（动物学专业论文）基于表面修饰技术构建新型纳米级乙醇生物传感器.pdf

南开大学学位论文版权使用授权书 删t r l l y 1 7 9 8 0 岑。6 。 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：方葫7 叫d 苫年j 月诟日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： 落、镌 学位论文作者签名： 鸯耪i i 解密时间： 伊j 1 年 f 月彤日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密l o 年( 最长l o 年，可少于l o 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含 任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 季谚 训。富年s 月讥e t 厂 摘要 摘要 表面修饰是生物传感器构建过程中的关键步骤，所采用的固定化材料对传 感器性能有重要影响。纳米材料因具有良好的生物相容性、吸附性、导电性等， 在材料学、生物学、医学等领域有广泛的应用前景；层层层累积技术( l b l ) 具有 操作简单、材料可选择、酶量可控、可重复性好、条件温和等特点，已成为最 有前途的纳米膜制备技术之一。将二者分别引入或者同时引入乙醇生物传感器 可在多方面提高其传感性能，基于此制备出三种高性能乙醇生物传感器。聚精 氨酸( p a ) 是具重要生理作用的阳离子聚电解质，对制备微型化的生物传感器具有 重要参考价值，基于此制备出一种新型模式生物传感器。本研究主要结果如下： 1 、以明胶包埋法作为乙醇氧化酶( a o d ) 的固定化方法，在比较三种纳米材 料对传感器影响的基础上，选择加入增效最明显的多壁纳米碳管( m w c n t s ) 提高 灵敏度，在电极表面自组装聚丙烯胺盐酸盐聚磺化乙烯硫酸盐( p a a p v s ) 膜提 高抗干扰性，制备出一种灵敏度高、抗干扰性好的乙醇生物传感器 ( p t - ( p a a p v s ) 2 p a a - m w c n t s a o d ) 。 2 、通过对比三种聚电解质与a o d 层层自组装效果，对比三种基础电极的效 果，分别选出最优聚电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵( p d d a ) 与最优电极铂电极； 并对传感器的其它条件进行了优化。系统研究了1 - 6 层p d d a a o d 复合膜修饰电 极的传感效果，成功制备出响应时间短、相关性好、灵敏度高的乙醇生物传感 器p t - ( p a a p v s ) 3 一( p d d a a o d ) s 。 3 、采用l b l 技术结合m w c n t s 的方法固定a o d 修饰p t 电极制备乙醇生物传 感器，系统研究了m w c n t s 对基于l b l 技术的乙醇生物传感器的影响，成功制备 了一种高性能乙醇生物传感器p t ( p a a p v s ) 3 ( m w c n t s p d d a a o d ) 6 ，该传感 器具有灵敏度高、检测范围宽、检测限低，以及抗干扰性强的优点。 4 、以l b l 为酶固定化方法，以p a 为聚阳离子，以葡萄糖氧化酶( o o d ) 为膜 式酶，成功制备出新型一种模式生物传感器。本研究作为新型酶固定化材料p a 应用于生物传感器的探索性试验，为新型体内传感器的制备提供了参考。 关键词：多壁纳米碳管层层自组装技术生物传感器乙醇氧化酶 a b s t r a c t ab s t r a c t s u r f a c em o d i f i c a t i o nt e c h n i q u ei st h em o s ti m p o r t a n tf o rt h ef a b r i c a t i o n so f b i o s e n s o r s t h em a t e r i a l su t i l i z e de f f e c tt h ep r o p e r t i e so ft h eb i o s e n s o r ss t r o n g l y n a n n o m a t e r i a l sh a v eb e e nu s e di nt h ef i e l do ft h es c i e n c eo fm a t e r i a l s ，b i o l o g y , i a t r o l o g ye t cf o rt h e i rg o o de l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t y , s t r o n ga d s o r p t i v ea b i l i t y , e x c e l l e n t b i o c o n s i s t e n c y l a y e r - b y - l a y e rd e p o s i t i o nt e c h n i q u eh a sb e c o m eo n eo ft h em o s t p r o m i s i n gt e c h n i q u ef o rc o n s t r u c t i n gm u l t i l a y e rf i l m sb e c a u s eo fi t ss i m p l i c i t yi n p r o c e d u r e ，w i d ec h o i c eo fm a t e r i a l s ，c o n t r o l l a b i l i t yo ft h ea m o u n to ft h ee n z y m e ， e x c e l l e n tr e p e a t a b i l i t y , m i l d n e s so ft h ec o n d i t i o n se t c n a n n o m a t e r i a l sa n dt h el b l t e c h n i q u ec a nb ei n t r o d u c e di n t oe t h a n o lb i o s e n s o r ss e p a r a t e l y o ra to n et i m et o i m p r o v et h e i rp r o p e r t i e s ，b a s e do nw h i c ht h r e ek i n d so fn o v a le t h a n o lb i o s e n s o r sw e r e f a b r i c a t e d p o l y ( a r g i n i n e ) ( p a ) i s an e wk i n do fp o l y c a t i o nw i t he x c e l l e n t b i o c o n s i s t e n c y , p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o nt ot h ec h o l e s t e r o lr e d u c t i o n t h e r e f o r e ，p a p o s s e s s e si m p o t a n tr e f e r e n c e dv a l u et ot h em i n i m i z e dg l u c o s eb i o s e n s o r an e w g l u c o s eb i o s e n s o rw a s f a b r i c a t e db a s e do nt h i s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 an o v a le t h a n o lb i o s e n s o ro fp t 一( p a a p v s ) 2p a a - m w c n t s a o dw i t h e n h a n c e d s e n s i b i l i t y , e x c e l l e n ta n t i i n t e r f e n c ep r o p e r t yw a sf a b r i c a t e d i nt h i ss t u d y , p o l y ( a l l y l a m i n e ) p o l y ( p o t a s s i u mv i n y ls u l f a t e ) ( p a a p v s ) m u l t i p l e f i l mw a s s e l f - a s s e m b l e do nt h es u r f a c eo fp te l e c t r o d et oe n h a n c et h ea n t i i n t e r f e r e n c ea b i l i t y g e l a t i n e m b e d d i n gw a su s e dt oi m m o b i l i z et h ea l c o h o lo x i d a s e ( a o d ) m u l t i w a l l e d c a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) w a st h en a n o m a t e r i a ls e l e c t e dt oi m p r o v et h ep r o p e r t y o ft h eb i o s e n s o rf o ri t so u t s t a n d i n gf u n c t i o nc o m p a r e d 谢n 1t w oo t h e rk i n d so f n a n o m a t e r i a l 2 an o v a le t h a n o lb i o s e n s o ro fp t - ( p a a p v s ) 3 一( p d d a a o d ) 5w i t hs h o r t r e s p o n s et i m e ，w i d er a n g eo fl i n e a r i t y , g o o dr e l a t i v i t y a n dh i g hs e n s i b i l i t yw a s f a b r i c a t e db a s e do nl b l t e c h n i q u e i nt h i s i n v e s t i g a t i o n ， p o l y ( d i a l l y d i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ) ( p d d a ) w a ss e l e c t e da st h ep o l y c a t i o nb y c o m p a r a t i o nt h ee f f e c to ft h r e ek i n d so fp o l y c a t i o na s s e m b l e d 、析ma o ds e p a r a t e l y a b s t r a c t n e no t h e rc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d a tl a s t t h eb i o s e n s o r sm o d i f i e dw i t h1 - 6 l a y e r so fp d d a a o dm u l t i p l ef i l m sw e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y , a n dt h eb i o s e n s o r m o d i f i e dw i t h5l a y e r so fp d d a a o dw a sf o u n dt h eb e s to n e 3 i nt h i si n v e s t i g a t i o n , l b lt e c h n i q u ew a su s e da st h ew a yt oi m m o b i l i z et h e a l c o h o lo x i d a s e ( a o d ) ，a n dm w c n t sw a si n t r o d u c e dt o o 1 1 1 eb i o s e n s o r sm o d i f i e d w i t h1 - 7l a y e r so fp d d a a o dm u l t i p l ef i l m sa n dt h eb i o s e n s o r sm o d i f i e d 、析ml 一7 l a y e r so fm w c n t s p d d a a o dm u l t i p l e f i l m sw e r es t u d i e d s y s t e m a t i c a l l ya n d c o n t r a s t i v e l y a t l a s t ， an o v e le t h a n o lb i o s e n s o ro f p t ( p a a p v s ) 3 - ( m w c n t s p d d a a o d ) 6 w a sf a b r i c a t e d s u c c e s s f u l l y , w h i c h p o s s e s s i n gt h ee x c e l l e n tp r o p e r t i e so ft h eb i o s e n s o rb a s e do nl b lt e c h n i q u ea n dt h e b i o s e n s o rb a s e do nm w c n l s 4 i nt h i ss t u d y , l b lt e c h n i q u ew a su s e da st h ew a yt oi m m o b i l i z ee n z y m e p r o t e i n g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) w a su s e da st h em o d e le n z y m e a n dp a w a su s e da s t h ep o l y c a t i o nt oa s s e m b l ew i t hg o dt h r o u g he l e c t r o s t a t i cf o r c eo nt h es u r f a c eo fp t e l e c t r o d em o d i f i e dw i t l lp aa p v sf i l m an e wg l u c o s eb i o s e n s o rw i t hg o o d p r o p e r t i e sw a sf a b r i c a t e d t h i si n v e s t i g a t i o nw a sat r yo ft h eu t i l i z a t i o no fp ao nt h e b i o s e n s o r , a n dp r o v i d e di m p o r t a n t r e f e r e n c ev a l u ef o r t h em i n i m i z e dg l u c o s e b i o s e n s o r k e yw o r d s ：m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e sl a y e r - b y - l a y e rt e c h n i q u eb i o s e n s o r a l c o h o 】o x i d a s e i i i 目录 目录 第一章引言1 第一节生物传感器1 1 1 1 生物传感器概述1 1 1 2 生物传感器的构成、原理2 1 1 3 生物传感器的分类3 1 1 4 生物传感器的发展历程4 1 1 5 生物传感器的应用4 1 1 6 生物传感器的发展趋势及所面临的挑战6 第二节乙醇生物传感器8 1 2 1 乙醇概述8 1 2 2 乙醇传感器的发展现状及原理8 第三节葡萄糖生物传感器1 0 第四节生物催化活性界面构建方法及固定化酶的影响因素1 1 1 4 1 酶的固定化方法1 2 1 4 2 影响固定化酶的因素1 5 第五节本论文的设想及研究内容1 6 1 5 1 本论文的设想1 6 1 5 2 本论文的研究内容1 7 第二章基于纳米材料、聚电解质制备新型乙醇生物传感器1 9 第一节前言1 9 第二节实验部分2 2 2 2 1 仪器与试剂2 2 2 2 2 实验方法2 3 第三节结果与讨论2 4 i v 目录 2 3 1 纳米材料对传感器电流响应的影响2 4 2 3 2 循环伏安法研究电极的电化学性能2 5 2 3 3p h 值对传感器性能的影响2 5 2 3 4 传感器的工作曲线2 6 2 3 5 传感器的抗干扰性2 6 2 3 6 传感器的稳定性2 7 第四节本章小结2 8 第三章基于层层自组装技术构建新型乙醇生物传感器2 9 第一节前言2 9 第二节实验部分3 0 3 2 1 仪器与试剂3 0 3 2 2 实验方法3 1 第三节结果与讨论3 2 3 3 1q 铆检测三种聚阳离子与a o d 组装纳米复合薄膜的效果3 2 3 3 2 相同的酶膜修饰的三种材质电极对乙醇的响应性能3 3 3 3 3 电压对p t - ( p a a p v s ) 。一( p d d a a o d ) s 传感器性能的影响3 4 3 3 4p h 值对p t 一( p 从p v s ) s 一( p d d a a o d ) s 传感器性能的影响3 4 3 3 5 基于多层累积膜的乙醇生物传感器性能的研究3 5 第四节本章小结3 8 第四章层层自组装技术结合多壁纳米碳管制备高性能乙醇生物传感 ! 器4 0 第一节前言4 0 第二节实验部分4 0 4 2 1 仪器与试剂4 1 4 2 2 实验方法4 1 第三节结果与讨论4 3 4 3 1 纳米碳管修饰电极的电化学特征4 3 v 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果6 2 v i 第一章引言 1 1 1 生物传感器概述 第一章引言 第一节生物传感器 生物传感器是在化学传感器基础上发展起来的，是电化学、分析化学和生 物技术研究中最活跃的领域之一，它融生物学、化学、医学、物理学、信息科 学及相关技术于一体，是发展生物技术必不可少的一种先进技术，用于各种生 命物质和化学物质的分析、检测、监控和跟踪。随着各种高新技术的发展，这 种交叉学科在理论上和技术上有着广阔的发展空间，已发展成为一个活跃的研 究领域i lj 。 与传统的分析技术相比较，生物传感器具有以下主要特点【2 卅： ( 1 ) 测定范围广泛。生物反应具有多样性和特异性，所以理论上来说生物体 内各种活性物质及多种化学物质均可通过不同种类的生物传感器来检测。 ( 2 ) 操作简单迅速。生物传感器使用时一般不需要样品的预处理，样品中的 被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需加入其它试剂。 ( 3 ) 准确度和灵敏度高。生物传感器是由具高度选择性的分子识别材料与灵 敏度极高的能量转换器结合而成的，因而它具有很高的准确度和灵敏度，一些 含量极低的生物活性物质或化学物质也能被准确灵敏地检测出来。 ( 4 ) 体积小。随着高科技的发展，生物传感器向微型化发展，易于携带和进 行体内连续在线监测、实现自动分析。 ( 5 ) 专一性强。只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。 ( 6 ) 可进入生物体内，进行实时检测。随着纳米技术的发展，纳米生物传感 器用于监测，收发体内细胞的健康状态和病变信息。 ( 7 ) 成本低，便于推广普及。采用固定化生物材料作敏感元件，昂贵的试剂 可重复使用。传感器连同测定仪器的成本远低于大型分析仪器，有利于推广普 及。 第一章引言 1 1 2 生物传感器的构成、原理 生物传感器是由固定化的生物成份( 酶、抗原、抗体、d n a 、激素等) 或 生物体本身( 细胞、微生物、组织等) 等生物识别元件，物理、化学等信号转 换元件，电子线路及附件构成的分析仪器【5 1 。随着生物工程技术和电子技术的发 展，各类新型生物传感器正在不断涌现，生物传感器的概念也将不断发展。其 基本原理如图1 1 所示：待测物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发 圈 光、电信号 砖 圈圈圈 图1 1 生物传感器的基本结构和工作原理 生生物学反应，敏感元件产生与待测化学量或生物量( 或浓度) 相关的化学或 物理信号( 原始信号) ，产生的信号继而被相应的化学换能器或物理换能器转变 成易于测量的点信号( 次级信号) ，再经二次仪表( 检测放大器) 放大并输出， 便可知道待测物浓度。 1 1 2 1 分子识别元件 分子识别元件( m o l e c u l a rr e c o g n i t i o ne l e m e n t ) 耳l j 生物电极表面的生物敏感膜 ( b i o s e n s i t i v em e m b r a n e ) ，是生物传感器的关键部分，是将酶、核酸、免疫物质、 全细胞、组织或细胞器等生物活性材料通过物理方法( 凝胶溶胶包埋、明胶包 埋) 或化学方法( 戊二醛的交联、聚电解质的吸附) 固定在生物传感器的敏感 膜中，所制备的具生物特异选择性膜状结构。其中，固定化的目的是将酶等生 物敏感元件限制在一定的空间，但又不妨碍待测物的自由扩散。与游离相生物 2 第一章引言 材料相比，固定相生物材料具有一系列优点：1 、与普通检测中直接将生物活性 材料混入溶液中检测相比，每次用量减少，固定化的生物活性材料可以多次重 复利用，生物活性材料的使用量大幅度减小；2 、热稳定性提高；3 、反应后不 需分离催化物与待测物；4 、可以根据已知的半衰期确定传感器膜的寿命等睁引。 1 1 2 2 信号转换元件 信号转换元件的主要作用是将所捕获到的各种生物、化学或物理信号转变 成电信号，并通过电信号将待测物信息或者待测物与敏感膜中的生物活性物质 间相互作用过程描述出来。信号转换器主要有：电化学器件，如h 2 0 2 、p h 等电 极及半导体离子敏场效应管i s f e t 等；光学器件，如光纤传感器、光敏二极管、 表面等离子体谐振器件等；压电声波器件：如声表面( s a w ) 器件、石英晶体( q c m ) 器件等；热敏器件：如热敏电阻等。最常使用的信号转换器是电化学传感器。 1 1 3 生物传感器的分类 生物传感器主要有两种分类方式。 生物传感器的类型方法较多且不尽统一，主要有以下分类法，其中依据分 子识别元件分类和信号转换器分类【6 】是最常见的分类方法。 ( 1 ) 根据分子识别元件分类，生物传感器可分为酶传感器、d n a 传感器、 细胞传感器、免疫传感器、微生物传感器、组织传感器。生物学工作者习惯于 采用这种分类方法。本论文主要研究的是酶传感器。 酶传感器是将酶作为生物敏感膜的活性材料固定于电化学电极表面，利用 酶对底物选择性高效催化原理，收集生物学反应信息并将底物信息转化为可测 量和记录的电信号。1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 3 j 提出了电化学葡萄糖生物传感器的 原理。1 9 6 7 年，u p d i k e 等1 6 j 成功制备了第一个电化学葡萄糖生物传感器。自此， 基于酶电极的电化学生物传感器研究得到了迅速发展，目前已经是神经毒剂测 定和报警的主要手段【9 】。四十年以来，酶一直是首选的生物活性物质，这是因为 酶具有多项优异特性：选择性好、能选择性地快速辨别特定的底物；能在温和 的条件下对待测物催化；基于酶的高效催化特性，酶传感器具有灵敏度高的特 点，便于信号采集和分析。基础电极主要有：金属电极( 铂、钯、金等) 、碳糊 电极、氧电极、氢电极、p h 电极等。自然界中已获鉴定的酶有2 5 0 0 多种【1 ，但 大多数酶的制备和纯化困难，加之固定化技术对酶活性影响很大，极大地限制 3 第一章引言 了酶传感器的研究和应用。目前国际上已经研制成功的酶传感器有几十种，如 葡萄糖1 、乙醇1 2 1 、乳酸13 1 、胆碱1 4 1 、胆固醇15 1 、氨基酸1 6 1 和尿酸等生物传 感器。 ( 2 ) 根据生物传感器的信号转换器分类。生物传感器分为电化学生物传感器、 半导体生物传感器、热生物传感器、声波生物传感器、光生物传感器、压电晶 体生物传感器【18 1 、阻抗生物传感器。电子工程学工作者习惯于采用这种分类方 法。本研究主要研究的是电化学生物传感器。 ( 3 ) 根据生物传感器尺寸大小分类。生物传感器可分为：微型生物传感器 ( m i c r ob i o s e n s o r ) 、纳米生物传感器( n a n ob i o s e n s o r ) 等。小尺寸生物传感器在活体 检测、体内检测、实时检测等方面有重要作用。 ( 4 ) 根据分子识别元件与待测物结合的性质，可分为催化性生物传感器和亲 和型生物传感器。 当然，上述分类方法之间可以互相交叉。 1 1 4 生物传感器的发展历程 到目前为止，生物传感器的发展大致划分为三个不同的阶段。 第一阶段在2 0 世纪6 0 7 0 年代，为起步阶段，以c l a r k 传统酶电极为代表。 1 9 6 2 年，美国lc c l a r k 教授采用硅橡胶膜等合成膜制备了隔离式氧电卡及【引，从 而将电极过程( e l e c t r o d ep r o c e s s ) 与主体溶液( b u l ks o l u t i o n ) 隔离，大大避免了外部 物质对开放式原电池型氧电极的干扰，并创造了酶电极( e n z y m ee l e c t r o d e ) 的术 语。第二阶段在2 0 世纪7 0 年代末到8 0 年代，大量的学科交叉研究促成各种不 同原理和技术的生物传感器的出现，尤其8 0 年代中期是生物传感器发展的第一 个高潮期，其代表之一是介体酶电极【1 1 ，它不仅开辟了酶电子学的新研究方向， 还为酶传感器的商品化奠定了重要基础。1 9 8 7 年美国m e d i s e n e 公司根据a e g c a s s 1 9 】等采用介体酶电极制备方法成功开发印刷酶电极，1 9 9 6 年达1 7 5 亿美元。 第三阶段发生在2 0 世纪9 0 年代以后，其发展具有两个特点：一是生物传感器 的市场开发获得显著成绩；二是生物亲和传感器的技术突破。以表面等离子体 共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 和生物芯片( b i o c h i p ) 1 2 m 2 l j 为代表，成为生物 传感器发展的又一个高潮。 1 1 5 生物传感器的应用 4 第一章引言 生物传感器作为一种新型快速、准确、实时的检测手段，被广泛应用于多 种领域，如图1 2 所示： 秽一凳 i 生物医学领域二 环境检测领域食品工业领域 擎 ： 医药生产领域，妻 ，军事领域 ”。渤 图1 2 生物传感器的应用 1 1 5 1 生物医学领域 生物传感器在生物医学中应用广泛，可检测体液中的微量蛋白( 如特异性 抗体、神经递质) ，小分子有机物( 如葡萄糖、乳酸及各种药物) ，核酸( 如 病原微生物、异常基因) 等多种物质。在现代医学检验中，这些项目是临床诊 断和病情分析的重要依据【2 2 】。体内实时监控的生物传感器对于手术中和重症监 护的病人有很大帮助。生物传感器也被应用于生理学的研究，例如，将微电极 用作电化学探针，可检测动物脑神经递质的扩散过程；利用微米级超微电极可 在细胞水平上对药物的代谢状况进行检测。 1 1 5 2 环境监测领域 生物传感器为环境监测的连续化和自动化提供了可能，而且能有效降低环 境监测的成本。目前，应用于环境监测领域的生物传感器总体可分为两类 2 3 1 ： 一类是酶传感器，利用一些污染物对酶活性的催化作用( 如酚类对酪氨酸酶) 、 特异性抑制作用( 如有机磷酸脂类对乙酰胆碱酯酶) 或调节作用( 如m n 2 + 对辣 根过氧化物酶) 等，通过检测酶反应所产生的信号即可间接测定污染物含量。 另一类是微生物传感器，利用活微生物的代谢功能检测污染物含量，如利用丝 孢酵母或芽孢杆菌制备用于监测水质有机污染情况的b o d 生物传感器、利用硝 化菌制备用于检测大气及废水中氨含量的氨传感器、利用甲基单胞鞭毛虫制备 5 第一章引言 用于检测大气中甲烷含量的甲烷传感器等。 1 1 5 3 食品工业领域 在食品和医药工业中，为保证产品质量，必须实现生产过程的自动监控。 例如，为确保发酵生产的啤酒的质量，必须对乙醇进行在线监测。有些微生物 可通过消耗氧把乙醇分解成二氧化碳和水，若将这些微生物固定在氧电极上， 通过测量氧的消耗便可以确定乙醇的浓度，实现对乙醇的在线监测 2 4 】。又如， 在鱼的加工处理中，三磷酸腺苷( a t p ) 只存在于活细胞内，因此a t p 可作为鱼鲜 度的衡量标准。利用黄嘌呤氧化酶作为敏感元件，结合h 2 0 2 电极制成生物传感 器【2 5 j ，可测定鱼体内的磷酸肌苷、肌苷和次黄嘌呤的浓度，从而评价鱼的鲜度。 1 1 5 4 医药生产领域 在医药生产特别是新药开发中，需要对药物进行分析。应用于药物分析的 生物传感器的典型代表是表面等离子共振( s p r ) 器。这是一种表面膜共振分析， 是实时测定生物分子结合的技术。以抗原抗体结合分析为例【2 6 】，将抗原( 或抗 体) 通过表面化学方法固定在芯片的金箔表面，然后让抗体( 或抗原) 流过， 抗原抗体的结合将改变膜表面液体性状，从而影响金箔共振性质，这一改变可 被实时监测并记录下来，根据改变量的多少就可以知道抗原与抗体的结合量。 1 1 5 5 军事上的应用 现代战争往往是在核武器、化学武器、生物武器威胁下进行的战争。侦检、 鉴定和检测是整个“三防”医学中的重要环节，是进行有效化学战和生物战防护的 前提。由于具有高度特异性、灵敏性和能快速地探测化学战剂和生物战剂( 包 括病毒、细菌和毒素等) 的特性，生物传感器将是最重要的一类化学战剂和生 物战剂侦检器材。近年来，美国陆军医学研究和发展部研制的酶免疫生物传感 器具有初步鉴定多达2 2 种不同生物战剂的能力。美国海军研究出d n a 探针生 物传感器，在海湾沙漠风暴作战中用于检测生物战剂。 1 1 6 生物传感器的发展趋势及所面l 临的挑战 1 1 。6 1 生物传感器的发展趋势 生物传感器涉及的学科领域和技术方法非常多，难以对其发展趋势有一个 6 第一章引言 清晰的概括。以下概括大致反映生物传感器的发展趋势。 ( 1 ) 功能更加全面，并向微型化发展 未来的生物传感器将进一步涉及医疗保健( 如临床疾病诊断、药物筛选、 检疫、药物体内的控释、体内生理状态的实时监测等) 、食品检测、环境监测、 发酵工业的各个领域。当前生物传感器研究中的重要内容之一就是研究能代替 生物视觉、听觉和触觉等感觉器官的生物传感器，即仿生传感器。而且随着微 加工技术和纳米技术的进步，生物传感器将不断地向微型化、便携式方向发展， 以满足体内测定、细胞内测定、单分子分析、在线测定的需求。 ( 2 ) 智能化程度更高 未来生物传感器将会和计算机更紧密地结合，能够自动采集和处理数据， 可以更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、最终形成检测的自动化系 统。同时，芯片技术将越来越多地进入传感器领域，实现检测系统的集成化、 一体化。 ( 3 ) 更加灵敏、准确、快速，操作简单，寿命长，价格低，易于批量生产是 分析科学技术发展趋势的共同特征。为了使生物传感器获得全面最佳的特性。 新的物理换能技术、化学换能技术和新的生物元件会不断引入，并在它们之间 进行集成，使高通量、多参数的同步测定成为可能。 随着交叉学科的发展，以及基因技术、纳米技术、各种单分子荧光技术、 仿生技术或生物模拟技术和新技术原理的发展，生物传感器这个渗透多学科和 技术的交叉领域，具有广阔的发展空间，也必将在未来发挥更大的作用。 1 1 6 2 生物传感器的发展面临的挑战 生物传感技术与化学及物理传感器相比，在多数情况下，生物传感器的稳 定性仍很差，常常需要精心地护理和频繁的标定，制备的成本也比较高，这些 缺陷均归因于生物传感器研究者们是在与“活”的物质打交道，不确定因素非常 多，因此更具有挑战性。而一些具有挑战性的需求( 体内测定、细胞内测定、 单分子分析、在线测定等) 要求研究者不断采用新的技术原理，如基因技术、 纳米技术、各种单分子荧光技术、仿生技术或生物模拟技术等。但对电极来说， 当其尺寸减d n 纳米级时，弱信号检测的问题也更加突出，给微型化发展提出 了新的挑战。生物传感器的体内化实时、长期在线检测要求固定化酶保持长期 稳定性，对酶固定化方法和固定化材料的生物相容性提出了更高水平的要求。 7 第一章引言 另外，适应于多种物质的检测，发展多类型高性能生物传感器成为生物传感器 发展中的又一个新的挑战。 1 2 1乙醇概述 第二节乙醇生物传感器 乙醇是一种无色透明、易挥发、有特殊香味、易燃烧的液体。乙醇分子式 为c 2 h 5 0 h ，分子结构如图1 3 。能与水、甲醇、乙醚和氯仿等以任何比混溶。 乙醇在工业、农业、医药、食品、临床等方面用途非常广泛。尤其是随着社会 的发展，生活水平的提高，饮品大量出现，软饮料及儿童饮品快速普及。但乙 醇是把双刃剑，除具有重要作用之外，还具有危害性，主要表现为：抑制中 枢神经系统 2 r l ，人饮酒后，乙醇很快通过胃和小肠的毛细血管进入血液，饮酒 者血液中乙醇的浓度( b l o o da l c o h o lc o n c e n t r a t i o n ，b a c ) 在3 0 , - 一4 5 m i n 内将达到最 大值。正常人血乙醇含量0 0 0 3 ，致死极限为o 7 ，当b a c 超过o 1 时1 2 引， 将引起明显的乙醇中毒，导致兴奋、催眠、麻醉或窒息，甚至死亡。长期酗 洒可引起多发性神经病、慢性胃炎、脂肪肝、肝硬化、心肌损害及器质性精神 病等。乙醇饮料的大量饮用引起的重大事故已经引起了人们的高度重视。由 此可见，无论是对于工、农业的发展，还是对于人类健康，乙醇浓度快速准确 的检测都非常重要。已报道的乙醇检测方法有多种，如液相色谱( h p l c ) 2 9 1 、气 相色谱( g c ) 3 0 】、偶联酶法【3 1 1 、分光光度法【3 2 1 、比色法【3 3 1 等，但这些传统方法具 有成本高、速度慢、专一性不强、程序繁琐、需要专业人员完成等缺点。而生 物传感器具有简便、快速、精确等优点，可以弥补其不足。鉴于传统检测方法 的缺点与传感器的优点，制备高性能乙醇生物传感器来检测乙醇非常必要。 1 2 2 乙醇生物传感器的发展现状及原理 从乙醇传感器的研究现状看，国内主要研究电子或化学传感器【3 4 - 3 9 ，生物 传感器较少，导致专一性不好、抗干扰性差；国外主要是生物传感器研究，其 性能相对较好，但国外主要集中在多重检测方面h 0 4 6 1 ，而单一的乙醇检测性能 不够好。目前来看，制备乙醇生物传感器所用材料主要为二茂铁、聚乙烯等传 8 第一章引言 统材料【4 0 ，4 2 , 4 3 1 ，没有新型生物传感器纳米增效材料的研究；所用方法主要为包 埋法、共价交联法等比较原始的酶固定化方法，没有关于具有多种优点的静电 层层自组装法制备乙醇生物传感器的报道。所制备的生物传感器具有响应慢、 线性范围窄、制备复杂、酶固定量不可控等缺点。由此可见，采取新材料、新 方法制备高性能乙醇生物传感器非常重要。 制备乙醇生物传感器所用生物活性材料有乙醇脱氢酶h7 ，4 引、乙醇氧化酶 ( a l c o h o lo x i d a s e ，a o d ) 4 9 , 5 0 、微生物细膨5 1 1 。但乙醇脱氢酶要求介体烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸( n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，n a d + ) 存在，导致电极制各难度 加大和分析费用提高；微生物细胞传感器响应时间较长、稳定性不好。本研究 选择a o d 为活性材料，制备乙醇生物传感器。a o d 主要有三个来源：p i c h i a p a s t o r 西，h a n s e n u l a p o l y m o r p h a ，c a n d i d ab o i d i n i i 。a o d 由八个完全相同的亚基 呈立方体状结构排列而成( 图1 4 ) ，每个亚基的分子量大概为7 4 k d ，且每个亚基 均有一个黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 作为辅酶与其相连 5 2 , 5 3 。辅酶实际上起到电 子和质子中间体的作用，即辅酶f a d 通过它的氧化态和还原态的不断循环而实 现其功能。a o d 的等电点为4 3 ，在p h6 0 , - - 9 0 范围内较为稳定1 5 训。 盆 乙 注 如 图1 3 乙醇分子的化学结构图1 4 乙醇氧化酶分子结构模式图 a o d 对小分子醇类具有特异的催化氧化作用，对乙醇具有高效催化作用。 a o d 催化氧化乙醇产生乙醛和过氧化氢【55 | ，是这类氧化酶典型的两步酶反应过 程。这个过程包括酶引起的乙醇氧化，f a d 还原成f a d h 2 ( 反应1 1 ) ，然后辅酶 被分子氧氧化( 生物催化剂的再生) 并产生过氧化氢( 反应1 2 ) ： c h 3 c h 2 0 h + a o d ( f a d ) c h 3 c h o + a o d ( f a d h 2 ) ( 1 1 ) a o d ( f a d h 2 ) + 0 2 _ a o d ( f a d ) + h 2 0 2 ( 1 2 ) 在上面的反应式中，a o d ( f a d ) 是a o d 的氧化态，a o d ( f a d h 2 ) 是a o d 的 9 第一章引言 还原态。总反应通常表示为： c h 3 c h 2 0 h + 0 2 + h 2 0 竺c h 3 c h o + h 2 0 2 ( 1 3 ) n 2 0 2 _ 二竺- - 0 2 + 2 i 十 ( 1 4 ) 根据反应1 4 ，h 2 0 2 在电位为+ o 6 至+ 0 8 v ( v s a g a g c l ) 下通过氧化电化学 反应产生电子，当产生的电子转移到电极表面即产生电流，据电流的大小来测 定乙醇的含量。因此只要将a o d 固定在电极表面即可构成测定乙醇的生物传感 器。 第三节葡萄糖生物传感器 糖尿病是世界性多发病和常见病，它严重地威胁着人类的健康，是仅次于 心血管病和癌症的第三大危险疾病。因此糖尿病的诊断和治疗是全世界生物医 学工程界面临的重大课题。未来生物传感器的发展是向小型化体内型发展，因 此为了提高传感器生物相容性，寻找新材料、新方法制备电流响应值高、抗干 扰性好的新型葡萄糖生物传感器是非常必要的。利用生物传感器检测葡萄糖所 用到的酶主要是葡萄糖氧化酶( g o d ) ，g o d 对p d 葡萄糖具有高度专一的催化 氧化作用。g o d ( 图1 5 ) 分子量为1 5 0 至1 8 6