（化学工程专业论文）多孔载体与表面活性剂在原油降解菌上的应用研究.pdf

摘要 随着石油工业的发展，石油污染土壤的问题日趋严重。微生物修复由于操 作简单，费用低、无二次污染等优点被认为具有广阔的应用前景。但该方法的一 个突出缺点是降解速度慢，处理时间长。而采用表面活性剂的方法可增加石油 污染物在水相中的溶解度进而增加了污染物的传递速率，提高微生物的降解速 率及除油率。考虑到便于菌剂的扩大化生产与运输，应将微生物进行固定化处 理。因此，对微生物进行固定化研究和选取合适的表面活性剂很有必要。 从石油污染土壤中筛选、驯化得到三株对辽河原油具有较好降解效果的菌 种( h 1 、h 2 、h 3 ) ，本文以液相降解实验中对原油降解率最高的菌株h 1 为供试 菌种，通过物理吸附法选用不同的载体对菌株进行微生物固定化试验，确定了 锯末为最佳吸附载体。根据在化学表面活性剂s d s 、t w e e n 8 0 、b 环糊精和生 物表面活性剂鼠李糖脂作用下菌h 1 的生长曲线，考察了表面活性剂在不同浓度 下对菌h l 的毒性作用，并建立了菌体的生长模型。当s d s 浓度大于4 0 m g l 时，表现出一定的毒性。表面活性剂的降解及对原油的增溶实验表明，各表面 活性剂均能被菌h 1 降解；鼠李糖脂对原油增溶效果明显，且随着鼠李糖脂浓度 增加而增加，s d s 、t w e e n 8 0 对原油也有一定的增溶作用，b 环糊精几乎没有 增溶作用。采取天津滨海地区典型土壤淤泥质粉质粘土夹粉砂层土壤为试验土 样，考察了不同表面活性剂对该类型土壤中原油降解的促进作用。实验结果表 明，化学表面活性剂s d s 、t w e e n 8 0 、b 环糊精对原油的降解促进效果甚微。 而生物表面活性剂鼠李糖脂能够明显促进原油在土壤中的降解。随着鼠李糖脂 浓度的增大，原油降解速度越快，降解半衰期越短。采用该体系下双重指数模 型对原油的降解进行拟合，所得的动力学方程能够很好地描述原油的降解反应 趋势。 关键词：石油污染，土壤，降解，载体，表面活性剂 a bs t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h eo i l i n d u s 仃y ，o i l - c o n t a m i n a t e ds o i lp r o b l e m sg e t t i n g w o r s e m i c r o b i a lb i o r e m e d i a t i o nw a sc o n s i d e r e dt oh a v eb r o a da p p i i c a t i o np r o s p e c t s b e c a u s eo fs i m p l e ，l o w - c o s ta n dn o s e c o n d a 巧p o l lu t i o n b u tt h i sm e t h o dh a st h e c o n s p i c u o u ss h o r t c o m i n g so ft w or e s p e c t s ： 1 0 w e rb i o d e g r a d a t i o n s p e e da n dl o n g p r o c e s s i n gt i m e w h i l et h es o l u b i l i 够o fo 订c a ni n c r e a s eb yu s i n gs u r f a c t a n t t h e r e f o r e ， t h et r a n s f e rr a t eo fp o l l u t i o nw i l li n c r e a s e i tc a na l s oe n h a n c et h eo 1d e g r a d a t i o na n d r e m o v a lr a t e i no r d e rt oe n l a 唱ep r o d u c t i o na n dt r a n s p o r t a t i o n ，t h em i c r o o r g a n i s m s a g e n ts h o u l db e 打e a t e db yi m m o b i l i z a t i o n t h e r e f o r e ，i ti sv e r yn e c e s s a r yt 0s 砌y h o wt oi m m o b i i i z em i c r o o r g a n i s ms e l e c ts u i t a b l es u 晌c t a n t t h r e ek i n d so fs u p e r i o r i 妙b a c t e r i u ms p e c i e sh1 、h 2 、h 3w h i c hb e i n gh a d h i g h e rd e g r a d a t i o ne f r e c tt oc m d eo i lo fl i a o h eo i l 行e l dw e r es c r e e n e d 仔o mo i l c o n t a m i n a t e ds o i l i nt h i s s t u d y ，t h eh i 曲e s td e g r a d a t i o nr a t eb a c t e r i u mh li n f l u i d p h a s ed e c o m p o s i t i o ne x p e r i m e n t sw a sc h o o s e da st h et e s t e do b i e c t s e j e c t d i f f e r e n tc a r r i e r st oi m m o b i l i z em i c r o o r g a n i s m b yp h y s i c a la d s o 印t i o nm e t h o d ， s a w d u s tw a sd e t e m l i n e da st h eb e s ta d s o r p t i o nc a r r i e r t h et o x i c i 母o fc h e m i c a l s u r f a c t a n t s d s ，t w e e n 8 0 ， b c da n db i o s u r f a c t a n tr h a m n o i i p i da td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n sw e r ed e t e m i n e do nt h eb a s i so ft h eg r o w c hc u r v e so fm i c r o o r g a n i s m h 1 t h e 伊o 、t hm o d e l sw e r ea l s oc o n s t l l j c t e da c c o r d i n gt ot h eg r o 、v t hc u r v e s w h e n t h ec o n c e n t r a t i o no fs d s h i g h e rt h a n4 0 m g l ，i ts h o w st o x i c i 哆t 0b a c t e r i u mh 1 t h e d e g r a d a t i o ne f 佗c to fb a c t e r i u mhlo ns u r f a c t a n t sa n dt h ei n n u e n c eo fd i f j f b r e n t s u r l a c t a n t st os o i u b i l i z a t i o no fc r u d eo i lw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w st h a ta l l s u r f a c 胁t sc a nb ed e g r a d a t e db yb a c t e r i u mh 1 r h a m n o l i p i db i o s u r f a c t a n th a s o b v i o u ss o l u b i l i z a t i o nt oc r u d eo i lw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no ft h i s b i o s u r f a c t a n t i n c r e a s e d ，t h es o 】u b i 】j t yo fc 1 1 j d eo j la j s oi n c r e a s e d c h e m i c a ls u r f a c t a n ts d sa n d t w e e n 8 0a l s oh a v es o m es o l u b i l i z a t i o ne f f e c t h o w e v e r ，b c dh a sa l m o s tn oe f f e c t o nt h es o l u b i l i z a t i o n t | h er e p r e s e n t a t i v es o i lw h i c ht ) ，p i c a l l yd i s t r i b u t e si nt i a n j i n b i n h a id i s t r i c t ，s l u r 巧s i l tc l a y ，w e r ec h o o s e da st h et e s t e do b i e c t u n d e rt h ec o n d i t i o n o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n ， e f 如c to fd i f - f e r e n to fs u r f a c t a n t so nt h ec m d eo i l d e 舯d a t i o nr a t e i n t h i ss o i lw a ss t u d i e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t et h a t c h e m i c a ls u r f a c t a n ts d s ，t w e e n 8 0a n dp c d h a v ea l m o s tn oe f f e c tt ot h e d e g r a d a t i o nm t e b u tt h er h a m n o l i p i db i o s u 渤c t a n tc a np r o m o t e t h ed e 盯a d a t i o no f c r u d eo i l i ns o i lm a r k e d l y w i t hi n c r e a s i n gr h a m n o l i p i dc o n c e n t r a t i o n ，t h ed e g r a d a t i o n r a t eo fo 订s p e e d e du pa n dt h ed e g m d a t i o nh a l fl i f es h o r t e n e d u s i n gt h ed o u b l e e x p o n e n t i a lm o d e l t o f i tt h ed e g r a d a t i o no fc m d eo i l ，t h ek i n e t i ce q u a t i o nc a nd e s c r i b e t h et r e n do fc r u d eo i ld e 铲a d a t i o nc o m m e n d a b l y k e yw o r d s ： o 订p o l l u t i o n ，s o i l ，d e g r a d a t i o n ，c a 仃i e r ，s u r f a c t a n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位敝作者虢) 虱乡氨签字日期伽8 年石月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂：有关保留、使用学位论文的规定。 特授权叁鲞态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 一虢7 虱歹赵聊虢蒙f 习强 签字日期：卯8 年6 月6 日 签字日期如盱年彳月7 日 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 土壤污染状况及危害 1 1 1 土壤污染状况 土壤是构成生态系统的基本要素之一，是国家最重要的自然资源，也是人 类赖以生存的物质基础、生态环境的主要组成部分。随着全球工业化的进程， 土壤污染越来越严重。土壤污染问题直接关系到农产品质量，关系到人体健 康，关系到生态安全，是人民群众关心的热点问题i l 】。土地污染对生态安全构 成威胁，直接影响土地生态系统的结构和功能，造成有害物质在农作物中积 累。而更严重的问题是，土地污染会通过食物链进入人体，从而引发各种疾 病，最终危害人体健康【2 j 。土壤污染物主要来自工业、农业、交通运输和生 活，污染物主要分为三大类：有机污染物、重金属污染物和放射性污染物，其 中有机物污染己经超过重金属污染和放射性污染而跃居首位【3 。 土壤有机物污染中最严重的是石油类污染物。全世界石油大规模开采是从 2 0 世纪初开始的，1 9 0 0 年全世界石油消费量约2 0 0 0 万吨，1 0 0 年来这一数量已 增加百余倍1 4 】。但是，在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，由于不正 常操作及检修等原因，石油烃类的溢出和排放事故时有发生。据联合国有关组 织统计，每年由于人类活动而流入大海的石油约1 0 0 0 万吨，其中由河流沿岸工 业排放入海的约为3 0 0 5 0 0 万吨，因海洋石油开发和油轮事故流失入海的约为 1 0 0 万吨。油井附近石油类污染物含量平均达到1 5 8 k g ，而其在正常灌溉条件 下农田中的含量仅为2 2 m g l ( 9 1 5 j 。据估计，全世界每年约有l x l 0 9 t 石油及其产品 通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中1 6 ，7 】。 发达国家( 例如美国、西欧和日本等) 由于长期的工业生产活动，导致了大 面积土壤及地下水受到了不同程度的污染。美国在2 0 世纪9 0 年代共有1 0 万个 地下储油罐已确认存在不同程度的泄漏，并预测几年后这个数字将会增至3 倍 【8 】。美国宾夕法尼亚卅f 地下储油罐使用l o 年以上的渗漏率达到4 6 ，使用1 5 年 以上的渗漏率则高达7 1 ；法国南特市使用1 0 年以上的储油罐渗漏率在2 0 以 上【9 】。至今，美国环保局已在全国范围内列出了1 4 0 0 多个污染点作为优先治理 的地点，其中8 5 以上对土壤及地下水造成了污染。国际公认的泄漏成品油对 水的污染比为1 ：1 0 0 万( 平均按1 m g l 污染浓度计) i l 。在发展中国家，由于工 第一章文献综述 业化进程加快，受污染的土壤和地下水面积也不断增加。在我国，随着工农业 生产的发展和乡村的城市化，土壤污染迅速蔓延，污染程度也逐渐加深。在国 内以大庆油区资料统计数据为例，平均每年每口井产生的落地油高达0 5 2 0 吨。截至1 9 9 7 年底，大庆运行中的油井有2 4 3 7 4 眼，按此计算大庆油田产生的 落地油每年有2 0 1 0 8 4 0 0 吨。这些油田的周围，环境受到污染，生态遭到严重 破坏【l1 1 。有关主要污染物的调查统计报告显示：1 9 9 8 年各石油、炼化企业工业 固体废物产生量为4 2 8 9 8 1 0 6 t ，利用率低于5 0 ，工业固体废物排放量为 1 5 6 1 1 0 t 。工业固体废弃物历年累计堆存量1 8 8 4 5 1 07 t ，占地面积 1 8 1 7 x 1 0 6 m 2 ，年产石油污染土壤近l 1 0 5 t ，累计堆放量近5 1 0 5 t 【1 2 】。据不完全 调查，目前全国受污染的耕地约有1 5 亿亩，污水灌溉污染耕地3 2 5 0 万亩，固 体废弃物堆存占地和毁田2 0 0 万亩，合计约占耕地总面积的1 1 0 以上i 。 1 1 2 土壤污染危害 美国康奈尔大学的研究学者声称，世界上高达4 0 的临床死亡病例是由环 境污染所引起的，这些污染包括土壤、水源和空气的污染，世界卫生组织的报 告称：严重的环境污染和人口过剩等问题一起，对世界上大约3 7 亿营养不良和 疾病易感的人群构成了巨大的威胁。 长期以来，人们认为土壤具有过滤、吸附、储存和缓冲等“自净化 能 力，而对有机物污染土壤的严重性认识不够。其主要原因是污染物在土壤及地 下水环境中的扩散、迁移速度相对较慢，具有隐蔽性、缓效性。然而土壤的自 净化能力是有限度的，当污染程度超过这个限度后，就会破坏土壤生态系统。 而由于土壤环境的组成、结构、功能、特性以及在自然生态系中的地位和作 用，使土壤环境污染比大气污染、水体污染更为复杂，其危害也远远大于大气 和水体的污染。 石油类物质进入土壤，引起土壤理化性质的变化，也引起土壤微生物群 落、微生物区系的变化，这些变化必然导致土壤酶种类和活性强弱的变化。石 油污染对作物的影响在土壤中与土粒粘连，引起土壤理化性质的变化，如堵塞 了土壤孔隙，影响土壤的通透性，而土壤表层常常是农作物根系最发达的区 域，所以石油对土壤的污染程度直接影响到农作物的生长情况。石油对土壤的 污染对农作物的危害主要表现在两个方面：其一，石油粘着在植物的根表面， 形成枯膜，阻碍根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，造成植物的死亡。其二， 由于对土壤的污染，会导致石油的某些成分在粮食中形成积累，油类在作物体 及果实部分主要残留毒害成分是多环芳烃类。石油中的芳香烃类物质对人及动 物的毒性极大，尤其是双环和三环为代表的多环芳烃毒性更大。多环芳烃类物 第一章文献综述 质可通过呼吸、皮肤接触、饮食摄入等方式进入人和动物体内，影响其肝、肾 等器官的正常功能，甚至引起癌变。石油类物质还通过地下水的污染以及污染 的转移构成对人类生存环境多个层面上的不良胁迫【1 3 ，l4 1 。由于土壤污染具有累 积性、滞后性、不可逆性的特点，治理难度大，成本高、周期长，其对经济社会 发展的影响将是长期性的。土壤污染问题已经成为影响群众身体健康、损害群 众利益的重要因素。 1 2 土壤污染的修复技术研究现状 1 2 1 石油污染土壤修复方法 污染土壤的修复技术研究已成为当前环境保护工程科学和技术研究的一个 新热点。鉴于土壤污染的严重危害，治理石油污染势在必行，已引起许多发达 国家高度重视，不断采取措施，治理石油污染。荷兰在8 0 年代已花费了约1 5 亿 美元进行土壤的恢复工作，德国在1 9 9 5 年投资约6 0 亿美元用于净化土壤，美国 9 0 年代在土壤恢复方面的投资约有数百亿到上千亿美元【l3 1 。现有的石油污染土 壤处理方式主要包括物理处理、化学处理和生物处理( 生物修复) 等。物理修复 技术包括隔离、泵抽提、焚烧、换土等。化学修复主要依靠进入土壤的化学修 复剂与化学污染物发生氧化、还原、沉淀、聚合等化学反应，从而使污染物得 以降解或转化为低毒性或移动性较低的化学形态。包括溶剂蒸汽浸提法、化学 去卤法、原位土壤淋洗法、化学还原法、化学氧化法、水解法、聚合法和化学 降解法。生物修复技术是在生物降解的基础上发展起来的一种新兴的清洁技 术，它是传统的生物处理方法的发展。与物理、化学修复污染土壤技术相比， 它具有成本低，不破坏植物生长所需要的土壤环境，污染物氧化安全，无二次 污染，处理效果好，操作简单等优点。生物修复可通过环境因素的最优化而加 速自然生物降解速率，是一种高效、经济和生态可承受的清洁技术【l5 i 。因此， 生物修复技术将成为我国生态环境保护领域最有价值和最具生命力的生物处理 技术。 生物修复技术分为自然生物修复和人工生物修复法。自然生物修复是不进 行任何工程辅助措施或不调控生态系统，完全靠自然的生物修复过程，即靠土 著微生物发挥作用。这类土壤的修复要有以下环境：有微生物可利用的营养物 质；有缓冲p h 的能力；有使代谢能够进行的电子受体。人工修复是在修复效率 低下或不能发生时，通过补充营养物质和电子受体，改善其他抑制因子或微生 物菌体，促进生物降解的一种方法。目前，治理石油烃类污染土壤的人工生物 第一章文献综述 修复技术主要有两类：一类是微生物修复技术，按修复的地点又可分为原位生 物修复和异位生物修复；另一类是植物修复法。 ( 1 ) 原位生物修复技术在污染的原地点进行，利用生物通风和冲淋等方法 进行。具有不人为移动污染物，不挖掘运输土壤或抽取地下水，不改变地表建 筑物等特点。 a ) 土壤耕作法：又称土壤农耕法，是对污染的土壤加入肥料进行灌溉，加 入石灰石进行耕耙处理的一种方法，在处理过程中，为微生物提供一个良好的 环境，使其有充足的营养、水分、和适宜的p h 值、保证污染物降解在各个层次 上都能发生；通过耕翻土壤，补充氧和营养物质提高土壤微生物的活性，此方 法适用于不饱和层土壤处理，不适用于地下水处理。 b ) 生物通风法：是向亚表层供给空气或氧气，促进不饱和层中污染物生物 降解的技术，原位生物通风修复技术严格控制在不饱和层的土壤中。具体的措 施是向不饱和层打井，通气井的数量、井间的距离和供氧的速率根据污染物的 分布、土壤类型等而定。 c ) 投菌法：是直接向遭受污染的土壤加入外源的污染降解菌，并定期向土 壤中投加过氧化氢等氧源和这些菌生长所需养料，以满足污染环境中降解菌的 需要，以便使土壤微生物通过代谢将污染物彻底降解成c 0 2 和h 2 0 的一种方法。 d ) 生物冲淋法：又称液体供给系统，将含氧和营养物的水补充到亚表层， 促进土壤和地下水中污染物的生物降解。此方法大多用在各种石油污染的治理 中，氧气可以用空气或是纯氧经喷射供给，也可以加入过氧化氢或是硝酸盐、 硫酸盐和三价铁作为电子受体。 ( 2 ) 异位修复法是移动污染物到临近地点或反应器内，采用工程措施，挖掘 土壤或抽取地下水的一种方法，此方法技术难度低，但是投资较大。异位生物 修复主要包括堆肥处理法、预制床法、异位土地耕作法、生物反应器处理法。 a ) 堆肥式处理：又称整备床法，将污染土壤挖出堆成堆，使用机械或压气 系统充氧，加入石灰调节p h 值，经过一定时间的发酵，大部分污染物被降解， 上面还可以安装有喷淋营养物的管道。 b ) 预制床法：在一个不泄露的平台上，将污染物平铺1 5 3 0 c m 厚，加入营 养液或是表面活性剂，定期翻动充氧，满足微生物的需要。 c ) 异位土地耕作法：用于处理污水处理厂的污泥，也用于处理石油产品污 染的土壤。将污泥或污染土壤均匀地撒到土地表面，然后使之与土壤混合，必 要时加入营养物质，调整p h 值，并对通气状况进行检测。 d ) 生物反应器型泥浆处理法：是把土壤移到反应器中，使细菌和污染物充 分接触，并确保充足的氧气和营养物，加入3 9 倍的水混合使其呈泥浆状态，同 4 第一章文献综述 时加入必要的营养物质和表面活化剂，剧烈搅拌使其与营养物质充分混合，完 成代谢活动。 原位修复与异位修复相比，异位修复是将污染物土壤挖走和运走，对土壤 结构影响很大，成本高，且不易治理深度污染物。 ( 3 ) 植物修复法【16 】：在污染的土壤上栽种对污染物吸收力高、耐受性强的 植物，应用植物的生长吸收以及根区修复机理从土壤中去除污染物或是将污染 物予以固定。有些植物( 如杨树、梧桐) 能够分泌特殊的酶，分解有毒的有害有 机组分，然后吸收，通过芳环断裂，环上的含碳碎片被结合进入新的植物纤维 【l7 1 。此外某些植物与微生物还存在联合作用，植物根部分泌的物质能够加快微 生物对石油污染的降解，这种增强作用主要表现在芳香烃和饱和烃上。 1 2 2 影响生物修复的主要因素 由于微生物降解依靠的是特定菌类的生理过程，所以相对于物理和化学方 法处理而言，它受环境因素影响的程度更大。石油烃的生物降解程度的影响因 素包括油的性质和浓度、微生物的种类和数量及其它因素。如供氧量、温度、 p h 、湿度、土壤物理化学条件、外源性物质1 18 j 等。在实际的治理过程中，只有 对这些因素加以控制，才能获得更好的治理效果。 1 2 2 1 污染物的性质和浓度 一般地，在污染物的降解过程中，微生物倾向于优先选择天然存在的有机 物，而后选择其他有机污染物。而且并不是每一种微生物对所有的有机污染物 具有选择性。这就是说，不同的污染物种类需要有不同甚至是专门的微生物种 类来对付，这表明了微生物在污染物降解和转化过程中的专一性。即使如此， 由于污染物的部分降解可产生有害的副产物，或称之为中间代谢物，当有害的 副产物形成时，就会影响这些微生物对原有污染物进一步降解的作用过程。 在石油污染物中包括烃类与非烃类两部分，石油烃类化合物组成成分的差 异影响生物降解。石油烃类的化学组成分为四大类：饱和烃、芳香族烃类化合 物、沥青质、胶质。它们的结构与排列决定了其在环境中的稳定性及生物可降 解性。一般认为，微生物能够降解石油中的饱和烃和芳香烃组分，而其中的高 分子重质芳香烃，树脂和沥青质则难以降解【1 9 】。直链烷烃最易降解，由于“空 一间效应”支链烷烃比直链烷烃难降解【2 ，多环芳烃比单环或双环芳烃以及非取 代烃类难降解，有烷基取代的芳香烃不易降解，并且取代越多，分子量越大越 不易降解1 2 1 | 。其次，污染物的疏水性与土壤颗粒的吸附以及微孔排斥都会影响 污染物的生物可利用性，低水溶性的物质形成独立的非水相，微生物不能够直 接利用，而且这种非水相的污染物容易产生生物毒害作用。疏水性的物质容易 第一章文献综述 被土壤吸附，目前的研究表明，被吸附的污染物通常很难被微生物降解 2 2 1 。因 此当解吸所需要的时间超过生物降解所需要的时间时，解吸速率就变成为整个 过程的限制步骤。 污染物的浓度变化会影响微生物的活性，土壤中石油烃浓度适宜时有利于 降烃微生物的繁殖，石油污染物的浓度是影响土壤中石油烃类降解关键的因素 之一。当油浓度过高时会抑制微生物的活性，对微生物产生毒性，毒性作用的 产生将阻止、减缓代谢反应的速度，阻止刺激污染物迅速移动及新生物量的快 速生长。d i b b l e 等【2 3 j 报道，当向土壤中添加油泥使土壤中烃浓度达到1 2 5 5 时，土壤的呼吸强度增大，当烃浓度达到l o 时，土壤的呼吸强度不再增大， 当烃浓度达到1 5 时，土壤的呼吸强度下降，表明油浓度太高会抑制微生物的 活性。j e n s o n 等1 2 4 】研究了含油废弃物与土壤的质量百分比在o 3 0 时，油的浓 度对生物降解活性的影响，发现浓度为5 时，0 2 的吸收率最高，这与d i b b l e 等 的研究结果一致。但当污染物的浓度降低到一定水平时，微生物的降解作用就 会停止，这时微生物就无法进一步将污染物去除。 1 2 2 2 微生物的种类和数量 土壤中石油污染物的降解除了与以上的条件有关外，还有一个非常重要的 因素是微生物种类。土壤中的微生物种类繁多，数量巨大，很多受污染地点本 身就存在具有降解能力的微生物种群，或者在长时间和污染物接触后，土著微 生物能够适应环境的改变而进行选择性的富集和遗传改变产生降解作用。土著 微生物对当地环境适应性好，具有较大的降解潜力，目前已在大多数生物修复 工程中得到应用。但是土著微生物存在着生长速度慢，代谢活性低的弱点。在 一些受高浓度生物外援性物质污染的场所或者当地条件不适合降解菌大量生长 时，需要接种高效菌。降解石油的微生物种类很多，主要有细菌、放线菌、酵 母菌和霉菌。细菌中的棒状杆菌，分支杆菌，和短杆菌对石油降解作用很大。 节核细菌属和棒双状杆菌诸如棒状杆菌属、短杆菌属和分支杆菌属对油污染的 降解有正相关性。 土壤中石油污染物的生物降解量与土壤中可降解菌的数量有密切关系。一 般认为微生物种群密度大于1 0 0 0 个g 干土时最有效1 2 5 1 。接种外来的降解菌，一 方面要经受当地环境的考验，另方面还存在与土著微生物的竞争，因此需要 大量接种微生物以形成优势。可直接从污染场地的土壤中培养、驯化、分离和 筛选高效降解菌，在最佳条件下培养，富集强化后再接种到受污染土壤中，从 而迅速启动生物降解的过程。 1 2 2 3 其它因素 ( 1 ) 供氧量 第一章文献综述 氧对大多数有机物的生物降解都十分重要，对石油烃类化合物尤为如此。 石油烃发生氧化降解的起始步骤是其基质被生物氧化酶氧化，这时必须有0 2 参 与。好氧性微生物在降解烃的过程中将l m g 烃完全转化为c 0 2 和h 2 0 需 3 4 m 9 0 2 1 2 6 】。另一方面，氧是组成细胞的主要元素，细菌、酵母菌、霉菌( 根 茵) 的细胞干物质含氧量分别为3 0 5 2 、3 1 1 、4 0 1 6 ，尤其是在石油烃微生 物降解过程中需要有分子态的氧作为呼吸链电子传递系统末端的电子受体，同 时氧还直接参与一些生物反应。在降解过程中，生物将氢从与之结合的碳中移 去，然后在生化反应中用氧去氧化它，同时放出能量以维持微生物的生长、合 成反应使用。这种生物转化作用在有氧环境中通常以分子氧为电子受体，称为 有氧呼吸；在厌氧条件下通常以n 0 3 、n 0 2 、s 0 4 2 等为电子受体，称为厌氧呼 吸。石油降解菌主要是好氧微生物，由此可见，适当且充足的电子受体氧对石 油烃的微生物降解有着重要作用【2 7 ”】。 ( 2 ) 温度 温度是石油污染土壤生物修复的制约因素之一。温度以两种方式影响油的 生物降解效率。一是影响石油烃降解菌的生长速度，氧化污染物的酶的活性和 微生物的种群构成；二是影响油的物理状态和化学组成。 ( 3 ) 土壤的p h 土壤p h 的变化也影响微生物的活性。绝大多数的微生物生长p h 范围在6 8 之间，中性最为适宜。然而实际的土壤中，偏酸性或偏碱性的情况并不少见。 从资料来看我国土壤p h 值大多在4 5 8 5 范围内，并且呈东南酸西北碱的规律 口。在实际土壤环境修复过程中，可通过调整土壤p h 值来提高生物降解的速 率。常用的方法有添加酸碱缓冲液或中性调节剂等。 ( 4 ) 土壤的含水率 微生物完成代谢转化需要为它们的生长和活性提供足够的水分。含水率低 的土壤，不但营养物质和污染物的传质速度低，而且对依赖水流作用力进行迁 移的单细胞微生物的活性造成不利的影响，含水量过高会使有效毛细孔隙空间 被水充满，妨碍空气的供应。土壤持水量为5 0 7 0 时，油的降解速率最大。 一般认为土壤湿度的目标值为3 0 5 0 ，2 5 8 5 的持水量有利于生物修复的 实施【3 1 1 。 ( 5 ) 营养元素 石油污染物含有大量的碳和氢，是微生物可以利用的大量底物，同时土壤 中存在各种无机盐，基本可以保证降解过程中石油细菌对碳、氢以及各种微量 元素的需求【l3 1 。但它只能够提供有机碳而不能提供其他营养物，因而氮、磷元 素的缺乏是影响细菌生长繁殖的主要原因1 32 1 。适当的添加外源营养物具有重要 第一章文献综述 的作用。但营养物的添加还要按一定的比例，这与微生物的特性有关。d i b b l e 和b a n h a 【2 3 】的研究表明，c ：n 为6 0 ：1 ，c ：p 为8 0 0 ：l ，c ：k 为4 0 0 ：1 时生物降解率 最高。有的文献中则认为当添加营养物的c ：n ：p = 1 0 0 ：1 0 ：1 时效果最佳。单加n 或p 均不能提高降解率。总之，添加氮磷对土壤中污染物的生物降解的影响是 复杂的，需要进行更系统的研究。 ( 7 ) 共代谢作用 共代谢是指当培养基中存在一种或多种用于生长的不同烃类时，微生物对 作为辅助底物的、非用以生长的烃类的氧化作用。即有的烃类单独存在时不能 降解，但在石油混合物中则由于微生物利用其他烃类生长而使该难降解烃在酶 作用下降解。提供共代谢底物，形成生长底物和非生长底物共酶将有利于难降 解污染物的去除。因此，石油混合物为其氧化作用提供了良好的化学环境，许 多复杂的分支烃及环状烃多借此途径得以从环境中除去。利用微生物的共代谢 作用进行生物修复环境中的有机物是一条非常有效的途径。 ( 8 ) 表面活性剂 石油类污染物绝大多数组分是亲油疏水物质，而微生物降解油类物质主要 是通过分泌胞内酶来实现其降解能力，油的转移率是生物降解过程中的控速步 骤，表面活性剂具有增溶、乳化、分配烃类化合物在不同相中的比例作用，因 此提高了油的转移率，必然大大提高生物降解率。目前表面活性剂已用于煤焦 油、石油烃和石蜡等污染的生物修复中口引。 1 3 生物固定化方法 1 3 1 微生物固定化技术的概念 微生物固定化技术是2 0 世纪6 0 年代由生物化工中的固定化酶技术发展起来 的生物技术口4 | 。它是生物工程中的一项新兴技术，是利用物理或化学手段将微 生物限制或定位于限定的空间区域，使之成为水不溶性，但仍能保留生物活性 且在适宜的条件下还可以增殖的技术。2 0 世纪7 0 年代，微生物固定化技术开始 应用于工业废水的生物处理，与传统的悬浮生物处理法相比，它具有提高反应 器内微生物细胞浓度、保持高效菌种、污泥产量少，反应器中固液分离容易等 优点【35 1 ，因此具有广阔的应用前景。 1 3 2 微生物固定化技术的分类 目前，用于制备固定化微生物的方法种类繁多，新方法也层出不穷。加之 第一章文献综述 不同的研究者采用不同的分类方法，因此很难对此做出精确的分类。国内外还 没有统一的分类标准。但一般将微生物固定化方法分为载体结合法、交联法、 系统截流法、载体分隔法【3 6 】。 1 3 2 1 载体结合法 载体结合法是基于生物催化剂与载体之间通过物理吸附、离子结合、共价 结合及生物特异性吸附等作用将生物催化剂固定在不溶性载体上。 1 3 2 2 交联法 交联法又称无载体固定化法，该法不利用载体，而是生物催化剂之间依靠 物理或化学的作用相互结合。 压硒垂巫习 泵活匝芬丽习 厂j ；_ _ l 压砸圃 垂匿 暖堑蛔压堑圈 图1 - 1 微生物固定化方法分类 f i g 1 1t h em e t h o d so f m i c r o o r g a n i s mi r l l m o b i i i z a t i o n 1 3 2 3 系统截留法 系统截留法利用半透膜( 如渗析膜、超透膜，反渗透膜、中空纤维膜等) 将 生物催化剂以可溶性形式限定在一定的空间范围内或将过滤、离心、沉淀后的 生物催化剂返回到生物反应器中循环使用。 1 3 2 4 载体分隔法 载体分隔法是指依靠载体对生物催化剂的物理阻挡来实现生物催化剂的固 定化，包括包埋法和微胶囊法。包埋固定化是使微生物细胞包埋在半透明的聚 合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部：小分子底物及反应 代谢产物可自由出入这些多孔或凝胶膜，而微生物细胞却不能移动。 第一章文献综述 1 3 3 微生物固定化方法的比较 尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法。目前常 用的固定化方法为：包埋法、交联法、共价结合法、吸附法等。各种固定化方 法比较总结见表1 1 所利3 6 】： 各种固定化方法各有千秋，适用于某一菌体的固定化方法不一定适用于其 他菌体，所以对于固定化方法的评价目前还没有统一的客观标准，因而各研究 结果之间难以相互比较。因此目前的状况是：各研究者根据自己所选择的菌种 和使用情况，进行固定化方法、固定化载体及条件的选择与改进。 表1 1 固定化方法的比较 ! 垒! ! 呈! ：! 竺2 巴e 呈! i 1 2 旦2 1 垒! 垡! ! 呈翌! ! 尘巴2 q i ! i 翌生2 翌竺呈尘2 璺! 性能交联法吸附法共价结合法包埋法 1 3 4 微生物固定化载体 应用于微生物固定化的载体应具有对微生物无毒、抗微生物分解、机械强 度高、传质性能好、价格低廉等优点。目前固定化细胞技术中所使用的载体材 料主要分为三大类：无机载体、有机高分子载体和复合载体【37 1 。 载体是细胞固定化包埋技术的关键。因此，理想的细胞固定化载体应该具 备的条件是：( 1 ) 对生物无毒：( 2 ) 性质稳定，不易被微生物分解，并能耐受由于 生物繁殖引起的破裂：( 3 ) 传质性能良好、透气性和透光性良好；( 4 ) 强度高，寿 命长；( 5 ) 固定化操作简单；( 6 ) 对其他生物的吸附小；( 7 ) 价格低廉等。 开发筛选理想的固定化微生物载体是固定化微生物技术能否投入实用的关 键【3 8 4 0 1 。 1 3 4 1 无机载体 第一章文献综述 无机载体如多孔陶珠、红砖碎粒、砂粒、活性炭等，具有机械强度大、对 微生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性，因而是 一类重要的载体材料。 无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效 应，从而把微生物固定。无机载体内部有较大的孔隙度，可以容纳不断增殖的 微生物，使得载体内细胞浓度增大，提高了处理效率。无机载体的固定化方法 简单易行，只需把载体放入含有微生物一定浓度的溶液中，固定一段时间( 一般 为2 4 h 左右) 即可，且载体可再生。 1 3 4 2 有机高分子载体 有机高分子载体材料又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载 体。天然高分子载体材料一般对生物无毒性，传质性能好，但强度较低，在厌 氧条件下易被微生物分解，寿命短。常见的有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钙、甲 壳素等。合成有机高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细 胞固定化时对细胞活性有影响。常见的此类载体有聚丙烯酞胺、聚乙烯醇 ( p v a ) 、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。 1 3 4 3 复合载体 由于有机和无机载体材料各有优缺点，而两类材料在许多性能方面互补， 因此，可将这两类载体材料结合，组成复合载体材料，以改进材料的性能。 1 4 表面活性剂在石油污染土壤生物修复中的应用 表面活性剂是具有表面活性的物质，其表面活性是由于表面活性剂分子具 有亲水亲油两相结构，即分子中包含亲水基团和疏水基团f 4 l ，4 引。表面活性剂亲 水基团与水分子作用强，使表面活性剂分子能够进入水相；疏水基团与水分子 相排斥，与非极性或弱极性分子之间的相互作用较强，能使表面活性剂分子进 入油相或疏水相。由于具有亲水亲油双重特性，表面活性剂分子能存在于气 水、油水和固液界面上，易在界面吸附并定向排列于物质表面，能降低界面 张力，具有渗透、湿润、乳化、分散、增溶、发泡、洗涤、杀菌、润滑、柔 软、抗静电、防腐、防锈等性能。很多石油烃类污染物可强烈地吸附于土壤 上，不易降解。表面活性剂能促进解吸和溶解，提高生物可利用性，提高微生 物的除油效果。己有实验证明，化学表面活性剂对土壤中的芳香族化合物有很 好的去除效果，这是因为微生物对污染物的生物降解主要是通过微生物酶的作 用来进行的，许多酶并不是胞外酶，污染物只有同微生物细胞接触，才能被微 生物利用并降解，表面活性剂可以增加污染物与微生物细胞接触的几率。 第一章文献综述 1 4 1 表面活性剂的种类 表面活性剂的亲水基团与水的吸引作用而进入水相，亲油基团则与水存在 排斥作用，通常进入油相或疏水相。表面活性剂的亲油基团对其化学性质的影 响明显小于亲水基团，因此，通常根据表面活性剂亲水基团带电荷的性质分类 为阴离子型( 带负电荷) 、阳离子型( 带正电荷) 、两性型( 既带正电荷又带负 电荷) 和非离子型( 基本不带电荷) 。 1 4 2 表面活性剂的增溶作用 增溶作用是表面活性剂增效修复技术的基础，当表面活性剂用于土壤有机 污染修复时，大量的表面活性剂胶束存在于液相中，胶束对有机污染物的增溶 作用增大了其在液相中的溶解度，从而有效地去除土壤中的吸附态有机污染 物。 不同种类和结构的表面活性剂对有机污染物的增溶能力不同。国外对表面 活性剂增溶疏水性有机污染物进行了大量的研究【4 9 1 ，国内相关研究报道相对 较少【5 m ” 。表面活性剂对疏水性有机污染物的增溶作用受其种类和浓度、胶束 的结构、有机物性质、表面活性剂亲水亲油平衡值、无机电解质、环境温度、 共存有机物等因素的影响。具有相同疏水基团的表面活性剂对烃类和极性有机 污染物的增溶顺序为：非离子表面活性剂 阳离子表面活性剂 阴离子表面活性 剂。在同系的表面活性剂中，碳氢链越长，其胶束行为出现的浓度越小，增溶 能力越强。对于聚氧乙烯型非离子表面活性剂，聚氧乙烯链越长，增溶能力越 弱。 1 4 3 表面活性剂的毒性 在污染土壤生物修复中，表面活性剂的毒性及其降解代谢产物的毒性是考 虑和选择表面活性剂的一个重要标准。在污染土壤的洗涤中，由于表面活性剂 大范围的使用，其毒性和其代谢产物的毒性必须首先被检验。对于不同离子类 型的表面活性而言，阳离子表面活性剂的毒性最大，其次为阴离子和非离子表 面活性剂。但由于环境条件和生物因素的复杂性，即使相同浓度的同种表面活 性剂对土壤微生物的生长影响的程度也不同1 5 5 】。表面活性剂对微生物毒性的影 响主要有两方面【5 6 j ：1 ) 通过与细胞膜中液态成分的相互作用使细胞膜溶解；2 ) 含有蛋白质的表面活性剂分子对生物细胞功能的改变。化学表面活性剂的毒性 被认为是因为它们能够溶解细胞酶、细胞受体和蛋白，导致细胞膜的生理功能 紊乱，或者细胞膜损伤使胞内物质外流而引起的1 57