（海洋生物学专业论文）单环刺螠多肽的分离纯化及生物活性研究.pdf

单环刺蛀i 多肽的分离纯化及生物活性研究 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 摘要 海洋生物处于高压、高盐、低温、寡营养等环境特点，为了适应这些极端的 海洋生境，生物自身的功能分子组成或结构都与陆地功能分子有很大的不同。目 前从海洋生物中分离出的多肽类化合物大多具有抗肿瘤、抗病毒及增强免疫力等 生物活性，从海洋生物中分离多肽类化合物进行生物活性研究已经引起科研人员 的广泛关注。本实验根据以上研究背景，选取单环刺蜢体腔液进行多肽的分离纯 化，并对分离出的多肽进行性质研究。 利用分级超滤技术收集单环刺蜢体腔液中分子量小于8 0 0 0 d 的物质组分， 经凝胶过滤层析及离子交换层析分离出多肽纯品，通过s d s p a g e 电泳测定多肽 的分子量在6 0 0 0 d 左右，多肽的收率为3 1 7 。 通过体外实验的方法研究单环刺蜢多肽对各种肿瘤细胞的生长的影响及对 正常肝细胞生长的影响。以人肝癌细胞、h e l a 细胞及s 1 8 0 肉瘤细胞为研究对象， 通过m t t 法测定该多肽对这三种肿瘤细胞生长的影响。结果表明，单环刺蜢多 肽对以上三种肿瘤细胞均有一定抑制生长的作用，但对肝癌细胞生长的抑制作用 比较明显，当多肽浓度为5 0 0 p g m l 时，抑制率接近8 0 ，其他两种分别为3 7 5 、1 9 8 。在抑制肿瘤细胞生长的浓度范围内检测该多肽对正常肝细胞生长的 影响，证明该多肽对正常肝细胞没有明显的毒副作用。 通过体内灌胃方法研究单环刺蜢多肽对小鼠s 1 8 0 肉瘤模型肿瘤生长的影响。 结果表明该多肽对肿瘤有定的抑制作用，当多肽剂量为7 5 0 m g k gb w 时，抑制 率可达3 1 9 ，与对照组相比，存在显着性差异( k 0 0 5 ) ，但是效果仍没有阳性 对照组( 环磷酰胺组) 明显。 通过体内实验方法研究该多肽对免疫功能的影响。以昆明种小鼠为研究对 象，将实验动物进行分组，实验组每天分别灌服不同剂量的多肽溶液( 2 5 0 、5 0 0 、 7 5 0 m g k gb w ) ，连续2 0 天，对各项免疫指标进行测定，主要包括对单核巨噬细 胞吞噬功能( 碳粒廓清法) 、腹腔巨噬细胞增殖能力、吞噬中性红能力、分泌细 胞因子功能( i l 1 ) 的影响，以及对小鼠免疫器官指数( 脾脏指数和胸腺指数) 的影响。实验结果表明，单环刺蜢多肽在体内促进免疫功能效果显著。给小鼠灌 单环刺缢多肽的分离纯化及生物活性研究 服不同剂量的多肽，均可提高小鼠体内单核巨噬细胞的碳廓清指数，有增强腹腔 巨噬细胞吞噬中性红能力和分泌细胞因子功能的作用，并且能够提高小鼠的脾脏 和胸腺指数。随着多肽剂量的增加，各项指标均有一定的提高， 7 5 0 m g k gb w 给药剂量组与对照组比较，各项免疫指标均有显著性差异( 脚0 5 ) 。从上述各 项指标表明该多肽能够提高小鼠的非特异性免疫功能，并促进细胞免疫功能。 本实验结果表明，单环刺蜢多肽对肿瘤细胞有一定的抑制作用，对细胞免疫 和非特异性免疫功能均有明显的促进作用，能够显著增强小鼠的免疫功能，为进 一步研究其生理功能提供理论基础。 关键词：单环刺蝣多肽；层析；肿瘤细胞；细胞免疫；非特异性免疫 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 一 ，_ 一 一 r e s e ar c h0 1 3p u ritic a tio na n dc h a r a c r e ris tic so t p o iy p e p tid e s1 - r o mu r e c h i sl i n i c ，n c t u s 严 a b s t r a c t 1 1 1 em a r i n eh a ss p e c i a lc h a r a c t e r so fh i g hs a l t ，h i g hp r e s s u r e ，l o wt e m p e r a t u r ea n d l i t t l en u t r i t i o n b e c a u s eo ft h ed i f f e r e n tc i r c u m s t a n c e s ，t h ea c i da n dp r o t e i ni nh a l o b i o s a r ed i f f e r e n tf r o mt h o s ei nl a n dl i v i n ga n i m a l s s of a rm o s tp o l y p e p t i d e sp u r i f i e df r o m h a l o b i o sh a v ea r i s e ne x t e n s i v ea t t e n t i o no fr e s e a r c h e r s ，w h i c hh a v et h ea b i l i t yo f a n t i t u m o ra n da n t i g e r m b a s e do nt h er e s u l t sa b o v e ，ak i n do fp o l y p e p t i d e sf r o mt h e h a e m o c o e l o m i ef l u i do fu r e c h i su n i c i n c t u si s p u r i f i e d a n di t s b i o a c i t i v i t y i s e x a m i n e d 硼1 ec r u d ep o l y p e p t i d e si s p u r i f i e dt h r o u g h f i l t r a t i o na n d s e p h a d e xg - 2 5 ， s e p h a c r y ls 一10 0 ，c m - s e p h a d e xg e lc h r o m a t o 脚h y b ym e a n so fs d s - p a g e ，i ti s f o u n dt h a tt h ep o l y p e p t i d e sm o l e c u l a rw e i g h ti sa m o n g6 k d ，a n dt h er e c o v e rr a t eo f p r o t e i nw a s3 1 7 t h ea n t i t t l m o r o u sa c t i v i t ya n dt h ei n f l u e n c ei nn o r m a lc e l l sa r ee x a m i n e dt h r o u g h c e l lc u l t u r a t i o ni nv i t r o t h ev i a b i l i t yi se x a m i n e dw i t l lm t ta s s a y i nc o n c l u s i o n , i ti s f o u n dt h a tt h ep o l y p e p t i d e sh a st h ea b i l i t yo fa n t i t u m o rt oh e p a t o m a , h e l aa n ds 1 9 0 t u m o rc e l l ，a n di th a st h em o s td i s t i n c te f f e c to nh e p a t o m a , i n h i b i t o r yr a t eo fw h i c h c o m e st o8 0 w h e np o l y p e p t i d e sc o n c e n t r a t i o ni s5 0 0 g 蹦，w h i l et h ei n h i b i t o r yr a t e t oh e l aa n ds 1 8 0 t u m o rc e l lw i t ht h es a m ec o n c e n t r a t i o na r e3 7 5 a n d1 9 8 硼1 e e f f e c t i o nt on o r m a ll i v e rc e l li sa l s oe x a m i n e du s i n gt h es a m em e t h o d ，a n di ti s i n d i c a t e dt h a tt h ep o l y p e p t i d e sp u r i f i e df r o mu r e c h i su n i c i n c t u sh a sl i t t l ee f f e c t i o nt o n o r m a ll i v e rc e l l t h ep e p t i d e si si ga d m i n i s t e r e dt os a r c o m a18 0m i c e ，t h ei n h i b i t o r yr a t ei s c a l c u l a t e d f r o mt h ec o n c l u s i o n ，i ti si n d i c a t e dt h ep o l y p e p t i d e sc o u l di n h i b i tt u n l o r g r o w t h ，a n dw i t hi n c r e a s eo ft h ec o n c e n t r a t i o n ，t h ei n h i b i t o r yr a t es t r e n g t h e n s w h e n t h ed o s a g ei s7 5 0 m g k g ，i n h i t o r yr a t ec o u l d r e a c h31 9 ，w h i c hh a sd i s t i n c td i f f e r e n c e w i t hc o m p a r i s o n 强ep o l y p e p t i d e si sa l s oi ga d m i n i s t e r e dt ok mm i c ew h i c hi su s e dt oe x a m i n et h e i i i 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 e f f e c to nm i c ei m m u n es y s t e mi nv i v o d i f f e r e n t g r o u p s a r eg i v e nd i v e r s e p o l y p e p t i d e sd o s a g e s 2 0d a y sl a t e r , m a i ni m m u n i t yi n d e x e sa r ec a l c u l a t e d t h ed a t a s h o wt h a tt h ep o l y p e p t i d e sh a ss i g n i f i c a n te f f e c to ni m m u n ef u n c t i o ni nv i v o t h e e x p e r i m e n a lm o u s ea d m i n i s t r a t e dp e p t i d e sa td i f f e r e n td o s e sc o u l di n c r e a s ec l e a r a n c e r a t eo fc a r b o np a r t i c l e s ，p r o m o t et h ea b i l i t yo fp m op h a g o c y t o s i sa sw e l la si l 一1 m u l t i p l i c a t i o nf r o mp m o ，e n h a n c et h ew e i g h ti n d e xo ft h y m u sa n ds p l e e n ，a n d i n c r e a s et h em u l t i p l i c a b l ea b i l i t yo fs p l e e nl y m p h o c y t e t h e i n c r e a s i n ge f f e c to f p o l y p e p t i d e si sd o s e i n d e p e n t l yi nt h i ss t u d ya n dt h eb e s te f f e c ti ss h o w na t7 5 0 m e g k gb w ( p 3 0 0 n g m l _ 1 ) 对细胞有直接杀灭作用，对处于平顶期细胞亦有作用( r i n e h a r t k le ta 1 ，1 9 8 1 ，李青选等，1 9 8 9 ) 。 1 3e t - 7 4 3 e t - 7 4 3 ( e c t e i n a s c i d i n 7 4 3 ) 是由被囊类动物e c t e i n a s c i d i at u r b i n a t a 中分得的1 个结构复杂、具有很强抗肿瘤活性的海洋药物，通过与d n a 结合后抑制肿瘤 d n a 转录，同时也能抑制多药耐药基因( m d r - 1 ) 活性，可诱发肿瘤细胞死亡，其 作用呈剂量依赖方式。g a j a t e 等研究发现e t - 7 4 3 能够在高浓度时引起肿瘤细胞 死亡，在低浓度时可以影响肿瘤细胞周期。e t - 7 4 3 可通过两种不同的信号途径， 即转录依赖的细胞周期停止作用和转录独立的通过j n k ( c 。j u na m i n o - t e r m i n a l l d n a s e ) 、线粒体和c a s p a s e 3 促进细胞凋亡( g a j a t e ，2 0 0 2 ) 。其剂量依赖性地促进 癌细胞凋亡，是种非常有效的抗癌药物，主要应用于软组织肉瘤的治疗。目前 e t - 7 4 3 处于治疗软组织肉瘤的i 期试验，此前在i 期和1 i 期试验中e t - 7 4 3 已用 于1 2 0 0 例患者。在治疗软组织肉瘤的i i 期试验中，单用e t - 7 4 3 后，经标准治疗 但无效的患者中，大于5 0 的人存活期为1 年。此外，目前该药还处于治疗乳腺 癌、直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌、黑色素瘤、骨肉瘤和间皮瘤 的i i 期试验，该药在所有研究中均显示有良好的安全性。 单环刺蟠多肽的分离纯化及生物活性研究 1 4 刺参酸性粘多糖 刺参酸性粘多糖为从海洋动物刺参体壁提取的一种具有抗肿瘤、抗凝活性的 成分。实验表明，小鼠经腹腔或静脉注射海参提出物对转移性肿瘤有显著的抑制 作用，特别是对m a 7 3 7 乳腺癌的功效可达8 8 ，对小鼠肉瘤s l g o 的抑制率为 5 5 * , - 6 1 ，对小鼠淋巴肉瘤1 号和小鼠肉瘤s 3 7 的抑制率达6 6 ，并可抑制肺 癌转移和抑制肿瘤细胞生长( 樊绘曾等，1 9 8 0 ) 。王振立等通过3 h - t d r 掺入实验 研究发现刺参酸性粘多糖可明显抑制s l 及鼠乳腺肿瘤细胞d n a 的合成，从而 抑制肿瘤生长，而对荷瘤小鼠正常肝细胞的d n a 合成则能明显促进，这有利于 正常肝细胞的增殖( 王振立等，1 9 9 3 ) 。 胡人杰等对刺参酸性粘多糖与泼尼松联合应用对小鼠实体瘤的抑制作用进 行了研究，结果表明刺参酸性粘多糖不仅可以恢复泼尼松所致的免疫抑制，而且 对小鼠实体瘤、肺癌及胃纤维肉瘤有较好的抑制作用，抑瘤率为2 7 * 旷8 2 ( 胡人 杰等，1 9 9 7 ) 。 1 5 海星皂苷 海星皂苷为从海星纲动物中分离得的甾体皂苷，一般具有抗癌、抗菌、抗炎 等作用。王兵等采用体外肿瘤细胞培养和体内抗肿瘤实验方法，对海星皂苷的体 外和体内抗肿瘤作用进行了研究。结果表明海星皂苷对体外培养的小鼠移植性肿 瘤包括肉瘤s 1 8 0 、肝癌1 - 1 2 2 细胞有直接的细胞毒作用，能明显抑制小鼠移植性肉 瘤s 1 8 0 的生长，延长肝癌h 2 2 腹水小鼠的生存时间，提示海星皂苷具有明显的 抗肿瘤活性，对肿瘤的治疗具有重要的意义( 王兵等，2 0 0 1 ) 。 1 6 海兔毒素 海兔毒素( d o l a s t a t i n l 0 ) 从海兔( d o l a b e l l aa u d c u l r i a ) q 分离的抗癌活性肽， 能有效抑制微管聚合，主要用于小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌等实体瘤的治疗。 在体外对多种白血病细胞均有显著的抑制作用，对p 3 8 8 淋巴白血病小鼠可延长 存活期8 8 ，对黑色素瘤和肉瘤也有同样的活性作用。该多肽于1 9 9 5 年1 1 月由 美国国家癌症研究所进行i 期临床实验，结果d o l a s t m n l o 显示非常好的治疗效 果：6 5 肛g k 9 1 该物质对p 3 8 8 和l 1 2 1 0 肿瘤细胞的肿瘤增殖速率t c 分别为1 5 5 和1 3 5 ；1 1 1 烬k g j 对b 1 6 黑色素瘤的t c 为2 3 8 ，4 0 的患者达到治愈； 单环刺虫益多肽的分离纯化及生物活性研究 2 6 9 9 k g 以对l o x 人黑色素瘤的t c 为3 0 1 ，6 7 的患者治愈；1 3 9 9 k g 以对m 5 0 7 6 子宫肌瘤的t c 为1 6 6 ；4 0 p g k g 。对人子宫肌瘤的o v c a r - 3 的t c 为 3 0 0 ( k a l e m k e r i a n ，1 9 9 9 ) 。 1 7 海力特 海力特是一种海洋中成药，主要成份为昆布、麒麟菜的提取物，具有广泛的 生物活性。朱媛媛等对海力特的抗肿瘤作用进行了研究，结果表明海力特对小鼠 s 1 8 0 实体瘤及小鼠肝癌h 2 2 均有明显的抑制作用，同时可促进t 、b 淋巴细胞， 巨噬细胞和n k 细胞活性，增强脾脏t 淋巴细胞产生i l 2 的能力，对小鼠体液 免疫和细胞免疫功能均有显着增强作用。海力特的抗肿瘤作用可能与其增强机体 免疫功能，促进细胞因子释放有关( 朱媛媛等，2 0 0 3 ) 。 1 8 羊栖菜多糖 羊栖菜多糖 s a r g a s s u mf u s i f o r m e ( h 帆) p o l y s a c c h a r i d e 为羊栖菜( s a r g a s s u m f u s i f o 胱s e t c h ) 水提物的主要有效成份，季宇彬等采用四甲基偶氮唑盐( m 玛比 色法和集落形成实验法对羊栖菜多糖的体外抗肿瘤作用及作用机制进行了研究， 结果表明羊栖菜多糖对人胃癌细胞和人直肠癌细胞有较好的疗效，可阻滞人胃癌 细胞由o g g l 期进入s 期，升高细胞凋亡指数，这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋 亡达到的，而羊栖菜多糖诱导肿瘤细胞凋亡又是通过升高肿瘤细胞内钙离子的浓 度达到的，且升高时的钙离子来源于细胞内钙库释放( 季宇彬等，2 0 0 3 ) 。 1 9 阿糖胞苷( d a r a b i n o s y l c y t o s i n e ，a r a - c ) 目前很少有海洋抗肿瘤活性物质进入期临床试验，与海洋生物代谢产物相关 的合成化合物阿糖胞苷已开发成抗肿瘤药品，应用于临床。它是以海绵 ( c r y p t o t e t h y ac r y p t a ) 分离得到的海绵尿苷s p o n g o u r i d i n e 和海绵胞苷 s p o n g o t h y m i d i n e 为模型化合物改造合成得到的，是s p o n g o t h y m i d i n e 中的核糖被 阿拉伯糖取代后的衍生物。药理实验表明，它是肉瘤s 1 8 0 、小鼠l 1 2 1 0 白血病的 强抑制物( c o c h e ns se ta 1 ，1 9 7 7 ) 。目前，阿糖胞苷已成为临床治疗白血病的主 要药物。 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 1 1 0 血管形成抑制因子 1 9 9 8 年s h e n 等报道，从鲨鱼软骨中获得一种血管生成抑制因子( u 9 9 5 ) ，由 相对分子质量分别为1 0 0 0 0 d 和1 4 0 0 0 d 的两条多肽组成，能抑制体内、外血管 生成和小鼠肿瘤的生长。从我国东海鲸鲨软骨中制备获得一种新的血管生成抑制 因子s c a i fi 相对分子质量为1 8 0 0 0 d ，对原代培养的血管内皮细胞生长繁殖与 运动迁移有明显抑制效应。动物实验表明它显著抑制c 5 7 b l 6 小鼠l e w i s 肺癌 的生长。目前统计有2 4 种以上血管抑制因子进入临床i 、和期试验，国内 已有“沙克一号 产品进行临床试验。 1 1 1 苔藓虫素( b r y o s t a t i n1 ) 苔藓虫素是p e t t i t 小组于1 9 8 2 年从草苔虫( b u g u l a n e r i t i n a ) q b 分离发现的抗肿 瘤活性成分，属大环丙酯化合物( p e t t i tgr ，1 9 8 4 ) 。从草苔虫b u g u l a n e r i t i n a 中分 离的苔藓虫素b r y o s t a t i n1 为特殊抗肿瘤药物，对白血病人血液中分离的急性白 血病细胞、慢性淋巴细胞及h l 6 0 自血病均有明显的诱导分化作用并抑制生长 作用，目前已进入i i 期临床研究。在b r y o s t a t i n 基础上合成的b a f i m a s t a t ( b b 9 4 ) 和m a r i m a s t a t ( b b 2 5 1 6 ) 两种化合物均已进入i i 期临床。我国从南中国海的总合草 苔虫中制备的总草苔虫内酯，对红白细胞白血病胞株具有超强的杀灭作用，是天 然产物中对k 5 6 2 株抑制作用最强的化合物( 林厚文等，1 9 9 8 ) 。 2 海洋抗肿瘤多肽的研究进展 现在使用的抗肿瘤药物种类繁多，但是存在药物毒性、作用差异和交叉耐药 等多种副作用。目前对肿瘤患者常见的化疗和放疗手段往往导致严重的副作用， 因此寻找高效、低毒的抗肿瘤药物是目前的热点之一，而新型的多肽药物恰恰具 备了这些特点。小分子多肽广泛存在于自然界，并可通过人工方法合成，由于其 具有相对分子质量小、活性高、毒性低的特点，在肿瘤的临床治疗上有重要的价 值。 随着现代生物技术和化学技术的应用，近年来对海洋生物活性肽的研究取得 了很大进展。海洋中天然存在的活性肽包括肽类抗生素、激素等生物体的次级代 谢产物以及各种组织系统，如骨骼、肌肉、免疫、消化、中枢神经系统中存在的 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 活性肽。随着人们对海洋生物资源认识水平的提高，以及现代生物技术在海洋药 物研究中的应用和r p h pl c 、2 d n m r 、t o f m s 、手性色谱( 包括g c ，h p l c ) 等技术的发展，使得对海洋活性肽的研究易于进行。目前研究的海洋活性肽主要 包括来源于海鞘、海葵、海绵、芋螺、海星、海兔、海藻、鱼类、贝类等的活性 肽( r i g u e r ar ，1 9 9 8 ，r y ud e ta 1 ，1 9 9 4 ) 以及在海洋生物中广泛分布的生物防御 素( 房师松等，2 0 0 4 ，l e h r e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。以下分别举例说明： 2 1 海洋天然活性肽 2 1 1 海绵多肽 海绵( m a r i n es p o n g e ) 是最原始的多细胞动物，结构简单，无器官分化，约占 海洋物种总量的1 1 5 ，但作为一个特殊生物群体含有极丰富的生物活性物质。在 已公布的海绵活性物质中，抗肿瘤活性肽较多。专利申请所涉及的海洋生物种类 中，海绵一直居于首位。易杨华等从棕色扁海绵( p h a k e l l i a f u s c at h i e l e ) 的乙醇提 取物中获得1 个新的p h a k e l l i s t a t i n s 类环肽化合物，为1 个环状七肽( p r o1 g l y p h e p r 0 2 t r p l e u - n 曲，该化合物具有抗肿瘤活性，其潜在的应用前景正在评价之 中，这是首次从产于我国海域p h a k e l l i a 属海绵动物中分离获得此类化合物，对这 些活性成分的研究为今后药用资源的开发和新药研究奠定了基础( 易杨华等， 2 0 0 2 ) 。 j a s p a m i d e 是从斐济和几内亚海域离海绵l | j a s p i s 属海绵中分离得到的环肽。 实验证明该肽具有杀伤线虫活性和细胞毒活性，其结构的全合成已经完成。g e o d i a m o l i d e sa ，b 是从加勒比海离海绵目g e o d i a s p 属海绵中分离得到的环肽成分， 具有细胞毒活性，利用n m r 和x 一射线晶体衍射分析已确定其化学结构。 c e l e n a m i d e sa d 是从东太平洋硬海绵目中分离得到的具乙酰化的小肽，体外 实验证明具有降低血色素的作用。 2 1 2 海葵多肽 海葵( a n e m o n e ) 是另一类富含生物活性物质的海洋生物。文献报道从海洋生 物海葵中提取得到的活性肽可分为3 类：( 1 ) 存在于1 6 种海葵中的鞘磷脂抑制性碱 性多肽，平均相对分子质量1 5 0 0 0 2 1 0 0 0 d 间。( 2 ) 从m e t r i d r u ms e n i l e 属海葵中分 离得到的具胆固醇抑制效果的活性肽，其平均相对分子质量在8 0 0 0 0 d 左右。( 3 ) 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 眦i p t a s u p a l l i d a 属海葵中分离提取的、活性未知的a i p t a s i o l y s i na 多肽。 2 1 3 海鞘多肽 海鞘( a s c i d i a n ) 是接近脊索动物门的高等无脊椎动物，近年的研究表明，海 鞘中含有许多重要的生理活性物质，是除海绵外人类获取具有显著生理活性物质 的重要生物资源。1 9 8 1 年r i n e h a r t ( v e r amd ，2 0 0 2 ) 首次从海鞘t r i d i d e m n u m s o l i d u m 中分出并测定了环肽d i d e m n i n sa ，b 和c 的结构，证实了它们具有抗肿 瘤、抗病毒的活性，其中d i d e m n i n b 的活性最强，既能抑制蛋白质的合成，也能 抑制d n a 、r n a 的合成。其对黑色素瘤b l 6 细胞周期作用的研究表明，它可杀伤 各种周期细胞，尤其是对g l 至s 期细胞敏感，对乳腺癌、卵巢癌具明显的抑制活 性。人们又以合成、半合成或从其它海鞘中分离等多种方式得到了许多d i d e m n i n 的同系物。对多达4 2 种d i d e n m i n 类化合物进行的结构与功能的对比研究表明，天 然环肽核为其生物活性所必需，而对侧链的化学修饰则会明显地影响其活性强 弱，如第二代d i d e m n i n - - 脱氢d i d e m n i nb 的体内外抗肿瘤活性e l d i d e m n i n 强许 多，目前脱氢d i d e r n n i nb 已进入临床研究。同时，它还有明显的免疫抑制活性， 体内活性较环孢霉素a 强1 0 0 0 倍，有望成为新型抗肿瘤药物。 2 1 4 海兔多肽 海兔( d o l a b e l l aa u r i c u l a r i a ) 属软体动物门腹足纲后腮亚纲海兔科动物，从中 追踪分离至l j l 8 个抗癌活性肽d o l a s t a t i n1 1 8 ，其中研究的比较多的是d o l a s t a t i n3 、 l o 、1 5 ，在抗癌新药开发方面具有巨大潜力。从印度海兔中分离出1 0 种细胞毒性 环肽d o l l a b i l a t i n1 1 0 ，其中d o l l a b i l a t i n1 0 对b l 6 黑色素瘤治疗剂量仅为1 1 p g m l ， 是目前已知活性最强的抗肿瘤化合物之一( 林凡，2 0 0 2 ) 。 s u e n a g a 等从日本海兔中分离得到了1 种活性物质a u r i l i d e ，经核磁共振和高 效液相色谱( h p l c ) 技术测定结构，表明其为2 6 个氨基酸残基组成的环肽。合成 的类似物对人宫颈癌细胞h e l as 3 有抗肿瘤活性，i c 5 0 为0 o l1m g m l ，更多的生 物学活性正在研究q b ( s u e n a g ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 2 1 5 芋螺多肽 芋螺( c o n u s ) 是海洋腹足纲软体动物，其在猎取鱼、海洋蠕虫、软体动物时 常分泌一系列毒性物质，称为芋螺毒素( c o n o t o x i n ) 。经过近2 0 年的研究已发现 单环刺虫益多肽的分离纯化及生物活性研究 的芋螺毒素有近百种，主要包括0 【芋螺毒素、p 芋螺毒素、芋螺毒素、6 芋螺 毒素。大多为由1 0 一3 0 个氨基酸残基组成的小肽，富含2 对或3 对二硫键，是迄今 发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽。其活性与 蛇毒、蝎毒等动物神经毒素相似，可引起动物出现惊厥、颤抖及麻痹等症状。 2 1 6 海星多肽 从烫灼或自主运动的一种海星所分泌的体液中分离纯化到一种自主刺激因 子。凝胶电泳分析表明该肽的相对分子质量为1 2 0 0 d ，h p l c 检测为单峰组分。 具有刺激细胞运动并使之产生应激反应的功能。 2 1 7 海藻多肽 海藻臼切) 种类繁多，其中含有的生物活性物质也多种多样。从培养的蓝藻 中分离出一种具有鱼毒性、抗菌、杀细胞活性的生物活性肽，已具备大规模生产 能力。h o r m o t h a m i n 是从海藻p r y m n e s i u mp a t e l l i f e ，“m 中提取的毒素肽，具有溶细 胞、细胞毒和神经毒等活性，其作用机制主要是影响脑垂体细胞静止期的钙离子 通道、提高电压敏感性钙离子通道的释放，促进脑内激素如催乳素的分泌增加而 产生作用。从海 藻z y n g b y am a j u s c u l a r 扣分离到一种具有细胞毒活性的环肽m a j u s e u l a m i d ec ，它对x 5 5 3 6 骨髓瘤细胞的抑制效果达到3 5 。 2 1 8 鱼类多肽 鱼类是人们最早食用的海洋生物之一，其体内含有丰富的蛋白质成分，营养 价值相当高。但从其中开发具有药用价值的活性物质的研究却较少。曾有报道从 铜吻蓝鳃太阳鱼中分离并鉴定出4 种具缓激肽活性的肽类，对鱼肠组织细胞具有 强烈的刺激作用。有研究从大西洋鳕鱼( g a d u sm o r h u a ) 、虹蹲( o n d o r h y r i d u s ，缈 胁) 、欧洲鳗鲡( a n g u i l l aa n g u i l l a ) 等鱼类的嗜铬细胞组织中提取到一系列的生物 活性肽及其类似物，并利用免疫组织化学方法研究其在细胞组织中的作用，发现 此类肽与肾上腺素受体具有一定的亲合性，可能具有控制儿茶酚类物质释放的作 用。 2 1 9 贝类多肽 从海洋贝类的神经元中提取到2 种神经肽p d 5 和p d 6 ，它们具有促进神经元产 单环刺蟠多肽的分离纯化及生物活性研究 生的活性。利用h p l c 方法纯化并对其氨基酸序列进行了分析。现已完成其结构 的全合成。 2 1 1 0 生物防御素 生物防御素( d e f e n s i n ) 是近年来发现的一组新型抗菌活性肽。它们通常都是 由3 5 5 0 个氨基酸残基组成，且分子内富含二硫键。由于其具有牢固的分子骨架、 广泛的分布以及生物活性功能，因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个 引人关注的研究热点。各类抗茵防御素不但在结构上具有相应的保守序列和相似 的紧密空间构型，在功能上也都有相似的共性，如抗菌、抗病毒能力和细胞毒性 作用等。无论洳、b 防御素对革兰氏阳性和阴性细菌都具有杀伤作用。相对而言， 它们对革兰氏阳性细菌显示了更强的杀伤能力，而植物防御素被认为是真菌生长 的有效抑制剂。许多仅防御素如n p i - 2 ，h n p l 3 等已被验证了对病毒的杀伤作用。 各类防御素除具有上述抗菌和抗病毒功效外，也参与自身的防御机制，如已有实 验表明多形核细胞可释放某种细胞侵害因子，该因子的产生和作用似乎与多形核 细胞胞内防御素的含量成正比关系。此外某些防御素还能杀死肿瘤细胞、淋巴细 胞、嗜中性粒细胞和内皮细胞等，其杀伤能力呈现浓度和时间依赖性，通常最适 浓度为2 5 1 0 0 1 上g m l ，作用6 h 达到最大效力。大量的研究资料表明，防御素与其 它类型抗菌肽作用机制相似，它们主要是通过在细胞膜上形成通道，引起细胞离 子通道性的失衡和胞内物质的泄漏，进而导致细胞活动的异常。防御素在细胞膜 上的通道形成过程与膜的磷脂组成成分和所处的温度环境等因素有关。然而一旦 防御素在膜上形成了通道，上述因素便不会对其通道的活动构成本质的影响。 生物防御素的抗菌、抗病毒及其杀伤肿瘤细胞的多重功能效应无疑正展示着 它们对物种生存、抵御侵害以及用于提高人的生活质量等实际应用中的显著作 用。另一诱人的前景是，这些防御素有分子小并具有稳定的分子结构等优点，为 当今研制多肽新药提供了理想的分子设计骨架和模板。 2 2 海洋酶解生物活性肽 生物的各种功能大多来自蛋白质的多样性。这是由于2 0 种氨基酸在排列成不 同长度的多肽链时，具有天文数字的多样性。所以2 0 个氨基酸残基组成的多肽， 其序列多样性可以胜任所有生物的所有功能。也就是说，理论上所有的生物功能 单环刺虫益多肽的分离纯化及生物活性研究 肽都可能以短肽的形式找到。天然存在的活性肽大部分或含量微少或提取难，不 足以大量生产供给所需；化学人工合成又费时费力，成本昂贵；因此，人们更多 地把目光投向开发蛋白酶解产物这条途径上来。 由于生物对营养蛋白和贮藏蛋白需求量很大，基因表达率自然很高。因此， 这些蛋白在自然界蕴藏量极大。通过蛋白酶水解这些蛋白所获得的生物活性肽具 有很多优点：原料廉价，成本低，安全性好，不需要很高级的实验条件和很贵重 的仪器设备，便于工业化生产。大量文献表明，该研究领域发展很快，已经受到 了各国科学家和政府的高度重视，在短短的几年里就有众多的生物活性肽被辨认 出来并进行了系统研究。有些生物活性肽已经作为保健食品和药物实现了工业化 生产，并取得巨大的经济效益，如酪蛋白磷酸肽( c a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ，c p p s ) 和类吗啡因子等。 海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远大于陆地蛋白资源，并且未得到 很好的开发。海洋生物蛋白资源是2 1 世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质 的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，因此，我 国可以对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。种类繁多的海洋蛋白氨 基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就 释放出有活性的肽段。目前海洋蛋白源酶解的活性肽非常少，尚需要进行研究和 开发。 2 0 0 0 年，r o z e n nr a v a l l e c p l e 等利用商品酶a l c a l a s e ( n o v on o r d i s k ，n a n t e r r e ， f r a n c e ) 对鳕鱼肉进行水解，得到高品质的鱼蛋白水解物( f p h s ) ，水解产物中含 有细胞生长因子、促分泌素( 胃泌素和缩胆囊素) 等。2 0 0 1 年，r o z e n nr a v a l l e c p l e 等利用同一种酶a l c a l a s e 对加工沙丁鱼的废弃物进行水解，得到了多种生物活性 多肽包括胃泌素、降钙素基因相关肽( c g r p ) 、细胞生长因子等( r o z e n ne ta 1 ， 2 0 0 0 ；2 0 0 1 ) 。 2 3 海洋活i 生肽的吸收情况 现代生物代谢研究发现，人类摄取的蛋白质经消化道多种酶水解后，不象以 前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽的形式直接吸收。从营养 角度评价，二肽、三肽等低肽被人体消化吸收的效率要比同一组成的氨基酸高， 因此可作为食品添加物。这些低肽的渗透压较氨基酸低，而且在人体小肠部位的 单环刺蜷多肽的分离纯化及生物活性研究 通透性也比氨基酸高，因此可提高吸收率。此外，低肽的风味一般要优于单个氨 基酸，也不易产生过敏。其中某些低肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质， 且同时具有重要的生理功能，如促进矿物质吸收肽、防治肝性脑病肽，易消化吸 收肽、抗菌肽、吗啡片肽、类吗啡拮抗肽、血管紧张素转换酶抑制肽、抑制胆固 醇作用肽、机体防御功能肽等。上述功能是原蛋白质或组成氨基酸所不具备的， 且许多活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，对其营养性影响不大。这就 为更充分地利用蛋白质资源，特别是那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源提 供了新的机遇。 2 4 前景与展望 开发利用海洋抗肿瘤活性肽仍需加强以下方面研究：海洋生物抗肿瘤活性 肽的研究，目前主要集中在少数几种海洋生物中，还有很大部分海洋生物活性肽 成分未被发现或开发出来。已研究的海洋生物活性肽中，大多为海洋环肽，虽然 它们的作用都很明确，但因其多含d 型氨基酸、多种基因修饰、封闭的n 末端等特 殊结构，给研究开发带来一定困难，不易利用蛋白质工程、基因工程方法大规模 生产。活性肽的分离及鉴定急需高效和灵敏的技术或分析平台。目前活性的分 离困难，分析仪器要求也高，大多需使用2 d n m r ，f a b m s 等方法。要加强 生物工程技术在活性肽方面的应用。目前已开发的海洋生物活性肽类、多采用全 合成及固相合成等方法。如何利用蛋白质工程技术与基因工程技术生产海洋多肽 物质是未来的一个研究方向。 3 其它途径获得的抗肿瘤多肽 3 1 从其它生物中提取的天然多肽 r a 系列肽( r a s ) 和b o u v a r d i n 是从r u b i ac o r d i f o l i a 三和b o u v a r d i a 植物中发现 的环状六肽( c h e m y s he ta 1 ，2 0 0 4 ) ，包括独特的酪氨酸环状单位，其e r a v i i ( 2 ) 在日本作为潜在的抗肿瘤药物进入i 期临床试验。还有些环肽，如c y c l o ( 一a r g g l y a s p d p h e l y s 一) y o c y c l o ( a r g g l y a s p d p h e v a l 一) ，也有一定的抗肿瘤应用价 值。 a l l o f e r o n ( a l l o f e r o n i ：h g v s g h g q h g v h g ，1 3 a a ；a l l o f e r o n 2 ：g v s g h g q h g v 单环刺蜢多肽的分离纯化及生物活性研究 h g ，1 2 a a ) 是从1 种苍蝇c a l l i p h o r av i c i n a 中提取到的一系列具有抗肿瘤和抗菌作用 的小肽，可以提高小鼠的脾脏和血液内自然杀伤淋巴细胞的细胞毒作用 ( h i t o t s u y a n a g iy e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 柞蚕中含有的抗菌肽( 杀菌肽) 也是一类作用很强的抗癌成分，是由3 3 3 9 个 氨基酸组成的一类碱性多肽，分子量为4 0 0 0 5 0 0 0 d ，已分离并测定氨基酸序列一 级结构的多达数十种，它们对细菌、病毒及肿瘤细胞均有选择性杀伤作用。凌斌 勋等建立荷人鼻咽癌细胞株c n e 2 的裸鼠模型，通过腹腔注射和局部注射柞蚕抗 茵肽2 种途径进行治疗干预实验，结果治疗组与对照组比较肿瘤明显缩小，有显 著差异( 氏0 0 1 ) 。抗菌肽局部处理组癌瘤大面积出血坏死，较多的炎细胞浸润， 裸鼠心脏、肝脏、肾脏未见明显病变，外周血白细胞无明显下降，证明柞蚕抗菌 肽具有较明显的抗裸鼠移植性人鼻咽癌c n e 2 的作用，并且无明显毒副作用( 凌斌 勋等，2 0 0 3 ) 。 眼镜蛇毒的重要活性成分之一细胞毒素( c y t o t o x i n ，c t x ) 是由6 0 6 3 个氨基酸 残基组成的多肽，分子量为6 0 0 0 7 0 0 0 d ，是眼镜蛇毒中较小的活性多肽。许云禄 等应用凝胶过滤、离子交换柱色谱及疏水柱色谱等方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯 化得到了不含磷酯酶a 2 ( p l a 2 ) 的c t x f ，经过体外实验，证明c t x f 能抑制人肝 癌细胞b e l 7 4 0 4 、人肺腺癌a 5 4 9 细胞和小鼠黑色素瘤b l 6 细胞的增殖。 在中国东亚钳蝎的毒液中分离纯化得到抗瘤止痛肽a n t p ，分子量为6 2 8 0 d ， 其n 端2 5 个氨基酸序列为：v r d g y 队d d k n k a ? l g r n a y c d d g 。通过p c r 的 方法获得了中国东亚钳蝎毒液的抗瘤止痛肽( a g a p ) 的基因，并在大肠杆菌中获 得表达。大部分重组的a g a p 以包涵体的形式表达。重组后的a g a p 在小鼠体内 试验具有抗肿瘤和止痛活性( 1 i uy a n f e n g e ta 1 ，2 0 0 2 ；l i uy a n f e n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 胸腺是机体最重要的