石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法.doc

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouins固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。2、组织的包埋、切片、展片及保存： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10mm，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。 石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品 80%乙醇 15 min 95%乙醇 15 min 100%乙醇 15min 2 1/2乙醇1/2二甲苯 15 min 二甲苯透明 5-10 min 1/2二甲苯1/2石蜡 30 min 石蜡（1） 1.5hr 石蜡（2） 1.5-2.5hr 石蜡（3） 包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 二甲苯(1) 20 min 二甲苯(2) 20 min 100%乙醇 20min 95%乙醇 10 min 80%乙醇 10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在PBS中浸泡 5 min*2 0.4%Tritonx RT 10 min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗 一抗4C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h 切片在PBS中浸泡 5 min*3 DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2） 如果是增强型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s， 玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。 若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色12秒钟（或更久） 脱水85%乙醇 5 min 95%乙醇 5 min 无水乙醇 5 min 无水乙醇 5min 二甲苯(1) 10min 二甲苯(2) 10min 中性树胶封片，室温干燥保存4、石蜡组织切片的免疫荧光方法： 密封保存于RT的组织切片 二甲苯(1) 20 min 二甲苯(2) 20 min 100%乙醇 20min 95%乙醇 10 min 80%乙醇 10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在PBS中浸泡 5 min*2 0.4%Tritonx RT 10 min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 切片在PBS中浸泡 5 min*3 0.25%胰酶 RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗 一抗4C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3 荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1