树形支化的结构的原因并 不是很明了，但是有一点可以明确：这种经过数亿年进化形成的结构在能量和物 第一章文献综述 质的获取和分散，信息的存储和传导的过程中发挥着极其重要的作用1 1 1 。 图l - 2 树形分子结构 f i g 1 - 2m o l e c u l a rs t r u t u r eo fd e n d r i m e r 而最初的树形分子的合成也是怀着向自然界学习的想法出发的。树形分子 ( d e n d r i m e r ) 这个词源自于希腊语的( d e n d r o n ，树) ，是一种有着特别的支化结 构和紧密的球状外形的分子。 v o g t l e l 2 1 与他的合作者们在7 0 年代先驱性的研究了从一个多官能度的核出发 使用二胺作为增长单元，通过控制合成的方法首次得到了具有重复支化结构的分 子，其具有大量的空腔结构。 直到1 9 8 4 年，一个高度支化的聚合物分子家族才诞生，并引起人们的广泛关 注。t o m a l i a 【3 - 4 1 和他的团队将乙二胺重复的连接在一个多元胺的核上，得到了一 系列的高度支化的分子，这也是p a m a m 树形高分子的基础。 树形分子是由一些独立的楔形结构的单元和一个多官能度的核组成，楔形结 构单元( w e d g e ) 通常被称为d e n d r o n ，每一层的重复单元而形成的一个完整的 支化结构成为一代( gg e n e r a t i o n ) ，树形分子的代数是决定其分子量、大小和表 面基团数量的重要参数。在过去的三十年中，各种各样的有着不同性质的树形分 子在化学、生物、药学中得到了广泛的研究和应用【量6 1 。以下将对树形分子的一 般合成方法，主要的树形分子家族和树形分子作为药物缓释载体的应用做一个简 要的介绍： 1 1 2 超支化分子 相比较树形分子来说，超支化分子有着类似的支化分子结构，但是由于合成 2 中国石油人学( 华东) 硕上学位论文 过程中没有逐步的保护和脱保护的反应，使得分子结构中有许多没有完整支化的 结构。超支化高分子通常由a b x 型单体自聚合得到，故其分子量分布比普通线 型高分子宽。超支化高分子分子量的分散性可通过添用多官能度的核，降低核的 浓度或采用缓慢滴加单体的方法进行控制。由于其制备方法简单，省去了树形聚 合物制备过程中繁复的保护、脱保护步骤，其研究和应用领域不断拓展。 1 2 重要的树枝状聚合物 1 2 1 聚酰胺一胺类树形分子p a m a m ( p o l ya m i d oa m i n e ) 聚酰胺胺( p a m a m ) 是最早被合成并商业化的树状大分子。p a m a m 的合 成由一个脂肪胺( 例如乙二胺或丁二胺等) 与丙烯酸甲酯的m i c h a e la d d i t i o n ，得 到一个甲酯基结尾的中间体，这个中间体可以被转化为c o o h ，n h 2 ，o h 结尾 的最小代数的分子。这个中间体与过量乙二胺( e d a ) 继续反应就可以得到表面 有4 个氨基的g o 分子。重复这个过程就能得到高代数的单分散的p a m a m 分子。 随着代数的增加，通过这种发散性合成的方法碰到了空间位阻的问题。这种现象 表现在分子量分布的大幅度的上升和其他的一些方面，这在合成g 7 的分子中观 察到，被称为是g e n n e s 堆积效应。而合成g 1 0 以上的树形分子几乎已经不可能 1 7 ，8 1 。 r c 0 2 m e 竺弋y h 荆山嗍、桃 图1 - 3p a m a m 合成的一般路线 f i g 1 - 3s y n t h e t i cr o u t eo fp a m a md e n d r i m e r 除了p a m a m 树形分子，及其表面改性的分子外，p a m a m 线形树形杂化 聚合物，也不断涌现出来。其中最为常用的以聚乙二醇为线性单元的聚合物，这 种合成方法用双端基为氨基的聚乙二醇为核，在其两端进行控制增长而得到的。 比起单纯的p a m a m ，这类分子的毒性和引起免疫的能力更低1 9 1 。 第一章文献综述 g 3 图1 - 4p a m a m 聚乙二醇线性树形混合分子 f i g 1 4p a m a m - p e g l i n e a rp o l y m e r - d e n d r i m e rh y b r i d s p a m a m 以其特殊的结构，较小的尺寸和表面大量的官能团等性质，引起了 研究人员的广泛兴趣，积极拓展其在生物和药学领域中的应用，这从评价其毒性 和引起免疫的能力开始的。 d u n c a n 和她的团队报道了g 1 g 4 州a m 对三种肿瘤细胞的作用，发现 p a m a m 分子在细胞中培养7 2 小时后，树形分子表现出明显的毒性，i c 5 0 的数 值分布在5 0 到3 0 0ug m l 之间。把b 1 6 f 1 0 小鼠黑瘤素细胞培养在g 4 n h 2 树 形分子( 51 1g m l ) 的溶液中时，为一个小时后发现了细胞的死亡。p a m a m 的 这种毒性归因于表面大量的氨基电离而造成的聚阳离子效应，随着p a m a m 的 代数，浓度，培养时间的增加，这种毒性有明显的上升趋势。而将p a m a m 表 面的氨基转化为其他带负电荷或是中性的基团的时候，这种毒性大幅度的下降 u o 0 而表面为氨基的p a m a m 却是小分子药物或是d n a 片段的优良载体，通常 客体分子和树形分子本身通过静电或配位作用可以形成结合物，这大大提高了客 体分子的承载数量。k o h l e 1 1 】等人研究了表面为氨基的p a m a m 分子与布洛芬 ( i b u p r o f e n ) 的作用。氨基可以通过和药物分子中的羧基的离子作用，而增强其 在树形分子中的承载量。布洛芬分子不仅可以增容在树形分子的空腔内部，也可 以在表面形成作用。平均每个表面为氨基的p a m a m 分子可以增容多达7 8 个客 4 中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 体分子，远远大于表面为羟基的聚酯超支化分子。 p a m a m 分子进入细胞内部的速度也是非常快的。k a n n a n l l 2 1 等人也使用布 洛芬作为模型药物来研究p a m a m 进入a 5 4 9 人体肺部上皮癌细胞的过程。 p a m a m - n h 2 和p a m a m o h 可以在一个小时内进入细胞，快于超支化聚酯进入 细胞的速度( 需要两个小时) 。如果将布洛芬通过化学键作用，并通过f i t c 进 行荧光标记，则p a m a m 分子进入细胞的速度会更快，仅仅需要1 5 分钟左右。 通过化学键连接的药物p a m a m 可以增加其在体液环境中的稳定性，除此 之外，还可以降低药物引起的免疫，并通过连接基本身的性质来调控药物释放的 速率。虽然这方面的研究工作已经有广泛的开展，但是仍有许多具有挑战性的问 题存在。 d u n c a n 1 3 j 4 】等人将3 5 gp a m a m 分子和顺铂( c i s p l a t i n ) 反应得到了树形分子 铂的化合物，产品在水中的溶解度很大，并在体外实验中反先铂有缓慢的释放。 同时也发现d e n d r i m e r - p t 在肿瘤处聚集的数量是单纯药物的5 0 倍，但是同时药 性也有明显的降低( 小3 1 5 倍) 。 化学键结合的树形分子一小分子药物化合物的释放行为也有其特点，因为其 进入细胞的速率更快，所以带来的治疗作用也有明显的区别与传统线性聚合物的 特点。k h a n d a r e 1 5 】等人比较研究了聚乙二醇药物化合物和p a m a m 药物化合物 的释放行为，使用己二酸作为连接基，用紫杉醇为模型药物。对比两者的释放曲 线，因为连接基的相同，两者的释放速率并没有出现明显的差别。p e g 药物结 合物的毒性要比纯药物的低，归因于分子量的增加和较慢的进入细胞的速率。而 p a m a m 药物结合物比纯药物却要高出1 0 倍，这是由于其进入细胞较快的速率。 p a t r i m 】等人比较研究了以p a m a m 包合药物甲基蝶呤( m t x ) ，以及将m t x 通过共价键连接在p a m a m 表面的两种体系的区别，用以对比物理包合作用和 化学共价连接药物。因为p a m a m 表面的氨基同过于缩水甘油的反应转化成了 羟基，减少载药量的同时也加快了药物释放的速率。在体外释放实验中，当将环 境从蒸馏水换成生理盐水时，物理包合m t x 的p a m a m 释放曲线表明m t x 从 树形分子中释放速率非常快，与纯药物的释放行为基本没有差别，由此说明树形 分子和m t x 的作用在提高离子强度的环境中迅速减弱，从而迅速释放出来。而 使用酯键相连接药物的树形分子能明显的提高m t x 在体系中的保存时间。由于 第一章文献综述 酯键的稳定性，药物的释放速率也相对较慢，所以细胞毒性也较低。 将p a m a m 的表面直接修饰上p e g ，可以在增加分子量的同时，大大降低 其毒性，提高生物相容性。但与小分子药物的结合力明显下降，因为这些游离的 氨基对于稳定客体分子是有至关重要的作用的，这个机理被称为是质子海绵作用 ( p r o t o ns p o n g em e c h a n i s m ) 。 c h i ek o j i m a i 】等通过胺酯键将p a m a m 表面修饰长链的聚乙二醇分子，并 研究其对阿霉素( d o x ) 和甲基蝶呤( m t x ) 的增容作用。因为m t x 中含有羧 基，可以与p a m a m 分子中的三级胺产生弱的离子作用，所以其增容量要大于 d o x 。但是通过体外释放的考察，p a m a m p e g 这个体系并没有起到缓释药物 的作用，小分子药物在体液环境中迅速的被释放出来。 w a n g l l 8 l 等人报道了p a m a m h p m a 的星形聚合物体系，并通过四个氨基酸 的短肽联结药物分子d o x 。这个体系是由有羧基的引发剂合成p h p m a c o p o l y m e r 然后用n h s d c c 的方法将单端活性的聚甲基丙烯酸羟丙酯 ( s t - p h p m a ) 修饰到p a m a m 的表面。对比于单纯的p h p m a 共聚物，它的细 胞毒性要低，这归因于较慢的细胞进入速率和相对较慢的释放速率。 针对于提高小分子药物在水溶性树形大分子中增容稳定性的问题，研究者们 提出了各种不同的方法，除了上述的通过化学键形成稳定的化合物外，另外一种 重要的方法是在水溶性树形大分子表面引入疏水链段，这个方法最初在e w m e i j e r 的研究小组中最先发展起来。 e w m e i j e r t g l 等使用聚丙烯亚胺p p i ( p r o p y l e n ei m i n e ) d e n d r i m e r 为基体， 通过d c c n h s 得在其表面修饰上氨基由f m o c 或者b o c 保护起来的疏水性氨 基酸，得到“树形分子盒( d e n d r i t i cb o x ) 。当通过甲酸脱去b o c 保护基团或是 在哌啶作用下脱去f m o c 后，d e n d r i t i cb o x 被部分打开，其中增容的一些体积较 小的分子可以透过d e n d r i m e r 表面的壁垒而释放出来，但是增容的一些体积较大 的分子仍然留在其中。再通过强酸作用( 例如h c i ) ，将酰胺键断裂从而把氨基 酸脱去后，d e n d r i t i e b o x 被完全打开，由此增容的所有分子都可以被释放出来。 6 ；a 协| y 姆 图1 5 m e i j e r 等人提出的d e n d r i m e rb o x f i g 1 - 5m e i j e r sd e n d r i m e rb o x k e n j ik o n 0 1 2 0 1 等报道了使用p e g 修饰表面连接有疏水性氨基酸的p a m a m d e n d r i m e r 的体系，通过k l o t zp l o t 研究了客体分子在这个体系的增容位置，发现 客体分子仍然增容在p a m a m 的空腔中，因为有无疏水性氨基酸的两个体系的 结合位点并没有差别。并通过r o s eb e n g a l ( i 也) 作为客体分子研究了连接有疏 水性氨基酸的p a m a m p e g 体系的稳定性，发现客体分子的释放速度对于没有 修饰过的p a m a m p e g 体系要显著下降。 1 2 2 以氨基酸为单体的树形分子： 树状多肽( p e p t i d ed e n d r i m e r ) 广义的定义指所有包含多肽的树枝状大分子， 树状多肽具有一般树枝状大分子的普遍特性，如规则的多分支类球型结构、密集 的表面集团、分子中较大的空腔等。它相对于线性多肽具有更好的水溶性、更强 的耐水解酶能力和对细胞更小的毒性，其上众多的结合位点可以结合更多有用的 基团，因此树状多肽在生物化学、分子生物学及化学生物学中具有很广阔的应用 前景。 1 9 6 3 年m e r r i f i e l d l 2 1 】首先介绍了固相多肽合成法，该方法简便易行，至今已 7 第一章文献综述 经发展成为合成多肽、寡核苷酸甚至某些有机小分子的通用方法【2 2 1 。1 9 8 8 年t a m 首先介绍了以赖氨酸为核心的树状多肽的合成。 发散法合成树状多肽多采用此法，具体的合成步骤与线型多肽相同。通常合 成开始于以d i b o c 或d i f m o c 保护的赖氨酸合成二级或三级的分支结构，然后其 它多肽序列被一步一步合成到该赖氨酸骨架上。合成结束后，将所得的树状多肽 从树脂上切割下来，进行进一步的提纯和表征。 随着赖氨酸级数的增加，分子中发生链间聚集的倾向也逐渐升高。为了减轻 这种效应，发散法要求在开始合成时采用较低的树脂负荷，一般是0 1 m m o l g 树 脂，比通常固相法的o 3 0 8 m m o l g 树脂低得多。而阻碍连接反应的链间氢键的 形成也可以通过采用特殊的溶剂组合和提高反应温度来实现【2 3 t2 4 1 。 除赖氨酸外，c r e s p o 等人介绍了以顺式4 氨基l 脯氨酸为分支单位的树 状多肽。分步发散合成法的一个变体是在赖氨酸骨架上连接不同的肽链，该问题 通过使赖氨酸的q 和氨基端具有不同的保护基而解决，通常分别为b o c 和 f m o c 。 除固相合成法外，传统发散液相多肽合成法也在树状多肽合成中得到应用。 h e m a n d e z 等1 2 6 j 利用氨基酸n 2 羧基内酸酯发生开环聚合反应，得到具有多聚赖 氨酸长链的树状多肽，产率较高。b a i g u d e 等旧使用d i b o c 保护的赖氨酸液相合 成具有多糖外层的树状多肽。c h o i 等【2 8 1 以液相多肽合成法在聚7 , - - 醇高分子两 端合成赖氨酸骨架，成为哑铃型树状多肽分子。c h a p m a n l 2 9 】等报道了使用液相合 成法得到p e g 赖氨酸b o c 线形树形杂化分子，并研究了其表面行为。 g i l l i e s l 3 0 】等人提出了一个极具新意的线形树形杂化分子的p h 敏感型胶束体 系。具体的思路是将p e g 赖氨酸的氨基末端通过缩醛键连接上疏水分子。在p h 降低的情况下，缩醛键断裂，则整个分子中疏水的部分离去，从而组成胶束的驱 动力消失，增容在其中的客体分子被释放出来。体系的c m c 也可以由树形接枝 的代数来精确控制。 8 中国石油人学( 华东) 硕士学位论文 p hc l e c r e a s e e n c a l 眦l a t e d p a y l o a d 图1 - 6 f r e c h e t 等人合成的p h 敏感型胶束 f i g 1 - 6p hs e n s i t v em i c e l l em a d eb yf r e c h e t 1 2 3 生物可降解树形分子 x ，。p ：一i c 、之 兹式_ 岁飞( 童黧) n 誓 一弋矗一。一? 。、f o ：? 一 j ，f 弋二h3 厂、专s 。一一。0 一f ?，。了一，” 9 第一章文献综述 g r i n s t a f f 在后续的研究中将p g l s a 树形分子用于承载染料客体分子，并通 过二维核磁氢谱研究了客体分子与树形分子的作用。结果表明憎水性的客体分子 与树形分子之间有较强的作用力。为了发展p g l s a 作为药物载体，在同一研究 小组内，将一种憎水性抗癌药物1 0 羟基喜树碱增溶在g 4 的p g l s a 中，其溶液 对人类乳腺癌细胞具有很强的杀伤作用，由此证明了p l g s a 树形分子作为药物 载体的能力3 3 ，3 4 1 。 正如前面所述聚酯分子因为其出色的生物相容性和可降解性引起了很多研 究者的注意，在同一时期a n d e r sh u l t 和j m jf r e c h e t l 3 5 3 6 1 的研究小组报道了以2 ， 2 二羟甲基丙酸为单体合成聚酯树形分子，以及树形聚酯聚乙二醇树形线形聚 合物的方法。 在f r e c h e t 的研究小组中，以2 ，2 二羟甲基丙酸作为单体而合成的树形聚酯 成功得由发散法和收敛法的综合运用合成。g 4 的具有三个d e n d r o n 的聚酯分子 有十分良好的水溶性，热稳定性。但是在生物体内分布实验中，表面修饰有短链 p e g 的聚酯树形分子却在体液环境中的保留时间十分短，半个小时内在体液中 已经检测不到聚酯的存在，这要归因于其较小的体积。在后续的研究中i h r e 等人 考察了p e g 树形聚酯接枝分子作为药物载体的能力，使用d o x 作为模型药物， 通过三步反应将d o x 通过腙键连接在树形聚酯的表面，取得了较好的实验效果， 发现载体在体内重要器官处没有聚集，表现出良好的生物相容性【3 7 1 。 s z o k a 和f r e c h e t l 3 8 】极富匠心的合成了一种“蝴蝶结 型的树形聚酯，聚酯的 一个树形接枝单元使用可降解的胺酯键和p e g 相连接，而另一个树形接枝单元 使用p h 敏感型的腙键和药物分子相连接。在p h = 7 4 和p h = 5 0 的缓冲溶液中浸 置十五天后，胺酯键首先断裂使体系的分子量大大下降。但是由于空间位阻