方法学验证方案.doc

*药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 1 页 共 15 页 *含量测定含量测定 方法学确认方案方法学确认方案 日期：2016 年 1 月 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 2 页 共 15 页 验证方案审查与批准验证方案审查与批准 您下面的签字表明您已审阅此份验证方案并同意实施。您下面的签字表明您已审阅此份验证方案并同意实施。 姓姓 名名职职 务务签签 名名日日 期期 起草人 姓姓 名名职职 务务签签 名名日日 期期 审核人 审核人 姓姓 名名职职 务务签签 名名日日 期期 批准人 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 3 页 共 15 页 目目 录录 1.目的.4 2.范围.4 3.验证机构与职责.4 4.定义.4 5.参考文件.5 6.风险因素分析.5 7.验证准备.5 8.检测方法的描述.5 9.验证实施.6 10. 偏差与变更 .8 11. 确认结果评定与结论 .9 12. 确认周期 .9 13. 附录目录 .9 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 4 页 共 15 页 1 1 目的目的 对苦参膜中的含量测定检测方法进行确认，确保方法的可行性，以便为有效控制苦参 膜的含量提供依据。 2 2 范围范围 本方案适用于本方案适用于*药业股份有限公司齐墩果酸片含量测定方法的确认。药业股份有限公司齐墩果酸片含量测定方法的确认。 3 3 验证机构与职责验证机构与职责 3.1验证小组成员 姓 名所在部门在验证中担任职务签名日期 组长 组员 组员 3.2 职责 3.2.1 验证小组组长职责 3.2.1.1保证确认方案及各种检查表的起草。 3.2.1.2保证在执行前完成对确认方案及各种检查表的审核和批准。 3.2.1.3负责对确认小组成员进行本方案的培训。 3.2.1.4保证完全按照确认方案实施。 3.2.1.5确保能及时发现偏差，并按照已经达成一致的偏差处理方法对其进行记录、纠正、 调查和最终确认。 3.2.1.6确保确认报告的生成、审核和批准。 3.2.2 QA 职责 3.2.2.1执行前完成对确认方案及各种检查表的审核。 3.2.2.2负责确认过程的监控和检查，保证确认方案的实施，参与确认结果评价。 3.2.2.3参与确认偏差的调查、处理、和评估。 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 5 页 共 15 页 3.2.2.4确认过程中，如有变更，保证按变更处理程序执行。 3.2.3 其它成员职责 3.2.3.1执行前确认确认方案已批准，并经过培训。 3.2.3.2按确认方案实施确认，收集、整理确认数据，完成确认记录和报告。 3.2.3.3参与确认偏差的调查和处理，确认通过偏差修订和解决方案。 3.2.3.4确认确认过程中的变更在实施前已经批准。 4 4 定义定义 4.1 线性：指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 4.2 准确度：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%） 表示。 4.3 重复性：再规定范围内，取同一浓度的供试品，用 6 个测定结果进行评价。 4.4 中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员或用不同设备测定结果之间 的精密度， 称为中间精密度。 5 5 参考文件参考文件 5.1 药品生产质量管理规范（2010 年修订版） 5.2 药品生产验证指南 5.3 中国药典（2015 年版）二部 5.4国家药品监督管理局国家药品标准 5.5 公司相关文件： 5.5.1 苦参膜质量标准及检验规程（） 5.5.2 验证管理（） 5.5.3 变更控制操作规程（） 5.5.4 偏差处理操作程序（） 5.5.5 纠正措施与预防措施操作规程（） 5.5.6 2016 年度验证总计划 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 6 页 共 15 页 6 6 风险因素分析风险因素分析 风险评估将采用失效模式及影响（FMEA）的工具来评估和衡量方法参数失效后对产品 分析结果的影响。评估过程将参照公司质量风险管理的要求，风险等级为低、中、高级别 的必须给出合理的建议措施，之后再次对建议的风险控制措施进行评估以确保风险的降低， 分析、评估结果见附录 1风险评估表。 7 7 验证准备验证准备 7.1 确保所有方法 SOP 是最新版本且经过批准，将检查结果记录在附录 2文件检查 内。 7.2 确认参与验证的人员都经过此方案和相关 SOP 的培训，和识别所有签字和草签本方 案任何数据表的人员。将检查结果记录在附录 3培训检查和签名确认内。 7.3 确认验证过程中用到设备、计量仪器都是经过校验，并在有效期内，将检查结果记录 在附录 4确认用仪器/仪表校准检查内。 8 8 检测方法的描述检测方法的描述 8.18.1 药品与试剂的准备药品与试剂的准备 *对照品（中国药品生物制品检定院提供），*（为*药业股份有限公司生产） ；硅钨酸试液、碘化汞钾试液、苦味酸、氯仿、甲醇、浓氨、稀碘化铋钾试液、盐酸液 （0.2mol/L）、氢氧化钠液（1mol/L）、氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）、硫酸滴定液 （0.05mol/L）、甲基红示液、磷酸、乙腈、无水乙醇。 8.28.2 仪器分析条件仪器分析条件 电子天平（FA2014）、超声池（KQ-300DE）、电热恒温水浴锅（DK-98-1）、高效液 相（LC-10ATVP) 8.38.3 检测方法检测方法 显色鉴别、色谱鉴别、酸碱滴定法、高效液相色谱法 8.48.4 检测操作检测操作 8.4.18.4.1 鉴别鉴别 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 7 页 共 15 页 8.4.1.18.4.1.1 显色鉴别显色鉴别：样品连续三批，A、B 两位组员各取样品 1 号、样品 2 号约 0.15g，分 置三支试管中，加水 2ml 使溶解，分别加硅钨酸试液、碘化汞钾试液及苦味酸试液 12 滴， 分别生成白色、淡黄色及黄色沉淀。 8.4.1.28.4.1.2 薄层鉴别：薄层鉴别：样品连续三批，A、B 两位组员分别取本品 0.1g，加甲醇 10ml 使溶解， 超声提取 15 分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；另取苦参碱及氧化苦参碱对照品适量， 加甲醇制成每 1ml 中各含 5mg 的溶液作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录 B）试验， 取上述三种溶液各 23l，分别点于同一以 0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G 薄层 板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（5:0.6:0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘 化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点。 8.4.8.4.2.32.3 酸碱滴定法：酸碱滴定法：连续三批样品，两位组员分别取样品 1、样品 2，各 10 片，剪碎， 取一片重两份，各精密称定，加氯仿 25ml 回流 3 次，每次 1 小时，合并提取液，置水浴上 挥干，残渣用 0.2mol/L 盐酸液 5ml 使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水 10ml 分次 洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约 6g 与 1mol/L 氢氧化钠液 5ml,摇匀，用三氯 甲烷振摇提取 5 次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液 5ml 振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠 1g 的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液， 精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml 及新沸过的冷水 20ml，振摇提取后，分取酸层，氯 仿层再用新沸过的冷水洗涤 3 次，每次 10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残 留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液 2 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。 每 1ml 的硫酸液（0.05mol/L）相当于 26.44mg 的 C15H24N2O2。 本品每片含总生物碱以*80.0%110.0%。相对偏差（dr%）不得超过 0.6% 计算公式： 0 0 4 3 2 2 1 1 0 0 100 100 M mT C C V C C V C C1：硫酸滴定液的实际浓度（mol/L)； C2：硫酸滴定液的理论浓度（mol/L)； C3：氢氧化钠滴定液的实际浓度（mol/L)； C4：氢氧化钠滴定液的理论浓度（mol/L)； *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 8 页 共 15 页 V1：加入硫酸滴定液的体积（ml)； V2：消耗氢氧化钠滴定液的体积(ml)； T ：标示量（26.44mg)； ：该批 20 片苦参膜的平均重量(g)；m M ：使用苦参膜的量（g)。 8.4.28.4.2 .4.4 高效液相色谱法高效液相色谱法 8.4.2.4.1 色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合硅胶为填充剂：以乙腈-无水乙醇-3% 磷 酸溶液（85:7.5:7.5）为流动相；柱温 30，检测波长为 220nm，流速 1.0mlmin，理论 塔板数按氧化苦参碱峰计算，应不低于 5000。 6.2.2 对照品溶液的制备： 取*对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加乙腈-无 水乙醇（85:15）制成每 1ml 含苦参碱 0.32mg 和氧化苦参碱 35g 的溶液，摇匀，即得。 8.4.2.2 供试品溶液的制备： 取已剪碎的样品约 0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓 氨水 0.5ml，精密加入三氯甲烷 25ml，称定重量，超声处理 30 分钟，放冷，加三氯甲烷补 足损失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶 至 25ml 量瓶中，摇匀，用 0.45m 滤膜滤过，即得。 6.2.4 测定法： 分别精密吸取对照品溶液 5l 与供试品溶液 510l，注入高效液相 色谱仪，测定，即得。 本品每片含*不得少于 22.0 mg。相对标准偏差不得过 2%。 计算公式: 2 21AA A 样品平均片重稀释倍数 样品称量对照品平均峰面积 对照品浓度样品峰面积 gmgC/ : 对照品进两针的平均峰面积；A : 对照品第一针峰面积；1A : 对照品第二针峰面积。2A *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 9 页 共 15 页 9 9 验证实施验证实施 9.19.1 线性实验线性实验 目的：在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度应符合规定。 9.1.19.1.1 滴定法滴定法 9.1.1.1 实验过程 同一人同时取同一批样品，各 10 片，剪碎，取一片重样品 1、样品 2、样品 3、样品 4、样 品 5，各精密称定，加氯仿 25ml 回流 3 次，每次 1 小时，合并提取液，置水浴上挥干，残 渣用 0.2mol/L 盐酸液 5ml 使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水 10ml 分次洗涤容器， 洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约 6g 与 1mol/L 氢氧化钠液 5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提 取 5 次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液 5ml 振摇洗 涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠 1g 的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫 酸滴定液（0.05mol/L）10ml 及新沸过的冷水 20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用 新沸过的冷水洗涤 3 次，每次 10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯 甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液 2 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每 1ml 的硫酸液（0.05mol/L）相当于 26.44mg 的 C15H24N2O2。 本品每片含总生物碱以氧化苦参碱(C15H24N2O)计，应为标示量的 80.0%110.0%。相对 偏差（dr%）不得超过 0.6%。 9.1.1.2 以样品滴定过程中消耗氢氧化钠的体积为横坐标，以样品含量为纵坐标，绘制 回归方程。 9.1.1.3 可接受标准（相关系数 dr0.6%）。 9.1.1.4 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定线性实验记录内，见附录。 9.1.29.1.2 高效液相高效液相 9.1.2.1 对照品配制：取*一瓶精密称取置 25ml 容量瓶中、*对照品两瓶精密称取置 50ml 量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）溶解至刻度。分别精密量取氧化苦参碱 0.5ml、 苦参碱 5ml；氧化苦参碱 1ml、苦参碱 10ml；氧化苦参碱 2ml、苦参碱 20ml，分别置 25ml 容量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）至刻度。既得。 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 10 页 共 15 页 9.1.2.2 样品制备：取已剪碎的样品约 0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水 0.5ml，精密加入三氯甲烷 25ml，称定重量，超声处理 30 分钟，放冷，加三氯甲烷补足损 失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至 25ml 量瓶中，摇匀，用 0.45m 滤膜滤过，即得。 9.1.2.3 测定法： 分别精密吸取对照品溶液 5l 与供试品溶液 510l，注入高效液相 色谱仪，测定，即得。本品每片*，不得少于 22.0 mg。 9.1.2.4 以对照品的吸取量（峰面积）为横坐标，以样品含量（峰面积）为纵坐标，绘 制回归方程 9.1.2.5 可接受标准（相关系数 RSD2%）。 9.1.2.6 记录：将实验结果记录在*高效含量测定线性实验记录内，见附录 5。 9.29.2 重复性实验重复性实验 目的：在规定范围内，取同一批次的样品品，用 5 个测定结果进行评价，得到的结果 RSD 应符合要求。 9.2.19.2.1 滴定法：滴定法： 9.2.1.1 实验过程 取同一批样品，10 片，剪碎，取一片重样品 1、样品 2、样品 3、样品 4、样品 5 各精密称 定，加氯仿 25ml 回流 3 次，每次 1 小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用 0.2mol/L 盐酸液 5ml 使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水 10ml 分次洗涤容器，洗液并入分液 漏斗中，加氯化钠约 6g 与 1mol/L 氢氧化钠液 5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取 5 次 （25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液 5ml 振摇洗涤，再 依次分别通过同一装有无水硫酸钠 1g 的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定 液（0.05mol/L）10ml 及新沸过的冷水 20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过 的冷水洗涤 3 次，每次 10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷， 放冷至室温，加甲基红指示液 2 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每 1ml 的硫酸 液（0.05mol/L）相当于 26.44mg 的 C15H24N2O2。 本品每片含总生物碱以*80.0%110.0%。相对偏差（dr%）不得超过 0.6%。 9.1.1.2 可接受标准（相关系数 dr0.6%）。 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 11 页 共 15 页 9.1.1.3 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定重复性实验记录内，见附录 5。 9.2.29.2.2 高效高效 9.2.2 实验过程 9.1.2.1 对照品配制：对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同 一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每 1ml 含苦参碱 0.32mg 和氧化苦参碱 35g 的 溶液，摇匀，即得。 9.1.2.2 样品制备：取同一批样品 10 片，剪碎并分别取样品 1、样品 2、样品 3、样品 4、 样品 5 约 0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水 0.5ml，精密加入三氯甲烷 25ml， 称定重量，超声处理 30 分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至 25ml 量瓶中，摇匀，用 0.45m 滤 膜滤过，即得。 9.1.2.3 测定法： 分别精密吸取对照品溶液 5l 与供试品溶液 510l，注入高效液相 色谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱(C15H24N2O)与氧化苦参碱 （C15H24N2O2）的总量计，不得少于 22.0 mg。 9.1.2.4 可接受标准（相关系数 RSD2%）。 9.1.2.5 记录：将实验结果记录在*高效含量测定重复性实验记录内，见附录 5。 9.39.3 中间精密度实验中间精密度实验 9.3.1 目的：含量测定中，一个实验室内不同的人、在不同时间（通常是不同天）测定得 到的结果 RSD 应符合要求。 9.3.19.3.1 滴定含量滴定含量 9.3.1.1 实验过程 9.3.1.2 两名实验人员分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜 10 片，精密 称定，剪碎，各精密称取本品 3 份（每份约 0.6g），加氯仿 25ml 回流 3 次，每次 1 小时， 合并提取液，置水浴上挥干，残渣用 0.2mol/L 盐酸液 5ml 使溶解，滤过，滤液置入分液漏 斗中，用水 10ml 分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约 6g 与 1mol/L 氢氧化钠 液 5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取 5 次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液 均用同一饱和氯化钠液 5ml 振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠 1g 的脱脂棉层 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 12 页 共 15 页 滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml 及新沸过的冷水 20ml，振 摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤 3 次，每次 10ml，合并酸液与洗涤液， 置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液 2 滴，用氢氧化钠滴 定液（0.1mol/L）滴定。每 1ml 的硫酸液（0.05mol/L）相当于 26.44mg 的 C15H24N2O2。 9.3.1.3 可接受标准（同一人实验结果 RSD%2.0%；两人间的 RSD%2.0%） 9.3.1.4 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定中间精密实验记录内，见附录 5。 9.3.29.3.2 高效高效 9.3.2.1 两名实验人员用同一批对照品分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦 参膜 10 片，精密称定，剪碎，各精密称取本品 3 份（每份约 0.6g），置具塞锥形瓶中， 加浓氨水 0.5ml，精密加入三氯甲烷 25ml，称定重量，超声处理 30 分钟，放冷，加三氯甲 烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液 5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15） 定溶至 25ml 量瓶中，摇匀，用 0.45m 滤膜滤过，即得。 9.3.2.2 测定法： 分别精密吸取对照品溶液 5l 与供试品溶液 510l，注入高效液相 色谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱(C15H24N2O)与氧化苦参碱 （C15H24N2O2）的总量计，不得少于 22.0 mg。 9.3.2.3 可接受标准（同一人实验结果 RSD%2.0%；两人间的 RSD%2.0%）。 9.3.2.4 记录：将实验结果记录在*高效含量测定中间精密度实验记录内，见附 5。 9.49.4 含量测定准确度实验含量测定准确度实验 9.4.1 目的：含量测定中，用已确定的方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一 般用回收率（%）表示，得到的结果 RSD 应符合要求。 9.4.2 实验过程 精密称取同一已知含量的供试品 9 份（每份约 0.6g），分别置于圆底烧瓶中，分成三组， 分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（35g/ml）的氧化苦参碱对照品 2 ml；向第 二组的每一份供试品中加入浓度为（35g/ml）的氧化苦参碱对照品 5ml；向第三组的每 一份供试品中加入浓度为（35g/ml）的氧化苦参碱对照品 7 ml。加氯仿 25ml 回流 3 次， 每次 1 小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用 0.2mol/L 盐酸液 5ml 使溶解，滤过，滤 *药业股份有限公司企业标准 *含量测定方法学确认 第 13 页 共 15 页 液置入分液漏斗中，用水 10ml 分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约 6g 与 1mol/L 氢氧化钠液 5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取 5 次（25、20、10、10、10ml）,每次 三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液 5ml 振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸 钠 1g 的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml 及新沸过 的冷水 20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤 3 次，每次 10ml，合 并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液 2 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每 1ml 的硫酸液（0.05mol/L）相当于 26.44mg 的 C15H24N2O2。 9.4.2.1 测定法 将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。 9.4.2.2 可接受标准（实验结果回收率 98.0%102.0%）。 9.4.2.3 记录：将实验结果记录在*滴定含量测定准确度实验记录内，见附录 8。 9.4.39.4.3 高效高效 9.4.3.1 对照品制备：对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置 同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每 1ml 含苦参碱 0.32mg 和 35g 的溶液，摇 匀，即得。 9.4.3.2 供试品制备： 精密称取同一已知含量的供试品 9 份（每份约 0.6g），置具塞锥形瓶中，加浓氨水 0.5ml，精密加入三氯甲烷 25ml，称定重量，超声处理 30 分钟，放冷，加三氯甲烷补足损 失重量，滤过，精密吸取续